色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定天麻中53種禁用農(nóng)藥殘留

羅京京，程慶兵，金鳳華，王瑋

（1.安徽省藥品審評查驗中心，合肥 230051； 2.合肥市食品藥品檢驗中心，合肥 230088）

天麻為蘭科植物天麻的干燥塊莖，是一種應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)中藥材，在歷代本草文獻(xiàn)中均有記載。天麻具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)之作用，臨床用于小兒驚風(fēng)、癲癇抽搐、破傷風(fēng)、頭痛眩暈、手足不遂、肢體麻木、風(fēng)濕痹痛[1-2]。因需求量急劇上升，野生天麻資源瀕臨枯竭，目前主要以人工栽培為主，栽培地集中在貴州、安徽、云南、陜西、湖北等地[3-4]。

現(xiàn)階段，中藥材種植過程中使用農(nóng)藥現(xiàn)象較普遍。為保證中藥質(zhì)量，保障人民健康，應(yīng)嚴(yán)格控制農(nóng)藥、化肥等在中藥材種植環(huán)節(jié)中的使用?！吨袊幍洹?020年版首次提出禁用農(nóng)藥殘留量檢測要求，對高毒、高風(fēng)險農(nóng)藥嚴(yán)格把控，從源頭管控中藥質(zhì)量[5-6]。近年來，天麻農(nóng)藥殘留超標(biāo)情況時有發(fā)生，對臨床用藥帶來較大風(fēng)險。目前，農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法[7-8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-12]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-15]等。胡德禹等[7]采用氣相色譜法測定了天麻中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留；郭漢文等[8]采用氣相色譜法測定了天麻中12有機(jī)氯農(nóng)藥殘留；張婷等[13]采用氣相色譜-質(zhì)譜法測定了天麻中二硫代氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留；馮紅等[16]采用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定三七中禁用農(nóng)藥殘留；楊紅等[9]采用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定丹參中禁用農(nóng)藥殘留；周琴等[10]采用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測了前胡中禁用農(nóng)藥殘留。采用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定天麻中53種禁用農(nóng)藥殘留的方法尚未見報道。筆者參照文獻(xiàn)[11]、[15]、[16]，采用乙腈直接提取法和基于QuEChERS 原則的固相萃取法對天麻樣品進(jìn)行處理，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法聯(lián)合測定天麻中53 種禁用農(nóng)藥殘留量。該方法操作簡便，靈敏度高，可分析天麻禁用農(nóng)藥殘留量情況，為市場上天麻的質(zhì)量評價提供數(shù)據(jù)支撐。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：ACQUITY XEVO TQ-S 型，美國沃特世科技有限公司。

氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：8890-G7000D型，美國安捷倫科技有限公司。

電子天平：XPE205 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

旋渦振蕩器：VORTEX3型，德國艾卡公司。

離心機(jī)：Centrifuge 5417R 型，德國Eppendorf公司。

氮吹儀：MV5型，北京萊伯泰科公司。

30種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：編號為1ST 29486-A，各組分質(zhì)量濃度見表1，天津阿爾塔科技有限公司。

表1 30種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各組分質(zhì)量濃度μg/mL

33 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：編號為81208a，含有α-六六六、γ-六六六、β-六六六、δ-六六六、4，4′-滴滴伊、2，4′-滴滴涕、治螟磷、特丁硫磷、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈、對硫磷、甲基對硫磷、內(nèi)吸磷、殺蟲脒、久效磷、甲基異硫磷、蠅毒磷、4，4′-滴滴滴、4，4′-滴滴涕、β-硫丹、α-硫丹、硫丹硫酸酯、狄氏劑、三氯殺螨醇、氟蟲腈砜、除草醚、甲基硫環(huán)磷、艾氏劑、氟甲腈、滅線磷、甲拌磷、水胺硫磷、苯線磷，各組分質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司。

磷酸三苯酯標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 μg/mL，溶劑為甲苯，編號為BW 901609-100-N，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司。

乙腈：HPLC級，美國默克公司。

QuEChERS 試劑盒：含鹽包和凈化管，批號為22 A217PY2，北京凱思科科技公司。

天麻樣品：某單位提供。

1.2 樣品處理

1.2.1 乙腈直接提取法

稱取過3#篩的天麻樣品粉末5.0 g，置于離心管中，加入1 g 氯化鈉，搖散；再加入50 mL 乙腈，在旋渦振蕩器上高速旋渦2 min，充分混勻；再于4 ℃下以4 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，分取上清液；向沉淀中再加入50 mL乙腈，勻漿處理1 min，離心；合并兩次提取的上清液，減壓濃縮至約5 mL，冷卻，用乙腈稀釋至10.0 mL，搖勻，待測。

1.2.2 基于QuEChERS原則的處理方法

稱取過3#篩的天麻樣品粉末3.0 g，置于50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入10 mL 水及質(zhì)量濃度為0.01 g/mL 的冰乙酸溶液15 mL，渦旋，使藥粉充分浸潤，放置30 min；加入乙腈15.00 mL，渦旋，混勻，以500 次每分鐘的速率劇烈震蕩5 min，加入QuEChERS鹽包，立即搖散，再以500次每分鐘的速率劇烈震蕩3 min，于冰浴中冷卻10 min，于4 ℃下以4 000 r/min 離心5 min，取上清液9 mL，置于QuEChERS凈化管中，渦旋使其充分混勻，以500次每分鐘的速率劇烈震蕩5 min，使之凈化完全，于4 ℃下以4 000 r/min 離心5 min，精密吸取上清液5 mL，置于氮吹儀上，于40 ℃水浴中濃縮至約0.4 mL，用乙腈稀釋至1.0 mL，渦旋，混勻，待測。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜法儀器工作條件

1.3.1 液相色譜儀

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱[100 mm×2.1 mm，1.7 μm，沃特世科技(上海)有限公司]；流動相：A 相為0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸溶液，B 相為乙腈-0.1%甲酸溶液(體積比為95∶5)，A、B 相均含有5 mmol/L 甲酸銨；洗脫方式：梯度淋洗，0～1 min時70% A，1～12 min 時70%～0% A，12～14 min 時0%～100% A；流動相流量：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：1 μL。

1.3.2 質(zhì)譜儀

離子模式：電噴霧電離，正離子掃描；毛細(xì)管電壓：2.50 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；錐孔氣：氮?dú)猓髁繛?0 L/h；脫溶劑氣：氮?dú)猓髁繛? 000 L/h。29種農(nóng)藥化合物質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 29種農(nóng)藥化合物質(zhì)譜參數(shù)

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜法儀器工作條件

1.41 氣相色譜儀

色譜柱：DB-17MS 彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：不分流；進(jìn)樣體積：1 μL；柱箱溫度：程序升溫，初始溫度為60 ℃，保持1 min，以30 ℃/min的速率升溫至120 ℃，然后以10 ℃/min的速率升溫至160 ℃，再以2 ℃/min 的速率升溫至230 ℃，最后以15 ℃/min的速率升溫至300 ℃，保持6 min；載氣：高純氦氣，流量為1.0 mL/min。

1.4.2 質(zhì)譜儀

電離方式：電子轟擊電離模式；電離能量：70 eV；離子源溫度：250 ℃；質(zhì)譜傳輸接口溫度：250 ℃；碰撞氣：高純氮?dú)?；四級桿溫度：150 ℃；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。24種農(nóng)藥化合物質(zhì)譜參數(shù)見表3。

表3 24種農(nóng)藥化合物質(zhì)譜參數(shù)

1.5 溶液配制

29 種農(nóng)藥（具體名稱見表2）混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密量取30 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻。

基質(zhì)匹配系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液A：取天麻空白基質(zhì)樣品，按1.2.1方法處理。取樣品提取液6份，各1.0 mL，分別于40 ℃水浴中濃縮至約0.6 mL，分別加入29 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液10、20、50、100、150、200 μL，用乙腈稀釋至1.0 mL，渦旋，混勻。

24種農(nóng)藥（具體名稱見表3）混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：1 μg/mL，精密量取33 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，置于50 mL容量瓶中，用乙腈定容至標(biāo)線，搖勻。

磷酸三苯酯溶液：1 ng/mL，精密量取磷酸三苯酯標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，置于50 mL 容量瓶中，用乙腈定容至標(biāo)線，搖勻。精密量取上述溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，加乙腈稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻。

基質(zhì)匹配系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液B：取天麻空白基質(zhì)樣品，按1.2.2方法處理。取樣品提取液6份，各1.0 mL，分別于40 ℃水浴中濃縮至約0.6 mL，分別加入24種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液5、10、20、50、100、150、200 μL，用乙腈稀釋至1.0 mL，渦旋，混勻。

1.6 定量方法

1.6.1 液相色譜-質(zhì)譜法

取處理好的樣品溶液和基質(zhì)匹配系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液A各1 mL，分別精密加入0.3 mL水，混勻，濾過，取續(xù)濾液進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以色譜峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

1.6.2 氣相色譜-質(zhì)譜法

取處理好的樣品溶液和基質(zhì)匹配系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液B各1 mL，分別精密加入0.3 mL磷酸三苯酯溶液作為內(nèi)標(biāo)，混勻，濾過，取續(xù)濾液進(jìn)樣測定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.1.1 液相色譜-質(zhì)譜法質(zhì)譜條件

分別選擇在ESI 正離子和負(fù)離子模式下2 種掃描方式，對29 種目標(biāo)農(nóng)藥化合物進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描，獲得穩(wěn)定的母離子分子離子峰，然后對其進(jìn)行二級掃描，獲得二級離子質(zhì)譜信息，篩選2個信號較強(qiáng)的離子碎片作為子離子，并在MRM 模式下分別優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)，選取響應(yīng)強(qiáng)度高且基質(zhì)干擾小的兩對離子作為定量和定性離子，優(yōu)化結(jié)果見表2。

2.1.2 氣相色譜-質(zhì)譜法質(zhì)譜條件

對24種目標(biāo)農(nóng)藥化合物進(jìn)行掃描，選擇有代表性的母離子，選取特征離子作為子離子，建立多反應(yīng)監(jiān)測模式，同時優(yōu)化定量、定性離子對的碰撞能量，優(yōu)化結(jié)果見表3。空白樣品和加標(biāo)樣品色譜圖如圖1所示。

圖1 空白樣品及加標(biāo)樣品氣相色譜圖

2.2 樣品處理方法優(yōu)化

2.2.1 基質(zhì)效應(yīng)

以農(nóng)藥化合物在基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中色譜峰面積與其溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液中的信號峰面積比值計算基質(zhì)效應(yīng)，若比值大于120%，認(rèn)為存在強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)；若比值為80%～120%，則認(rèn)為沒有基質(zhì)效應(yīng)；若比值小于80%，則認(rèn)為存在弱基質(zhì)效應(yīng)。

分別采用乙腈直接提取法和基于QuEChERS原則的固相萃取法處理樣品，發(fā)現(xiàn)以乙腈直接提取法處理的樣品，采用LC-MS/MS 法測定時，只有約20%的目標(biāo)物存在基質(zhì)效應(yīng)，且基質(zhì)效應(yīng)較?。欢捎肎C-MS/MS 法測定時，基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)，有近50%的目標(biāo)物存在基質(zhì)效應(yīng)，但基質(zhì)效應(yīng)多數(shù)較弱。采用基于QuEChERS 原則的固相萃取法處理樣品，以LC-MS/MS法測定時，有約17%的目標(biāo)物存在基質(zhì)效應(yīng)，且基質(zhì)效應(yīng)較小；以GC-MS/MS法測定時，有約39%的目標(biāo)物存在基質(zhì)效應(yīng)。綜合考慮，選擇采用乙腈直接提取法處理樣品用于LC-MS/MS 法測定，采用基于QuEChERS 原則的固相萃取法處理樣品用于GC-MS/MS法測定。

2.2.2 基于QuEChERS原則的固相萃取法

采用基于QuEChERS 原則的固相萃取法處理樣品，發(fā)現(xiàn)部分含磷、氯農(nóng)藥化合物(如三氯殺螨醇、治螟磷等)受天麻基質(zhì)影響，回收率較低，可能與根類藥材含水量低、樣品未充分溶脹有關(guān)，導(dǎo)致提取效率低。通過對樣品中水的加入量進(jìn)行比較，考察加水量分別為5、10、15 mL時農(nóng)藥化合物的回收率，結(jié)果表明，在加入水的體積小于10 mL時，增加水的用量，會顯著提高含磷、氯農(nóng)藥化合物的回收率，當(dāng)加入水的體積大于10 mL時，回收率不再明顯增加，因此選擇加水量為10 mL。

2.3 線性方程與檢出限

在1.4、1.5儀器工作條件下，分別測定基質(zhì)匹配系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液A、B，以各目標(biāo)物的色譜峰面積對其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

取基質(zhì)匹配系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液A、B 的最低濃度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈逐級稀釋，測定并記錄色譜峰面積，以信噪比大于等于3 計算目標(biāo)物在樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，作為方法檢出限，以信噪比大于等于10計算方法定量限。

53 種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限見表4。由表4可知，53種目標(biāo)物在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)均不小于0.990，表明線性關(guān)系良好，方法檢出限為0.001～0.005 g/kg，定量限為0.002～0.01 mg/kg，滿足農(nóng)藥殘留的分析要求。

表4 53種農(nóng)藥質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.4 加標(biāo)回收與精密度試驗

取空白基質(zhì)樣品，分別添加低、高兩個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測定6次，以平均值作為測定值，用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，結(jié)果見表5。由表5 可知，各目標(biāo)物平均回收率為71.4%～118.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～6.3%(n=6)，表明方法的回收率和重現(xiàn)率良好，符合禁用農(nóng)藥殘留測定的要求，適用于天麻中53種農(nóng)藥殘留的同時測定。

表5 加標(biāo)回收與精密度試驗結(jié)果(n=6)

3 結(jié)語

建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定天麻中53 種禁用農(nóng)藥殘留的方法。采用乙腈直接提取和基于QuEChERS 原則的固相萃取法對樣品進(jìn)行處理，以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法定量，能快速實現(xiàn)天麻中禁用農(nóng)藥化合物的含量分析。該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，滿足復(fù)雜基質(zhì)中痕量農(nóng)藥分析要求，且簡單、快速、穩(wěn)定，可用于批量天麻樣品中禁用農(nóng)藥殘留的快速分析測定。