枇杷葉中活性物質(zhì)提取方法研究進展

林俊豪，閆啟東，金昌權，沈林麗，羅士波，徐研菲，吳家泰，王詩怡

（1.臺州職業(yè)技術學院，醫(yī)學與制藥工程學院，浙江臺州 318000； 2.浙江合譜儀器有限公司，浙江臺州 318000）

枇杷葉為薔薇科植物枇杷的葉子，又名巴葉、蘆桔葉。枇杷葉中的不同成分具有不同的經(jīng)濟價值，枇杷葉提取物中的活性成分有多種，主要為黃酮類、多糖類化合物和三萜酸[1]。在植物體內(nèi)黃酮類化合物大多與糖結合生成苷，多糖屬于碳水化合物，三萜酸主要有山楂酸、熊果酸等。黃酮類、多糖類化合物均具有抗氧化降血脂作用，三萜酸可以抗疲勞、保肝利尿。上述三種物質(zhì)對人體健康大有好處，可以延緩人的衰老。枇杷葉還具有較高的藥用價值，如調(diào)節(jié)新陳代謝和內(nèi)分泌系統(tǒng)，治療糖尿病[2-3]。此外枇杷葉還可作為食品，如以枇杷葉為原料的復合型果酒[4]。筆者針對枇杷葉中的活性物質(zhì)及其提取方法進行綜述。

1 枇杷葉的提取方法

目前國內(nèi)外提取枇杷葉中活性物質(zhì)的方法主要包括：響應面法優(yōu)化微波輔助提取法[5]、超聲波輔助雙水相提取法[6]、內(nèi)部沸騰溶劑提取法[7]、超聲波輔助酶提取法[8]、水提醇沉提取法[9]、超臨界二氧化碳萃取法[10]等。而活性物質(zhì)的分析常用高效液相色譜法[11]進行測定。

1.1 響應面法優(yōu)化微波輔助提取法

響應面法是一種高效且應用廣泛的統(tǒng)計方法，即RSM[12]。微波技術普及于1986 年，Gedye 等[13]首次將微波用于有機合成，且該技術在有機合成領域應用廣泛。相較于傳統(tǒng)溶劑提取法，微波輔助法具有高選擇性，可顯著提高提取效率，且可用于對熱不穩(wěn)定的物質(zhì)。利用響應面法結合微波輔助提取，將復雜的實驗數(shù)據(jù)坐標化，具有高效率、無污染的優(yōu)點[14]。黃百祺等[15]運用響應面法設計試驗，測量枇杷葉中熊果酸和齊墩果酸的質(zhì)量濃度。取粉碎過篩后枇杷葉粉末3.0 g，按照料液比1 g∶20 mL 進行實驗，在微波功率為500 W下提取11.5 min，最后得到提取率為0.93%，顯示比傳統(tǒng)工藝更優(yōu)。

1.2 超聲波輔助雙水相提取法

超聲波技術具有高效簡單的優(yōu)點，王明艷等[16]將超聲波運用于提取枇杷葉中有效成分，采用超聲波提取法提取枇杷葉中的多糖，通過多次對比試驗得出提取條件對實驗的影響程度，依次為超聲時間、提取溫度、液固比、超聲功率。確定最佳實驗條件為料液比為1 g∶12 mL，溫度為60 ℃，用120 W超聲功率超聲35 min，得到提取率約為1.24%。與常規(guī)水提法對比，該法具有污染小、效率高和提取率高的優(yōu)點，各項數(shù)據(jù)全面高于常規(guī)水提法，該作者提出可以將超聲法與水提法有機結合。雙水相提取法能夠避免使用有毒試劑，且提供溫和的水環(huán)境。王麗等[17]利用乙二醇-硫酸銨雙水相環(huán)境進行探索研究，并繪制了蘆丁標準曲線。操作條件：枇杷粉為0.2 g、無水乙醇為4.0 mL、硫酸銨為1.8 g，在料液比為1 g∶50 mL和溫度為40 ℃的條件下，提取1 h，得到的提取效率最大，可達7.49%，此方法成本較低。玉瀾等[18]運用類似方法進行探索研究，其實驗條件為超聲功率為270 W，乙醇體積分數(shù)為35%，超聲溫度為40 ℃。運用乙醇與硫酸銨雙水相提取，可較大程度提取枇杷葉中的黃酮類化合物。

1.3 內(nèi)部沸騰溶劑提取法

內(nèi)部沸騰提取法是傳統(tǒng)的提取法，內(nèi)部沸騰法雖然提取時間較長，但是方法較為環(huán)保。內(nèi)部沸騰法在提取植物有效成分方面具有較好的效果[19]。歐蜀云等[20]用內(nèi)部沸騰法提取枇杷內(nèi)的多糖，采用45%的乙醇溶液在98 ℃溫度條件下，提取30 min，多糖提取率為6.66%。

1.4 超聲波輔助酶提取法

超聲波輔助法即超聲波法和傳統(tǒng)酶解法結合，相較于傳統(tǒng)酶解法，超聲波可以提高酶解得率。傅賢明等[21]運用超聲波輔助酶法提取枇杷葉中的總黃酮，通過繪制蘆丁標準曲線計算線性回歸方程，再通過比色法，計算總黃酮的含量，并對乙醇濃度、料液比和超聲時間等因素進行了探索，得出最佳總黃酮提取條件：料液比為1 g∶40 mL，超聲功率為140 W，溫度為70 ℃，超聲時間30 min，總黃酮提取率為10.53%。

1.5 水提醇沉提取法

水提醇沉法又稱為水提醇法，可廣泛應用于植物活性物質(zhì)的提取，如枇杷葉中總黃酮的提取。王增斌等[22]運用水提醇法提取枇杷葉中的總黃酮，料液比為1 g∶20 mL，以90 W超聲功率在55 ℃條件下超聲40 min，總黃酮提取率約為4.18%。通過單因素實驗考察各因素變化對提取率的影響，得到提取條件對枇杷葉中總黃酮提取率的影響程度的大小排序，依次為提取溫度、超聲波功率、提取時間。

1.6 超臨界CO2萃取法

超臨界CO2萃取法提取溫度較低，可以保護被提取成分，CO2在萃取過程中起到保護樣品的作用，使產(chǎn)品純度更高[23]。張慧恩等[24]運用響應面設計實驗法設計實驗，探索萃取溫度、萃取壓力和動態(tài)萃取時間三個主要因素對提取率的影響，通過計算超臨界CO2提取參數(shù)的回歸方程，得到提取率。試驗條件如下：稱取一定量枇杷葉粉末，通入CO2，在萃取溫度為61 ℃，萃取壓力為25.8 MPa下，動態(tài)萃取時間為40 min，熊果酸理論提取率約為3.96 mg/g。

枇杷葉中活性物質(zhì)通過不同的提取方法提取后，需要一定的分析方法進行分析檢測。高效液相色譜法(HPLC)作為高效的分離分析儀器，常作為藥用植物活性物質(zhì)提取物的分析方法[25]。陳榮祥等[26]利用高效液相色譜法檢測枇杷中齊墩果酸和熊果酸，對提取溶劑、提取時間、提取溫度以及萃取次數(shù)等因素進行試驗探索。優(yōu)化的條件為：以體積分數(shù)為80%的甲醇水溶液為提取溶劑，提取溫度為110 ℃，提取次數(shù)為2 次，提取時間每次10 min。以乙腈與15 mmol/L 乙酸銨溶液(pH 9.3)(體積比為3∶1)為流動相等梯度洗脫，流量為0.5 mL/min，檢測波長為205 nm，色譜柱溫度為40 ℃，測定枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸的含量，得到平均加標回收率分別為95.0%～98.9%和97.3%～100.5%。此分析方法具有分析速度快、操作簡單、穩(wěn)定性高、準確性和重復性好的特點，適用于枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸的含量測定。

2 枇杷葉中活性物質(zhì)

止咳露類藥品中多含有枇杷，說明枇杷葉中有止咳成分。同時現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，枇杷葉中含有很多可以入藥的成分，可以制作清肺止咳、抗癌、抗炎癥的藥物[27]；同時枇杷葉中的黃酮類、三萜酸類、有機酸類、揮發(fā)油類等化學成分還具有抗氧化、降血糖、抗病毒、護肝的作用[28]。

2.1 黃酮類化合物

枇杷葉中黃酮類成分能夠調(diào)節(jié)人體內(nèi)的血糖，增強人體免疫力，減緩人的衰老[29]?？傸S酮能夠清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基，且總黃酮清除DPPH自由基能力與濃度成正比。經(jīng)過提純后總黃酮濃度更高，清除DPPH自由基效率更高[30]。梁樹才等[31]建立小鼠急性肝損傷模型，觀察黃酮化合物(TEL)對腎臟系數(shù)的降低作用。超氧化物歧化酶(SOD)生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，其活性越高，清除自由基的速度就越快。枇杷葉的抗氧化活性與總黃酮和總酚含量顯著相關[32]，且三倍體葉片總黃酮含量及其對應的抗氧化活性均高于二倍體。付曉丹等[33]對枇杷葉中黃酮提取物進行研究，采用超聲波提取法，對枇杷葉各部位的黃酮化合物含量進行測定，結果表明：黃酮化合物在葉尖中含量最高，與其它部位的黃酮化合物含量存在顯著差異性。具體測定步驟如下：準備好油脂，往油脂中加入黃酮化合物，再用碘量法測定油脂中的過氧化值，計算出1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的清除率，同時測定2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基的清除率，計算平均值。最終得出抗氧化性與黃酮化合物濃度成正比，且枇杷葉中的黃酮化合物與抗壞血酸有著一定的協(xié)同抗氧化作用。

2.2 三萜酸類化合物

三萜酸可以降低神經(jīng)元的興奮性，并在癲癇中發(fā)揮作用。WEI X等[34]運用高光譜成像法來測定枇杷葉片中三萜酸在枇杷葉各個部位的含量分布，用光譜數(shù)據(jù)和三萜酸含量建立數(shù)據(jù)模型，經(jīng)過一系列處理，得到三萜酸含量分布圖。與老年的枇杷葉片相比，幼年的枇杷葉片中三萜酸含量較低，且主要分布在葉肉區(qū)域。郭磊等[35]以大鼠作為實驗對象，研究三萜酸對慢性支氣管炎的療效，發(fā)現(xiàn)注射三萜酸后，大鼠咳嗽次數(shù)顯著減少，有效抑制了其體內(nèi)巨噬細胞內(nèi)誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的活性，減少了一氧化氮的釋放。

三萜酸類化合物主要有熊果酸、齊墩果酸和山楂酸等，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和抗腫瘤的作用[36]。葛金芳等[37]用環(huán)磷酰胺為原料建立研究小鼠免疫力的模型，同時注射枇杷葉中提取的三萜酸，觀察該物質(zhì)對小鼠細胞免疫的作用，最終得出三萜酸對小鼠細胞免疫具有良好的調(diào)節(jié)作用，為枇杷葉中的三萜酸應用于臨床提供了良好的思路。

2.3 苷類化合物

枇杷葉中的苦杏仁苷與枇杷藥理中的祛痰止咳作用相對應[38]。朱月月等[39]研究了止咳枇杷糖漿的止咳效果，采用HPLC 法測定枇杷葉中苦杏仁苷的含量，分析止咳枇杷糖漿中各成分之間的配比，結果發(fā)現(xiàn)，止咳糖漿中熊果酸和齊墩果酸占據(jù)的比例非常小，兩者在制作過程中有大量的損失，苦杏仁苷是發(fā)揮主要作用的成分，可以通過控制產(chǎn)品中苦杏仁苷的含量來提高止咳糖漿的質(zhì)量。

3 總結和展望

枇杷葉中活性物質(zhì)的提取方法中，超聲波雙水相提取法是利用超聲波產(chǎn)生的空化效應將活性成分提出，再將其在互不相溶的雙水相中實現(xiàn)提取和分離[40]。超聲波提取的高效率與雙水相保護活性成分兩個優(yōu)點相結合就構成了超聲波輔助雙水相法，該方法具有提取效率高和選擇性好的特點。內(nèi)部沸騰法通過高溫使溶液氣化而讓有效成分大量擴散，較傳統(tǒng)水提法效率有所提高[41]。超聲波輔助酶解法較傳統(tǒng)酶解法提高了酶解得率和提取效率。水提醇沉法應用范圍廣，操作簡單、成本低，且可以較好地保護被提取物[42]。超臨界CO2萃取法可用于熱穩(wěn)定性較差的物質(zhì)，且靈敏度高，測量結果準確，但相對成本高。高效液相色譜法可以作為枇杷葉中活性物質(zhì)提取常用的分析方法，進行物質(zhì)的含量測定。

枇杷葉中含有多種活性成分，原料易于采集且成本不高。枇杷葉中活性成分的提取方法，可以廣泛應用在各種藥用植物的活性物質(zhì)提取中。在保證良好的選擇性和重復性前提下，使用綠色、環(huán)保、經(jīng)濟的提取溶劑減少環(huán)境污染，提高活性物質(zhì)提取得率是現(xiàn)代提取方法的發(fā)展方向。研究活性成分的提取方法不僅對開發(fā)枇杷葉中活性成分藥用價值有著重要意義，同時也為其它中藥植物的提取開發(fā)利用提供了新的思路。