超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中18種生物堿及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

劉先軍，馮家力，曾 棟，陳東洋，李幫銳，張 昊，梁 靜，羅 波

（湖南省疾病預(yù)防控制中心，湖南 長(zhǎng)沙 410003）

中醫(yī)學(xué)將按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)稱為“藥食同源”物質(zhì)［1］。根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)公布的名單，約有110 種藥食同源物質(zhì)，蜂蜜是其中一種。隨著蜂蜜需求量的不斷提高，其安全問題受到廣泛關(guān)注［2］。現(xiàn)有研究主要關(guān)注蜂蜜的農(nóng)藥、獸藥殘留［3-4］或外源性摻假、摻雜［5］等，對(duì)內(nèi)源性的污染關(guān)注不多。有些植物的花蜜、花粉和種子會(huì)產(chǎn)生對(duì)人類和動(dòng)物有毒性作用的生物堿，如不僅有肝毒性，還具有遺傳毒性和致癌性的吡咯里西啶類生物堿（PAs）［6］；對(duì)血液系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)有毒副作用的雷公藤類化合物［7］；可引起興奮、痙攣等中毒癥狀的馬桑類化合物［8］；還有可引起溶血性貧血導(dǎo)致黃疸的異喹啉類化合物小檗堿［9］。這些生物堿通過污染茶葉、草藥、飼料等對(duì)人畜造成毒害［10-11］。蜜蜂采集花蜜或花粉的區(qū)域面積平均約為7 km2［12］，鑒于自然環(huán)境中植物的多樣性，該范圍內(nèi)可能存在多種含有毒生物堿的植物，因此蜂產(chǎn)品可能受到有毒生物堿的污染。目前《澳新食品標(biāo)準(zhǔn)法典》［13］關(guān)于蜂蜜中有毒生物堿的限量，僅規(guī)定了羥基馬桑毒素的限量（2 mg/kg），歐盟修訂條例（EC）No.2020/2040［14］也只設(shè)定茶葉和調(diào)味茶中的PAs 限量為150 μg/kg，尚未對(duì)蜂蜜中有毒生物堿制定限量標(biāo)準(zhǔn)。因此建立一種準(zhǔn)確、靈敏的蜂蜜中生物堿檢測(cè)方法，對(duì)評(píng)估國(guó)內(nèi)市場(chǎng)蜂蜜產(chǎn)品的健康安全風(fēng)險(xiǎn)具有一定意義。

目前主要采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)分析蜂蜜中生物堿［15-16］，該技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高，是現(xiàn)階段痕量分析的重要手段。采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)，會(huì)受到與目標(biāo)化合物同時(shí)提取的其他物質(zhì)的干擾，影響目標(biāo)化合物的離子化效率。為確保分析的準(zhǔn)確性，通常需要優(yōu)化前處理方法以降低背景干擾、減少基質(zhì)效應(yīng)，如采用液-液萃取、固相萃取（SPE）、基質(zhì)分散固相萃?。≦uEChERS）等技術(shù)。目前文獻(xiàn)中蜂蜜樣品凈化方法多采用SPE［15-17］和QuEChERS 技術(shù)［18-20］，但對(duì)有毒生物堿的檢測(cè)主要集中在PAs類［10-11，15-17，20］，雷公藤類、馬桑內(nèi)酯和異喹啉類較少檢測(cè)［12，19］，同時(shí)檢測(cè)蜂蜜中兩類以上生物堿的方法目前很少［12］。因此本實(shí)驗(yàn)選取7 種PAs 和7 種雷公藤類化合物、3 種馬桑內(nèi)酯和異喹啉類荷葉堿共18種有毒生物堿作為研究對(duì)象，采用MCX 固相萃取和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了蜂蜜中多種有毒生物堿的檢測(cè)方法，并根據(jù)實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果開展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為蜂蜜的用藥和膳食安全評(píng)估提供技術(shù)手段和科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-Xevo?- TQ-S質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；MassLynx V4.1工作站；Oasis MCX 固相萃取柱（150 mg/6 mL，美國(guó)Waters 公司）。甲醇（HPLC 級(jí)，德國(guó)Merck 公司）；甲酸（純度為99%，德國(guó)Fluka 公司）；除特別說明，其他試劑均為分析純?？耸锨Ю锕鈱帯⑶Ю锕夥屏?、蘭薊定（純度≥98%，德國(guó)Phytolab 公司），倒千里光堿、千里光寧、野百合堿、馬桑亭、馬桑寧、羥基馬桑內(nèi)酯、雷公藤次堿、雷公藤定堿、雷公藤甲素、雷公藤吉堿、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、石松胺、荷葉堿（團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室提供［12］，純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司）。40份蜂蜜樣品，購(gòu)于當(dāng)?shù)爻泻土闶鄣辍?/p>

1.2 樣品前處理

1.2.1 試樣制備稱取均質(zhì)蜂蜜樣品2.00 g 置于50 mL 聚四氟乙烯離心管中，加入15 mL 0.1%甲酸水溶液，渦旋混勻1 min，超聲提取15 min后，于4 ℃ 以10 000 r/min離心3 min。取上清液待凈化。

1.2.2 凈 化MCX 柱先用5 mL 甲醇、5 mL 水、5 mL 0.1%甲酸水溶液活化，將上述待凈化的樣品制備液過柱，棄去濾液，依次用5 mL 水和5 mL 5%甲醇水溶液淋洗，5 mL 5%氨化甲醇溶液洗脫后吹干，用1.0 mL 0.1%甲酸水溶液復(fù)溶，渦旋混合后，過 0.2 μm濾膜，供測(cè)定。

1.3 色譜分離條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLCTMBEH Phenyl柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；色譜柱溫度：40 ℃；進(jìn)樣室溫度：4 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL。流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水，B相為甲醇，流速0.3 mL/min。流動(dòng)相洗脫梯度：0～3 min，5%～15% B；3～5 min，15%～25% B；5～5.5 min，25% B；5.5～7 min，25%～62% B；7～10 min，62%～100% B；10～11 min，100% B；11～11.1 min，100%～5% B；11.1～13 min，5%B；與團(tuán)隊(duì)前期研究數(shù)據(jù)基本一致［12］。

1.4 質(zhì)譜檢測(cè)條件

離子源：電噴霧電離源（ESI+）；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓：0.5 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣流速：1 000 L/h；脫溶劑氣溫度：550 ℃；碰撞氣流速：0.12 mL/min。18種生物堿的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 18種生物堿的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Mass acquisition parameters for 18 alkaloids

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

生物堿是弱堿性物質(zhì)，在酸性溶液中易于解離提取。有文獻(xiàn)報(bào)道選擇0.05 mol/L 硫酸溶液作為提取溶劑［13］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了0.05 mol/L 硫酸溶液和0.1%甲酸水溶液作為提取溶劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響，結(jié)果顯示兩者無(wú)明顯差異，因此選擇0.1%甲酸水溶液作為提取溶劑?？疾炝颂崛∪軇w積（10、15、30 mL）對(duì)基質(zhì)提取效果的影響，結(jié)果表明，提取溶劑體積為15 mL 時(shí)目標(biāo)物的回收率高，同時(shí)能節(jié)省凈化時(shí)間。

本實(shí)驗(yàn)采用MCX 固相萃取柱對(duì)蜂蜜樣品中目標(biāo)生物堿進(jìn)行富集與凈化［13-15］，MCX 固相萃取柱的雙重保留模式（離子交換與反相保留）能在復(fù)雜基質(zhì)中最大限度地保留目標(biāo)化合物。預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)目標(biāo)生物堿的保留受到淋洗液甲醇濃度的影響，因此考察了淋洗液中甲醇濃度對(duì)目標(biāo)生物堿保留的影響。依次吸取5 mL 不同體積分?jǐn)?shù)甲醇水溶液（0%、5%、10%、25%、50%、75%和100%）洗脫已上樣的MCX柱，結(jié)果顯示甲醇體積分?jǐn)?shù)為0%、5%時(shí)，無(wú)目標(biāo)化合物流出；體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，流出物中含少量馬桑寧和羥基馬桑內(nèi)酯；體積分?jǐn)?shù)為25%時(shí)，流出物新增少量馬桑亭；體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，流出物新增雷公藤甲素；體積分?jǐn)?shù)高于75%時(shí)，流出物包含大量馬桑亭、馬桑寧、羥基馬桑內(nèi)酯、雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮和雷酚內(nèi)酯?？赡苁且?yàn)樯鲜錾飰A僅靠范德華力在反相固相萃取柱上保留，因其極性較強(qiáng)，容易被甲醇洗脫［21］。

實(shí)驗(yàn)中增加有機(jī)溶劑淋洗步驟以最大限度除去雜質(zhì)，降低基質(zhì)效應(yīng)（ME）。采用下式計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)：ME=基質(zhì)匹配溶液響應(yīng)/溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)×100%，ME=1時(shí)，表明無(wú)基質(zhì)效應(yīng)；ME ＜1，為基質(zhì)抑制效應(yīng)；ME ＞1，為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。用陰性洋槐蜂蜜樣品提取液過MCX 萃取小柱，經(jīng)5%甲醇水淋洗，氨化甲醇洗脫氮吹后復(fù)溶制備成標(biāo)準(zhǔn)曲線的稀釋溶液，使標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液的基質(zhì)相同，上機(jī)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除雷公藤內(nèi)酯酮的基質(zhì)效應(yīng)接近50%，其他17 種生物堿的基質(zhì)效應(yīng)為70%～99.8%，基本滿足食品中痕量污染物分析的要求。鑒于蜂蜜品種繁多，基質(zhì)不一，比較了常見的洋槐蜂蜜與紫云英蜂蜜基質(zhì)對(duì)目標(biāo)分析物的影響，結(jié)果顯示兩者間無(wú)明顯差異。因此本前處理方法適合蜂蜜中多種生物堿的提取和凈化。

根據(jù)以上結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用15 mL 0.1%甲酸水溶液提取，MCX 小柱凈化，5 mL 5%甲醇水溶液淋洗作為前處理?xiàng)l件。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于生物堿有含氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)，N 原子上有孤對(duì)電子，與質(zhì)子結(jié)合呈弱堿性，酸性條件下易與氫離子形成［M+H］+分子離子峰，因此本實(shí)驗(yàn)在ESI+MRM 模式下優(yōu)化各種質(zhì)譜參數(shù)，以獲得最大靈敏度?？疾炝朔聪嗌V常用的流動(dòng)相體系甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水對(duì)目標(biāo)物色譜行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)可獲得更好的響應(yīng)和峰形。此外，還比較了待測(cè)物在Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和BEH Phenyl（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱上的分離效果，發(fā)現(xiàn)雷公藤類化合物在Phenyl柱上的響應(yīng)和峰形優(yōu)于C18柱。這可能是因?yàn)镻henyl柱含有三鍵鍵合的苯己基配體，對(duì)含有芳香環(huán)的分析物具有更好的選擇性，能提供更優(yōu)異的峰形。因此選擇BEH Phenyl柱作為色譜分析柱。在優(yōu)化條件下，18種生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM圖見圖1。

圖1 18種生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的定量離子MRM圖譜Fig.1 Quantitative ion MRM chromatograms of 18 alkaloids mixed standard solution

2.3 線性范圍、檢出限與定量下限

采用陰性蜂蜜樣品按照實(shí)驗(yàn)步驟制備成標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，加入適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配成不同質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配溶液，采用本方法進(jìn)行測(cè)定。以定量離子的峰面積（y）對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度（x，μg/L）進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果顯示，所有目標(biāo)生物堿在對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.993；方法定量下限（LOQ，S/N=10）為0.05～25 μg/kg（表2）。

表2 蜂蜜中18種生物堿的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)與定量下限Table 2 Linear ranges，regression equations，r2 and limits of quantitation for 18 alkaloids in honey

2.4 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

取空白洋槐蜂蜜樣品，分別加入低、中、高3 個(gè)不同濃度水平混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按最優(yōu)條件進(jìn)行處理和測(cè)定（表3），得到18種生物堿的平均加標(biāo)回收率為77.2%～115%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不大于12%，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，可用于蜂蜜樣品的分析。

表3 蜂蜜中18種生物堿的平均加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Average recoveries and relative standard deviations of 18 alkaloids in honey（n=6）

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本方法對(duì)40 份來(lái)自不同產(chǎn)地的不同種類國(guó)產(chǎn)蜂蜜樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中3 份樣品檢出石松胺，含量分別為1.09、1.80、5.06 μg/kg；另3份樣品檢出千里光菲林，含量分別為15.1、18.3、18.7 μg/kg（圖2）。石松胺和千里光菲林均屬于PAs，該類生物堿全球分布最為廣泛，主要集中在菊科和紫草科等，全世界約有3%的有花植物（約6 000種）含有PAs［20］。這可能是PAs易在蜂蜜中檢出的原因。

圖2 蜂蜜樣品中PAs的UPLC-MS/MS色譜圖Fig.2 UPLC-MS/MS chromatograms of PAs in honey samples

歐洲藥品監(jiān)管局2016 年在關(guān)于含PAs 草藥污染的風(fēng)險(xiǎn)管理和質(zhì)量控制中給出的過渡性建議為PAs的推薦每日攝入量應(yīng)限制在0.35 μg以內(nèi)［22］。本次所測(cè)的40份蜂蜜樣品中有6份樣品檢出PAs，檢出率為15%，含量范圍為1.09 ～18.7 μg/kg，平均為10.1 μg/kg。參考我國(guó)《第五次中國(guó)總膳食研究》中北京市人均蜂蜜攝入量數(shù)據(jù)（2.72 g/人/天），則本次陽(yáng)性樣品含量未超過推薦值（0.35 μg），風(fēng)險(xiǎn)可接受；根據(jù)2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》［23］規(guī)定蜂蜜用量為15～30 g，因此陽(yáng)性樣品中平均每日攝入量為0.23 μg（按平均用量22.5 g，平均含量10.1 μg/kg 計(jì)算），最高為5.61 μg（按最大用量30 g，含量18.7 μg/kg 計(jì)算）。本次有3 份陽(yáng)性樣品含量超過該推薦值。依據(jù)我國(guó)《食品中農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指南》［24］，對(duì)蜂蜜進(jìn)行殘留量膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)采用的長(zhǎng)期膳食風(fēng)險(xiǎn)和短期膳食風(fēng)險(xiǎn)模型中推薦的長(zhǎng)期蜂蜜攝入量和短期蜂蜜攝入量（分別為40 g/人/天和100 g/人/天），則這6 份陽(yáng)性樣品中長(zhǎng)期膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)和短期膳食風(fēng)險(xiǎn)分別有3 份（含量分別為0.604、0.732、0.748 μg）和4份（含量分別為0.506、1.51、1.83、1.87 μg），其中1 份同時(shí)具有長(zhǎng)期和短期暴露風(fēng)險(xiǎn)。鑒于蜂蜜是高頻消費(fèi)的藥食同源產(chǎn)品，其低水平、長(zhǎng)期暴露的風(fēng)險(xiǎn)值得關(guān)注。

3 結(jié) 論

本研究利用0.1%甲酸水溶液提取蜂蜜樣品中的生物堿，采用MCX 固相萃取柱富集與凈化，UPLC-MS/MS 同時(shí)檢測(cè)蜂蜜中馬桑內(nèi)酯、雷公藤類、異喹啉類和吡咯里西啶類等18種生物堿，方法準(zhǔn)確度和精密度良好。采用該方法對(duì)40 份蜂蜜樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出石松胺和千里光菲林2 種吡咯里西啶類生物堿。初步風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估顯示，蜂蜜作為藥食同源產(chǎn)品，具有一定的膳食風(fēng)險(xiǎn)。