QuEChERS/高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法測定巧克力中的18種合成大麻素

史洪飛，徐伯芃，徐成鑫，周修齊，張呂悅，張玉曼，冶 金，劉 暢

（南京警察學(xué)院 刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210023）

合成大麻素是一類新精神活性物質(zhì)，其與四氫大麻酚類天然大麻素的作用機(jī)理相似，通過與大麻素受體結(jié)合發(fā)揮作用，且精神活性作用更強(qiáng)［1］。長期吸食合成大麻素會對大腦、肝臟、心血管系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷，引發(fā)精神錯亂等多種疾病［2-3］。合成大麻素種類較多，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征可分為天然大麻素類似物、吲哚類、吲唑類、4-氮雜吲唑類、苯并咪唑類、茚類、咔唑類、吡咯類、吡唑類［4-6］。中國裁判文書網(wǎng)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，2017 至2022 年，全國共破獲151 起合成大麻素類涉毒案件（電子煙油90起、香草煙絲58 起、膠囊藥物2 起、飲料1 起），82 份明確說明合成大麻素種類的判決文書中77 份為吲唑類合成大麻素、7 份為吲哚類合成大麻素。吲唑和吲哚類合成大麻素是目前主要的涉案類型，電子煙油和香草煙絲為主要的添加基質(zhì)，飲料、巧克力和軟糖等食品則涉案較少。近年來公安機(jī)關(guān)對含有合成大麻素的電子煙油和香草煙絲的打擊力度不斷加強(qiáng)，同時《電子煙管理辦法》的推行限制了調(diào)味電子煙和可自行添加霧化物電子煙的銷售，大大提高了通過電子煙和香草煙絲偽裝販賣毒品的風(fēng)險。巧克力等由于便于攜帶、口感較好，深受大眾喜愛，市場流通量較大，為毒品提供了良好的隱藏環(huán)境。2021～2022年國家林業(yè)局司法鑒定中心共受理6起巧克力、軟糖基質(zhì)中添加大麻素的案件。巧克力等食品可能成為未來合成大麻素添加的一類常見基質(zhì)［7-9］。

目前，檢測合成大麻素的方法主要有差分拉曼光譜法［10-12］、氣相色譜-質(zhì)譜法［8，13-19］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［20］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［21-37］、膠束毛細(xì)管電動色譜法［38］；研究的樣品基質(zhì)有食品［8，36］、電子煙油［13-15，21］、香草煙絲［18-20，32-33］、血液［23-25］、毛發(fā)［26-30］、口腔液［31］、尿液［35］。合成大麻素的提取檢測研究基質(zhì)多集中于生物檢材、電子煙油和香草煙絲，對于食品方面的研究較少。于聰聰?shù)龋?］利用甲醇直接提取基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測黑巧克力中的5種天然大麻素，該方法分析速度快，但提取液中存在較多雜質(zhì)，易對離子源造成污染，且基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)，影響定量分析的準(zhǔn)確性；唐慶強(qiáng)等［8］選擇豬肉、牛奶、橄欖油、蜂蜜、面包、茶葉、大豆、可樂飲料和啤酒為檢材，利用固相萃取法凈化、氮吹濃縮后基于氣相色譜-質(zhì)譜法對6 種合成大麻素和3 種天然大麻素進(jìn)行檢測，方法平均回收率為65.2%～117.9%；邵曼等［37］基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對巧克力、軟糖、餅干、飲料、糕點(diǎn)、白酒中的8種天然大麻素進(jìn)行檢測，選擇增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化劑（EMR-Lipid）凈化樣品，有效去除了巧克力中的脂質(zhì)和軟糖中的膠質(zhì)，并通過向提取液中添加10%的丙三醇甲醇溶液優(yōu)化了氮吹濃縮條件，有效去除了雜質(zhì)成分，方法平均回收率為89%～101%。

本文基于QuEChERS/高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法，建立了巧克力中18種吲哚類和吲唑類合成大麻素的檢測方法，并探討了實驗過程中合成大麻素同分異構(gòu)體的分辨問題，為巧克力產(chǎn)品的安全監(jiān)管及風(fēng)險防范提供了技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜級，美國 Thermo Fisher 公司）；PSA 凈化劑、C18凈化劑（40～60 μm，青島邦凱高新技術(shù)材料有限公司）；黑巧克力（市售）。

18 種合成大麻素：5F-ADBICA、4F-MDMB-BUTICA、AMB-FUBICA、5F-MDMB-PICA、5FEMB-PICA、 MDMB-FUBICA、 5F-EDMB-PICA、 ADB-FUBINACA、 ADB-BUTINACA、 ADB-4en-PINACA、4F-MMB-BUTINACA、4F-MDMB-BUTINACA、AMB-FUBINACA、5F-EMB-PINACA、5FADB、MDMB-FUBINACA、MDMB-4en-PINACA、4F-ABUTINACA（99.9%，0.1 mg/mL，均由公安部物證鑒定中心提供）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290-6545 高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀配電噴霧雙噴離子源（Dual AJS ESI，美國Agilent公司）；ME104E 電子天平（精確至0.1 mg，瑞士Mettler-Toledo 公司）；Lab Dancer渦旋振蕩儀（德國IKA公司）；Pico17微量高速離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司）；Milli-Q純水儀（美國Millipore公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：精密移取18種合成大麻素的單個標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.1 mL，置于同一10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻制成1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密移取18種合成大麻素的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用甲醇將其稀釋成質(zhì)量濃度為1、5、10、25、50、75、100、150、200 μg/L的合成大麻素系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 加標(biāo)樣品的制備

用小刀將巧克力切碎后稱取200.0 mg于2 mL 聚丙烯離心管中，分別精密移取10、20、30 μL 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于巧克力中，50 ℃超聲水浴15 min 使巧克力融化并與合成大麻素充分混合，于2 ℃冷藏凝固為塊狀，制備18種合成大麻素加標(biāo)量分別為50、100、150 μg/kg的巧克力樣品。

1.5 實驗條件

1.5.1 樣品前處理條件取離心試管中的巧克力樣品，用小刀切碎后，裝回該離心試管中，加入1 mL甲醇，渦旋振蕩2 min，在50 ℃下超聲提取10 min，再次渦旋振蕩2 min，以10 000 r/min離心3 min；取600 μL 上層清液于2 mL 微量離心管中，加入C18和PSA 凈化劑各0.05 g，渦旋振蕩3 min，以10 000 r/min離心3 min，取上層清液過0.22 μm濾膜，移至進(jìn)樣瓶中待測。

1.5.2 色譜條件色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為乙腈；進(jìn)樣量為5 μL；流速：0.4 mL/min；梯度洗脫程序：0～2.0 min，10% ～65% B；2.0～6.0 min，65% B；6.0～7.0 min，65% ～90% B；7.0～9.0 min，90% B；9.0～9.5 min，90% ～10% B；9.5～11.0 min，10% B。

1.5.3 質(zhì)譜條件離子源：Dual AJS ESI 源，正離子模式；毛細(xì)管電壓：4 000 V；誘導(dǎo)解離電壓：160 V；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：11 mL/min；干燥氣溫度：320 ℃；干燥氣流速：8 mL/min；一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集為單級質(zhì)譜全掃描模式（MS），掃描范圍為m/z100～600，采集速率為5 spectra/s。二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集為目標(biāo)離子采集模式（Target MS/MS），一級質(zhì)譜掃描范圍為m/z100～600，采集速率為1 spectra/s，二級質(zhì)譜掃描范圍為m/z50～600，采集速率為4 spectra/s。采用參比離子（C5H4N4，嘌呤，其準(zhǔn)分子離子精確質(zhì)量數(shù)為121.050 9）實時質(zhì)量校準(zhǔn)。18種合成大麻素的保留時間、母離子精確質(zhì)量數(shù)、子離子精確質(zhì)量數(shù)等見表1。

表2 18種合成大麻素的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量下限Table 2 Regression equations，linear ranges，r2，limits of detection and limits of quantitation of 18 synthetic cannabinoids

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

合成大麻素的種類較多，互為同分異構(gòu)體的合成大麻素在色譜保留和質(zhì)譜碎片方面十分相似，檢驗認(rèn)定存在一定困難。實驗通過色譜保留時間和二級質(zhì)譜碎片實現(xiàn)了5F-EMB-PICA 與5F-MDMBPICA和5F-EMB-PINACA 與5F-ADB兩對同分異構(gòu)體的區(qū)分。

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化對比了Eclipse Plus C18（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）和Eclipse Plus Phenyl-Hexyl（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）兩種色譜柱對18 種合成大麻素的分離效果。結(jié)果顯示，后者對合成大麻素的保留相對較強(qiáng)，但二者的選擇性無顯著差異，因此選擇出峰速度較快且應(yīng)用更廣泛的C18色譜柱。通過優(yōu)化流動相流速（0.3、0.35、0.4 mL/min）、流動相種類、梯度洗脫條件和柱溫箱溫度（30、40、50 ℃）成功將同分異構(gòu)體5F-EMBPICA 與5F-MDMB-PICA 分離，其保留時間分別為5.15 min 和5.32 min，另一對同分異構(gòu)體5FEMB-PINACA 與5F-ADB 在上述條件下均未實現(xiàn)分離。18 種合成大麻素的提取離子色譜圖見圖1。

圖1 18種合成大麻素的提取離子色譜圖Fig.1 Extraction ion chromatograms of the 18 synthetic cannabinoids the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化毛細(xì)管出口區(qū)域的碰撞誘導(dǎo)解離電壓對目標(biāo)化合物準(zhǔn)分子離子的響應(yīng)影響較強(qiáng)，過高或過低均不利于提升方法靈敏度。碰撞誘導(dǎo)解離電壓過高時目標(biāo)化合物易發(fā)生源內(nèi)裂解，過低時化合物準(zhǔn)分子離子的離子傳輸效率降低。本研究在MS采集模式下，考察了碎裂電壓在110～170 V范圍內(nèi)18種合成大麻素準(zhǔn)分子離子峰的響應(yīng)情況，確定最佳碰撞誘導(dǎo)解離電壓為160 V。

在Target MS/MS 采集模式下調(diào)整碰撞能量，選取響應(yīng)最強(qiáng)的子離子為定量離子，響應(yīng)較強(qiáng)的離子為定性離子。優(yōu)化碰撞能量，使定量離子的響應(yīng)達(dá)到最強(qiáng)，確定18 種合成大麻素的最佳質(zhì)譜參數(shù)如“1.5.3”所示。

2.1.3 同分異構(gòu)體的分辨通過二級質(zhì)譜碎片離子，能分辨未實現(xiàn)色譜分離的同分異構(gòu)體 5F-EMBPINACA（二級質(zhì)譜主要碎片離子為m/z233.107 5、304.181 6和332.177 0）與5F-ADB（二級質(zhì)譜主要碎片離子為m/z233.107 5、318.197 3 和346.192 1），利用Agilent MassHunter Qualitative Analysis 軟件中的精確質(zhì)量計算器，算得離子分子式分別為［C17H23FN3O］+、［C18H23FN3O2］+和［C18H25FN3O］+、［C19H25FN3O2］+，據(jù)此推斷5F-EMB-PINACA 與5F-ADB 的質(zhì)譜裂解方式見圖2A和圖2B。參照二者的質(zhì)譜裂解方式，可知另一對同分異構(gòu)體5F-EMB-PICA 與5F-MDMB-PICA 亦存在相似的質(zhì)譜裂解過程，除主要碎片離子m/z232.112 5 外，分別發(fā)現(xiàn)少量碎片離子m/z303.187 8、331.179 9 和m/z317.202 1、345.195 8，減小碰撞能，碎片離子m/z303.187 8、331.179 9 和m/z317.202 1、345.195 8 的響應(yīng)無顯著上升。利用精確質(zhì)量計算器計算，離子分子式分別為［C18H24FN2O］+、［C19H24FN2O2］+和［C19H26FN2O］+、［C20H26FN2O2］+，推斷5F-EMB-PICA 與5F-MDMB-PICA 的質(zhì)譜裂解方式見圖2C 和圖2D。兩對同分異構(gòu)體的中心母體結(jié)構(gòu)不同，實驗發(fā)現(xiàn)5F-EMB-PICA 的碎片離子m/z303.187 8、331.179 9 與5FMDMB-PICA 的碎片離子m/z317.202 1、345.195 8 穩(wěn)定性較差，更易直接生成相同的碎片離子m/z232.112 5，兩者的質(zhì)譜特征差異不明顯，可采用色譜保留時間結(jié)合二級質(zhì)譜碎片的方式進(jìn)行分辨。

圖2 4種合成大麻素的二級質(zhì)譜圖及質(zhì)譜裂解方式Fig.2 Secondary mass spectra and fragmentation pathways of the four synthetic cannabinoids

2.2 樣品提取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化分別以1 mL甲醇、乙腈、甲醇-乙腈（1∶1，體積比）、甲醇-水（1∶1，體積比）、乙腈-水（1∶1，體積比）為提取溶劑，對0.2 g 巧克力樣品于50 ℃超聲提取15 min 后振蕩提取2 min；以10 000 r/min離心3 min后取上層清液過濾膜直接進(jìn)樣。以母離子提取離子色譜圖的色譜峰面積為評價指標(biāo)確定最優(yōu)提取溶劑，結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取溶劑對巧克力中18種合成大麻素提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction solvents on the extraction effects of 18 synthetic cannabinoids in chocolate

結(jié)果顯示，除4F-ABUTINACA 外，其他合成大麻素以甲醇為提取溶劑時的提取效果較好，可能是由于4F-ABUTINACA 的甲酰胺上連接的取代基為金剛烷，使其與其他取代基為酯基和氨?；暮铣纱舐樗卦谌芙庑苑矫娲嬖谳^大差異，更適合用極性較弱的乙腈進(jìn)行提取。由于本實驗的目標(biāo)物多為酯基和氨?；惡铣纱舐樗?，因此選擇甲醇作為提取溶劑。

2.2.2 超聲提取條件的優(yōu)化巧克力中可可脂的熔點(diǎn)約為34～38 ℃，因此選擇超聲溫度為50 ℃，以甲醇為提取溶劑分別超聲提取10、20、30 min，以母離子提取離子色譜圖的色譜峰面積為評價指標(biāo)確定最佳提取時間。結(jié)果顯示，超聲提取時間對樣品提取效果的影響較小，為縮短前處理時間、減少雜質(zhì)溶出，選擇樣品超聲提取時間為10 min。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

實驗考察了2 ℃冷藏保存12 h 后10 000 r/min 離心3 min 的方法對巧克力甲醇提取液的凈化效果，發(fā)現(xiàn)該方法能有效沉淀去除脂質(zhì)等部分雜質(zhì)，但耗時較長且無法實現(xiàn)色素成分的去除。因此實驗采用QuEChERS 前處理方法中的凈化方式，選擇PSA 和C18凈化劑對樣品中的極性和非極性雜質(zhì)進(jìn)行去除，通過提取液顏色和2 ℃冷藏保存12 h 后離心觀察是否有沉淀產(chǎn)生，判斷樣品中脂質(zhì)、糖類等成分的去除情況，結(jié)合加標(biāo)回收率確定凈化劑的添加量。結(jié)果表明，單獨(dú)添加0.01、0.02、0.05 g PSA 進(jìn)行凈化時，18 種合成大麻素的回收率分別為131%～146%、115%～127%和107%～125%；PSA 能有效去除樣品中的色素等極性成分，但無法去除脂質(zhì)等非極性成分，冷藏后溶液有部分沉淀析出。單獨(dú)添加0.01、0.02、0.05 g C18進(jìn)行凈化時，18 種合成大麻素的回收率分別為130%～142%、119%～129%和98.4%～117%；C18能有效去除樣品中的脂質(zhì)等非極性成分，冷藏后溶液澄清，但無法有效去除色素。同時添加C18和PSA 凈化劑各0.01、0.02、0.05 g 進(jìn)行凈化時，18 種合成大麻素的回收率分別為121%～134%、110%～124%和90.6%～107%；添加C18和PSA 凈化劑各0.05 g 能夠有效去除色素等極性成分和脂質(zhì)等非極性成分，且提取回收率較高。因此選擇凈化劑C18和PSA各0.05 g。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 線性及靈敏度采用本方法檢測系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以化合物的響應(yīng)為縱坐標(biāo)（y），對應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制工作曲線。18 種合成大麻素均在1～200 μg/L 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)不小于0.997 0，滿足定量分析要求。分別以3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）確定化合物的檢出限（LOD）與定量下限（LOQ），得到18種合成大麻素的檢出限和定量下限分別為0.02～0.20 μg/L和0.07～0.66 μg/L。

2.4.2 準(zhǔn)確度與精密度采用本方法對空白巧克力樣品進(jìn)行50、100、150 μg/kg 3 個水平的加標(biāo)實驗，每種樣品平行3份，每個平行樣品進(jìn)樣2次，計算方法回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。18種合成大麻素的回收率為86.2%～104%，RSD為0.070%～2.0%（見表3），表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。

表3 18種合成大麻素的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（%）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 18 synthetic cannabinoids（%）

分別對同一瓶提取液進(jìn)行6次連續(xù)進(jìn)樣，一天內(nèi)不同時間下重復(fù)實驗6次并進(jìn)樣檢測，在6 天內(nèi)由3名實驗人員重復(fù)實驗6次并進(jìn)行檢測，以檢測濃度的RSD分別表示儀器精密度（Intra-sample）、日內(nèi)方法精密度（Intra-day）和日間方法精密度（Inter-day）。如表3 所示，儀器RSD 為0.040%～2.0%，日內(nèi)方法RSD為0.32%～3.0%，日間方法RSD為1.3%～3.6%，表明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

2.5 實際樣品檢測

為驗證本方法的可靠性，參照“1.5”方法提取和檢測2份含有合成大麻素的巧克力檢材，分別檢出ADB-BUTINACA 和MDMB-FUBICA 成分，含量分別為0.51%和0.49%。

3 結(jié) 論

本文基于QuEChERS/高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜，建立了巧克力中18種合成大麻素的檢測方法。本方法有效降低了基質(zhì)效應(yīng)，使18種合成大麻素在11 min內(nèi)實現(xiàn)了分離檢測，其中兩對同分異構(gòu)體（5F-EMB-PICA 和5F-MDMB-PICA；5F-EMB-PINACA 和5F-ADB）實現(xiàn)了分辨。所建立的方法具有良好的靈敏度和穩(wěn)定性，能夠滿足巧克力中合成大麻素的定性和定量分析需要，為巧克力產(chǎn)品的安全監(jiān)管及風(fēng)險防范奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。