前列寧通過調(diào)控前列腺MMP-2、TIMP-2降解層粘連蛋白治療良性前列腺增生的機(jī)制研究

周建衡，趙錦燕，王雪皎，李 斐，林久茂*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122）

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）不可避免發(fā)病于中老年男性，尿路梗阻是其較為常見癥狀，而且隨年齡增加發(fā)病率逐漸增加［1］。調(diào)查顯示，該病發(fā)病率規(guī)律是每增加十歲BPH 發(fā)病率就增加10%，男性從40 歲開始，BPH 患病率隨著年齡而逐漸升高，80 歲時患病率將達(dá)到80%以上［2］。BPH 的病因及病理生理機(jī)制迄今仍不完全清楚，目前認(rèn)為間質(zhì)-上皮的相互作用與BPH 發(fā)病相關(guān)性已得到醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)可［3-4］，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在間質(zhì)-上皮相互作用中發(fā)揮至關(guān)重要作用，層粘連蛋白（laminin，LN）是ECM 重要成分之一，與BPH 有密切聯(lián)系［5-7］。前期研究表明，前列寧（Qianliening，QLN）對BPH 具有明顯治療作用［8］。本研究旨在通過體內(nèi)外實驗觀察QLN 對前列腺組織、BPH-1 細(xì)胞中LN 及LN 調(diào)控因子表達(dá)的影響，探討QLN 對BPH 的治療機(jī)制。

1 材 料

1.1 實驗動物及細(xì)胞 雄性SPF 級6～7 周齡健康雄性SD 大鼠50 只，體質(zhì)量（150±20 g），購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，批號：0017446，實驗動物許可證號：SCXK（滬2017-0005）。大鼠飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)室溫度為20～26 ℃，相對濕度40%～70%，燈照周期為12 h，7：00～19：00 燈照，19：00～7：00 黑暗。本實驗獲福建中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（審批號：FJTCM IACUC 2022178）。人前列腺增生細(xì)胞-1（humanbeing prostatic hyperplasia cell-1，BPH-1）由深圳Otwo Biotech公司提供，批號：HTX2051。

1.2 實驗藥物與主要試劑 QLN 由酒大黃15 g，水蛭3 g，黃芪12 g，牛膝9 g，菟絲子6 g 組成，該方由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院研制并已申請發(fā)明專利；丙酸睪丸酮注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：25 mg/mL，批號：H31020524）；細(xì)胞培養(yǎng)雙抗100×（上海漢恒生物科技有限公司，批號：HB-PSS-100）；細(xì)胞裂解液（批號：MB9900-Apr-12H）、細(xì)胞增殖及毒性試劑盒（批號：C0042）均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；鼠MMP2-抗體（批號：66366-1-lg）、兔LN（批號：12858-1-AP）均購自美國Proteintech公司；兔TIMP-2 抗體（美國Immunoway 公司，批號：YT4659）。

1.3 主要儀器 ChemiDoc XRS 凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；Countstar 細(xì)胞自動計數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；PowerPAC? HC 高電流電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；RM2235 石蠟切片機(jī)（德國徠卡公司）；常規(guī)倒置顯微鏡（德國徠卡公司）。

2 方 法

2.1 QLN 藥液制備 動物灌胃用QLN 由福建中醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院制備；細(xì)胞用QLN 購自江蘇天江藥業(yè)顆粒劑，以200 mg QLN 粉末，加入1 mL 蒸餾水溶解后高壓、超聲助溶，配制成濃度為200 mg/mL 的母液，用完全培養(yǎng)基DMEM 倍比稀釋后配置成3 種不同濃度（0.25、0.5、1.0 mg/mL）的工作液，0.22 μm 過濾器過濾后加入細(xì)胞中。

2.2 BPH 大鼠模型制備 依據(jù)前期基礎(chǔ)及查閱文獻(xiàn)成功制備模型［9-10］，SPF 級雄性SD 大鼠50 只，6～7 周齡，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，除空白組外，其余各組腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）麻醉，無菌手術(shù)，摘除雙側(cè)睪丸，術(shù)后恢復(fù)1 周，模型組及低、中、高劑量組皮下注射丙酸睪酮（5 mg/kg），連續(xù)28 d。

2.3 分組及干預(yù) 采用數(shù)字隨機(jī)法將大鼠分為空白組、模型組和低、中、高劑量組，每組10只。模型組及低、中、高劑量組去勢1 周后注射造模同時，開始灌胃給藥，空白對照組和模型組灌服生理鹽水，各劑量組采用灌胃QLN。劑量分別為：空白組、模型組生理鹽水10 mL/（kg·d），低劑量組3 g/（kg·d）、中劑量組6 g/（kg·d）、高劑量組12 g/（kg·d）；即分別相當(dāng)于臨床用藥量的3、6、12 倍，以上均采用灌胃給藥，1 次/d，期間每周稱體質(zhì)量1 次并按體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量，共28 d。

2.4 標(biāo)本采集 末次給藥后禁食12 h，大鼠體質(zhì)量，手術(shù)分離出完整的前列腺組織，測量前列腺濕重和體積（容積法）；選取相同部位前列腺組織一塊，10%甲醛固定作免疫組化用。

2.5 指標(biāo)檢測

2.5.1 大鼠前列腺濕重、體積和前列腺指數(shù) 測量5 組大鼠的前列腺的濕重、體積并計算前列腺指數(shù)（PI），PI 的計算公式如下：

PI＝前列腺濕重（g）/體質(zhì)量（g）

2.5.2 免疫組化法測5 組大鼠前列腺組織LN 的蛋白表達(dá)水平 分別取5 組大鼠前列腺組織側(cè)葉0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm 組織塊，PBS 清洗，10%甲醛進(jìn)行固定，包埋存檔，切片。石蠟切片分作LN 免疫組化染色，一抗（比例1∶1 000），二抗（比例1∶1 000），PBS 洗，標(biāo)記后PBS 洗，DAB 顯色，嚴(yán)格按說明書操作。

2.5.3 QLN 干預(yù)BPH-1 細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察用0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞，之后每孔加入3 mL含低（0.25 mg/mL）、中（0.5 mg/mL）、高（1.0 mg/mL）不同濃度QLN 藥液的完全培養(yǎng)基及等量完全培養(yǎng)基，分別在干預(yù)24、48 h 后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量變化并拍照。

2.5.4 CCK-8 法檢測BPH-1 細(xì)胞存活率 用0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞，分別在12、24 h 時避光加入10 μL CCK-8 溶液，1.5～2 h 后在酶標(biāo)儀（570 nm 波長下、持續(xù)震蕩15 s）檢測其吸光值。細(xì)胞存活率的計算公式如下：

細(xì)胞存活率＝用藥組A值/空白組（對照組）A值×100%）

2.5.5 Western blot 檢測BPH-1 細(xì)胞MMP-2、TIMP-2、LN 蛋白表達(dá)量 用0.25%胰酶消化收集離心后，總蛋白濃度測定與定量，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)ChemiDoc XRS+下成像。用Image J軟件對蛋白灰度值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出MMP-2、TIMP-2、LN 蛋白相對表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)采用Prism GraphPad 8.0.1 作圖，并采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均采用正態(tài)檢驗及方差齊性檢驗，計量資料服從正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 5組大鼠前列腺濕重、體積和PI比較 見表1。

表1 5 組大鼠前列腺濕重、體積和PI 比較（±s）

表1 5 組大鼠前列腺濕重、體積和PI 比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組PI 0.13±0.01 0.26±0.021）0.22±0.032）0.21±0.022）0.22±0.012）n 10 10 10 10 10前列腺濕重/g 0.54±0.06 0.87±0.121）0.76±0.082）0.71±0.072）0.71±0.112）體積/mL 0.53±0.03 0.85±0.111）0.72±0.092）0.60±0.082）0.60±0.062）

3.2 5組大鼠前列腺組織中LN蛋白表達(dá)量比較 見圖1。

圖1 5 組大鼠前列腺組織中LN 蛋白表達(dá)（×400）及陽性表達(dá)率比較

3.3 4組BPH-1 細(xì)胞形態(tài)及經(jīng)QLN 干預(yù)后活力變化 倒置顯微鏡下觀察，空白組BPH-1 細(xì)胞形態(tài)正常，呈菱形，細(xì)胞邊界菱角清晰，細(xì)胞貼壁牢固，細(xì)胞匯合度緊密；經(jīng)QLN 干預(yù)后，隨著QLN 濃度的增加，可觀察到細(xì)胞形態(tài)完整性逐漸改變，細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，細(xì)胞匯合度降低，出現(xiàn)細(xì)胞脫落，懸浮細(xì)胞逐漸增加。見圖2。CCK-8 檢測顯示，與空白組比較，低、中、高劑量組細(xì)胞活力在24 h 及48 h 均顯著下降（P＜0.05），且QLN 藥物濃度越高而細(xì)胞活力越低，其中以中、高劑量組最為顯著，但QLN 干預(yù)24 h 與干預(yù)48 h 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），不存在時間依賴關(guān)系。見圖3。

圖2 4 組BPH-1 細(xì)胞形態(tài)比較（×100）

圖3 4 組BPH-1 細(xì)胞24、48 h 細(xì)胞活力變化（5 000 個細(xì)胞/孔）

3.4 4組BPH-1 細(xì)胞MMP-2、TIMP-2、LN 蛋白表達(dá)量比較 見圖4。

圖4 4 組BPH-1 細(xì)胞MMP-2、TIMP-2、LN 蛋白表達(dá)量比較

4 討 論

BPH 在中醫(yī)學(xué)中歸屬為“癃閉”“精癃”等范疇，其病因病機(jī)迄今仍未詮釋。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示，ECM 學(xué)說一直是BPH 發(fā)病的重要機(jī)制［11］，ECM主要成分包括膠原蛋白、LN、纖維連接蛋白（FN）等，其中，collagens、elastin、LN 等與BPH 密切相關(guān)［12］。有研究顯示，前列腺細(xì)胞的增殖與ECM 增加密切相關(guān)，ECM 與各種生長因子及雄-雌激素相互作用發(fā)生BPH，前列腺組織中活性肽類物質(zhì)也可以由ECM 調(diào)節(jié)，刺激細(xì)胞產(chǎn)生不同的ECM［13-17］。ECM 受多種酶類降解，其中MMPS是最重要的一類，MMP-2屬于MMPS 家族中的明膠酶，可降解collagenⅣ、FN和LN 等，MMP-2 在降解上述ECM 過程中受到其抑制劑TIMP-2 調(diào)控，MMP-2、TIMP-2 達(dá)到一定比值時，能發(fā)揮最佳調(diào)控效果［18-19］。

BPH 的基本病機(jī)為熱毒瘀阻、氣血失調(diào)、痹阻絡(luò)脈、日久腎虛而致。針對此病機(jī)，課題組提出了祛瘀軟堅、補(bǔ)腎益氣的治法，研制成前列寧方。課題組研究發(fā)現(xiàn)，QLN 對BPH-1 細(xì)胞增殖有抑制作用，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并對多種細(xì)胞因子有調(diào)節(jié)作用，對BPH 治療具有明顯效果［20-23］，同時可以調(diào)節(jié)部分ECM 成分及MMP-2 作用［10］。在體內(nèi)實驗中，動物模型組大鼠前列腺指數(shù)、前列腺體積明顯高于空白組，各劑量組中大鼠前列腺指數(shù)、前列腺體積較模型組不同程度減少，表明QLN 具有治療大鼠BPH 作用；免疫組化檢測大鼠前列腺組織LN 蛋白表達(dá)水平明顯減少，表明LN 蛋白減少與治療BPH具有相關(guān)性，與文獻(xiàn)報道一致［17-19］。體外實驗中，QLN 直接購自江蘇天江藥業(yè)成分顆粒劑，未采取含藥血清給藥而是蒸餾水溶解后高壓、超聲助溶方法，在前期研究中已取得成熟穩(wěn)定給藥方法，結(jié)果穩(wěn)定可靠［23，10］。在細(xì)胞實驗中，經(jīng)QLN 干預(yù)的低、中、高劑量組中細(xì)胞存活率呈現(xiàn)不同程度下降，CCK-8 檢測顯示QLN 作用24 h 和48 h 后各組細(xì)胞存活率出現(xiàn)不同程度下降，與空白組比較，QLN 藥物濃度越高細(xì)胞存活率越低，其中以0.5、1 mg/mL最為顯著；Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，QLN 干預(yù)細(xì)胞培養(yǎng)，MMP-2、LN 蛋白表達(dá)量明顯降低，TIMP-2 蛋白表達(dá)量升高，表明在細(xì)胞培養(yǎng)中QLN 能夠有效抑制MMP-2、LN 蛋白表達(dá)量并且具有增強(qiáng)TIMP-2 蛋白表達(dá)量作用，與體內(nèi)實驗中QLN 降低BPH 大鼠模型前列腺組織LN 表達(dá)水平一致，同時體外實驗中QLN 降低MMP-2 蛋白表達(dá)量，提高TIMP-2 蛋白表達(dá)量升高，與文獻(xiàn)報道ECM 調(diào)控與MMP-2、TIMP-2密切相關(guān)，并非單純受MMP-2影響。

綜上所述，本研究證實了QLN 調(diào)控前列腺組織細(xì)胞MMP-2、TIMP-2 降解LN 從而對BPH 起 到治療作用，具有一定臨床指導(dǎo)意義，后期將圍繞QLN 可能通過調(diào)控微小基因片段降解ECM 治療BPH 展開進(jìn)一步研究，以期深入闡明QLN 治療BPH 機(jī)制。