PARP-1基因多態(tài)性與妊娠期高血壓的相關性及潛在分子機制研究*

林開榮,胡宏媛,劉曉燕

萬寧市人民醫(yī)院產科,海南萬寧 571500

流行病學調查顯示,妊娠期高血壓(HDP)是導致全球孕產婦不良事件和新生兒不良結局的主要原因[1]。相關報道表明,HDP具有家族遺傳傾向,許多遺傳基因在HDP的發(fā)生發(fā)展中扮演者重要角色[2]。目前研究證實,包括一氧化氮合成酶(eNOS)、促紅細胞生成素(EPO)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等多種基因多態(tài)性與HDP進展密切相關[3-4],但HDP發(fā)生的潛在風險及分子機制仍需進一步研究。多聚ADP核糖轉移酶(PARP-1)是PARP家族中的重要成員,其主要作用為DNA的損傷修復、調節(jié)細胞凋亡。有研究表明,PARP-1的不同位點的單核苷酸多態(tài)性變化與許多疾病的遺傳易感性相關,特別是rs1805407、rs1805414、rs3219090 3個位點;然而,PARP-1與HDP的相關性及其在HDP中的調控機制尚鮮見報道[5]。有研究還顯示,PARP-1可以在炎癥反應中發(fā)揮中介效應,通過核因子-κB(NF-κB)信號通路介導組織炎癥損傷、病理生理變化等過程[6]。作為一種核轉錄因子,NF-κB已經被證實參與了機體的免疫調節(jié)、基因轉錄和凋亡[7]。NF-κB信號通路的調節(jié)作用在腫瘤發(fā)生、炎癥反應及自身免疫性疾病、重癥感染方面發(fā)揮著重要作用[8]。由于HDP本身的特征也是機體的過度炎癥反應,因此,NF-κB可能在PARP-1參與HDP發(fā)病中起到了一定作用。本研究擬探討PARP-1基因多態(tài)性與HDP的相關性,同時基于NF-κB通路探討其潛在的分子機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2021年8月至2022年6月在本院就診的80例HDP孕婦作為HDP組,以及同期80例健康孕婦作為對照組。納入標準:(1)HDP診斷符合《妊娠期高血壓疾病診治指南(2020)》[9];(2)單胎妊娠;(3)無其他妊娠期并發(fā)癥。排除標準:(1)妊娠前存在高血壓及合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、類風濕性關節(jié)炎等免疫系統(tǒng)疾病者;(2)惡性腫瘤及合并嚴重臟器功能障礙的患者;(3)人工授精、試管嬰兒等輔助生殖技術受孕者;(4)存在交流障礙或精神類疾病者。本研究獲得本院倫理委員會批準,符合赫爾辛基宣言,所有孕婦知情同意,并簽署書面文件。

1.2資料收集 收集兩組孕婦年齡、體重指數(BMI)、孕周、胎次、家庭收入、受教育水平等一般資料。兩組孕婦年齡、BMI、孕周等比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較或n)

1.3實驗室指標檢測 于孕中期(14～18周)時抽取孕婦靜脈血5 mL,采用電化學發(fā)光免疫分析法檢測兩組孕婦血管內皮生長因子受體-1(sFlt-1)和胎盤生長因子(PLGF),計算sFlt-1/PLGF;(2)于孕22～26周時,結合產科三維超聲檢查測定孕婦子宮動脈搏動指數(UAPI),以兩側UAPI的平均值為衡量指標。

1.4PARP-1基因多態(tài)性分析 在禁食12 h后,采集孕婦肘靜脈血5 mL,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝后分成3 mL和2 mL兩份,2 mL血液標本用作提取DNA進行不同位點單核苷酸多態(tài)性檢測,3 mL血液標本靜置后置于4 ℃冰箱內保存,用以測定血清中PARP-1、NF-κB、髓樣分化因子88(MyD88)和Toll樣受體7(TLR7) mRNA蛋白表達情況。單核苷酸多態(tài)性檢測方法如下:(1)取2 mL EDTA抗凝管血液,3 000 r/min離心5 min(離心半徑7.5 cm)分離血漿,-70 ℃冰箱冷藏。(2)采用PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)法測定PARP-1基因rs1805407、rs1805414、rs3219090 3個位點的單核苷酸多態(tài)性,具體操作步驟如下:①按常規(guī)酚-氯仿抽提方法提取外周血DNA。②應用Primer3軟件設計3個基因不同位點引物,由美國AB公司設計合成。rs1805407位點的上游引物序列為5′-TAGGGTTGGGTCTAGAGCTTG-3′,下游引物序列為5′-ACAGAGCAGAAACACCAAGAT-3′;rs1805414位點的上游引物序列為5′-TGCTTCCCTTGCTCCTGGTTC-3′,下游引物序列為5′-GGGGGCAAGGTCTGTTAGTGG-3′;rs3219090位點的上游引物序列為5′-TACGATCTATGCGACCTGAC-3′,下游引物序列為5′-CGAGTTCAGTTGCTGCATC-3′。探針序列為FAM-TATGCCAGTCTTACCTGCTG-MGB,HEX-AC TACTCTGAATGCAGCTGCT-MGB。③PCR反應體系:共25 μL,包括10 pmol/L引物1 μL,DNA模板約2 μL,200 μmol/L dNTPs 20 μL,1 U Taq聚合酶1 μL,1.5 mmol/L MgCl21 μL。PCR反應條件:96 ℃預變性 6 min,94 ℃ 40 s,52 ℃ 60 s,72 ℃ 50 s,共35個循環(huán);72 ℃延伸7 min。采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產物。④限制性內切酶MspⅠ、CviQ Ⅰ酶解。⑤采用瓊脂糖凝膠電泳鑒別基因型。⑥紫外光照相儀進行拍照。采用Bio-Rad C FX manager 3.0 軟件進行基因型分析。采用Apaman探針實時熒光PCR技術檢測3個位點的基因型。

1.5PARP-1基因和NF-κB通路蛋白及mRNA表達水平檢測

1.5.1實時熒光定量PCR(qPCR)檢測PARP-1、NF-κB、MyD88、TLR7的mRNA表達水平 取3 mL血液標本采用密度梯度離心法分離出單個核細胞(PBMC),分別裝在100 μL EP管中,-70 ℃保存;然后用胰蛋白酶消化細胞質,保留細胞核。采用Trizol試劑盒提取外周血PBMC中的總RNA,采用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA,然后采用PCR儀進行PCR反應。PCR反應體系為10 μL:100 ng/μL的cDNA 0.5 μL,SYBR Green Master Mix 5 μL,10 μmol/L的上、下游引物各0.4 μL,RNase-Free H2O 3.7 μL。PCR反應條件:95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次,取平均值。Trizol試劑盒由瑞士Roche公司提供,PCR儀由美國Bio-Rad公司提供,SYBR Green Master Mix試劑盒由賽默飛世爾科技(中國)有限公司提供,PCR引物由上?？迫鹕锟萍加邢薰咎峁?引物序列見表2。

表2 PCR引物序列

1.5.2Western blotting法檢測PARP-1、NF-κB、MyD88和TLR7蛋白表達 采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。將HDP組患者的單核巨噬細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(四季青公司)的培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后胰酶消化。使用細胞裂解液裂解并收集蛋白樣品,取總蛋白20 μg,行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,然后將蛋白電轉至PVDF膜上。采用質量分數為5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入1∶500稀釋的一抗[兔抗人PARP-1、NF-κB、MyD88和TLR7單克隆抗體(美國Santa Cruz公司),鼠抗人β-actin單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)],4 ℃孵育過夜;TBST洗膜,加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠二抗(1∶1 000),室溫孵育2 h;TBST洗膜后,使用ECL化學發(fā)光試劑避光反應15 min。應用Tanon 4600全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進行蛋白顯影,應用Image J圖像分析軟件對條帶進行分析。以β-actin為內參,獲得PARP-1、NF-κB、MyD88、TLR7蛋白相對表達量。同時,分別在3、6、12、24 h 4個細胞培養(yǎng)時間點檢測PARP-1蛋白表達情況。實驗均重復3次,取平均值作為最終結果。

2 結 果

2.1兩組孕婦實驗室指標、PARP-1基因多態(tài)性和相關基因表達情況比較 HDP組sFlt-1、sFlt-1/PLGF水平,PARP-1 mRNA、TRL7 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB mRNA相對表達量,以及PARP-1、TRL7、MyD88和NF-κB蛋白相對表達量均高于對照組,PARP-1基因rs1805414位點CC基因型頻率高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3、4及圖1～3。

注:A為CC基因型;B為TC基因型;C為TT基因型。圖1 rs1805414多態(tài)位點基因型分布

注:M為marker,1、3為CC基因型,2、4為TC基因型,5、6為TT基因型。圖2 rs1805414多態(tài)性位點PCR-RFLP法酶切電泳圖

注:A為HDP組隨著培養(yǎng)時間的增長,PARP-1 mRNA相對表達量逐漸增加,在6、24 h最為明顯;B為HDP組PARP-1蛋白表達量逐漸增加,但是這種增加與mRNA在變化時間上并不完全一致;C為HDP組蛋白酶激活受體(PAR)蛋白表達量逐漸增加。圖3 PARP-1蛋白表達和PAR蛋白修飾

表3 兩組實驗室指標、PARP-1基因多態(tài)性比較或n)

表4 兩組PARP-1、NF-κB、MyD88和TLR7 mRNA和蛋白表達情況比較

2.2影響HDP發(fā)病風險的Logistic回歸模型分析 Logistic回歸模型分析顯示,sFlt-1/PLGF(OR=1.236)、PARP-1 mRNA(OR=107.998)及PARP-1基因rs1805414位點CC基因型(OR=3.788)是HD患者發(fā)生子癇前期(PE)的獨立危險因素(P<0.05)。見表5。

表5 影響HDP發(fā)病風險的Logistic模型回歸分析

2.3PARP-1表達與NF-κB通路關鍵蛋白及mRNA相對表達量的相關性 Pearson相關性分析顯示,PARP-1 mRNA與TRL7、MyD88和NF-κB mRNA相對表達量呈正相關(r=0.782、0.688、0.903,均P<0.001);PARP-1蛋白相對表達量與TRL7、MyD88和NF-κB蛋白相對表達量呈正相關(r=0.833、0.845、0.907,均P<0.001)。

3 討 論

目前,關于HDP疾病的病因機制研究尚不明確,現有的證據表明機體免疫狀態(tài)的失衡對于HDP的發(fā)生發(fā)展起著至關重要的作用[10]。另外,由于HDP存在遺傳傾向,這種被證實是通過HDP易感基因之間相互作用和表觀遺傳學功能改變的途徑來發(fā)揮作用的[11]。而關于HDP易感基因的研究主要是通過分析其基因表達情況和不同位點的單核苷酸多態(tài)性來實現的[12],通過分析不同人群中其基因頻率的區(qū)別判斷某個基因與某種疾病的關聯(lián)性?；驅W研究對于揭示HDP深層次的病因學具有一定的作用。

本研究結果顯示,HDP組sFlt-1、sFlt-1/PLGF水平,PARP-1、TRL7、MyD88、NF-κB mRNA水平,以及PARP-1、TRL7、MyD88、NF-κB蛋白相對表達量高于對照組,PARP-1基因rs1805414位點CC基因型高于對照組,且經Logistic回歸模型分析顯示,sFlt-1/PLGF、PARP-1 mRNA及PARP-1基因rs1805414位點CC基因型是發(fā)生PE的獨立危險因素。分析原因:(1)關于sFlt-1 、PLGF 、sFlt-1/PLGF與HDP的相關性有研究證實,且已被指南推薦用于早期預測[13]。胎盤生長因子具有調節(jié)滋養(yǎng)細胞和內皮細胞的功能,具有促進血管生成及擴血管的作用,對胎盤的正常生長發(fā)育具有重要作用;而與其高度特異性結合的受體是血管內皮生長受體-1,二者具有高度拮抗作用,健康孕婦血清sFlt-1、PLGF分泌呈峰形,到孕29～32周時達到高峰,二者呈正相關[14];而在HDP患者中存在sFlt-1分泌過多而PLGF分泌不足,導致血管生成失衡,滋養(yǎng)層侵襲不夠,導致母體血管內皮功能障礙,最終導致HDP。(2)PARP-1作為真核細胞中多功能蛋白修飾酶家族的重要成員之一,在體內主要參與DNA修復、轉錄調控、信號轉導等過程。近年來研究表明,PARP-1在重癥感染時可出現高表達,并通過調控多效性轉錄調控因子NF-κB進入細胞核內,促進下游炎性因子的釋放,形成細胞因子網絡級聯(lián)瀑布反應,導致全身炎癥反應和多器官功能障礙[15]。相關研究還表明,炎癥相關基因家族中的白細胞基因家族和PARP-1基因具有相關性[16],這種相關性使得PARP-1基因在機體氧化應激反應中的DNA修復、基因穩(wěn)態(tài)等過程中發(fā)揮重要作用。(3)rs1805414位點作為PARP-1基因最為常見的位點,有研究指出,堿基T突變?yōu)镃后導致編碼的纈氨酸(Val)轉換為丙氨酸(Ala),引起蛋白質結構改變進而影響PARP-1的生物學功能[17]。有研究表明,PARP-1基因rs1805414位點的CC基因型增多與許多癌癥的發(fā)病風險增加有關,如胃癌、甲狀腺癌、宮頸癌、口腔癌等,且該位點的SNP與癌癥患者的預后也存在一定關聯(lián)[18-20]。本研究結果也顯示,PARP-1基因rs1805414位點CC基因型是發(fā)生PE的獨立危險因素。

有研究表明,炎癥反應發(fā)生發(fā)展中的一個重要過程為Toll樣受體(TLRs)和其相關細胞內信號分子構成的信號通路,特別是TLR7與NF-κB信號分子是一個關鍵的受體信號[21]。相關研究顯示,TLR7與NF-κB信號分子構成的信號通路在增加乳腺癌細胞侵襲力方面具有重要作用,TLR7的表達水平在乳腺癌細胞中急劇升高[22]。在炎癥反應方面,TLR7通過MyD88依賴性或非依賴性途徑(TRIF途徑)啟動下游信號轉導,激活炎癥信號。目前,MyD88在炎癥介導方面的具體機制尚不清楚,但有研究顯示,MyD88在乳腺炎性細胞、漿細胞中呈高表達,乳腺癌組織中的MyD88基因和蛋白表達水平也高于周圍正常組織[23]。NF-κB作為一組真核細胞轉錄因子,幾乎存在于所有有核細胞內,主要發(fā)揮調控細胞因子、黏附分子和炎癥反應。一項不同HDP分期的研究中指出,重度PE患者體內NF-κB表達水平明顯高于輕度PE和HDP[24],這可能是由于發(fā)生PE后胎盤局部組織發(fā)生缺血缺氧損傷,許多細胞因子、氧自由基在蛋白酶和蛋白激酶的作用下發(fā)生IKB激酶磷酸化,激活NF-κB信號通路,引起炎癥反應,而炎癥因子會進一步激活NF-κB信號通路形成惡性循環(huán)。本研究結果顯示,PARP-1與TRL7、MyD88和NF-κB mRNA相對表達量呈正相關;PARP-1蛋白相對表達量與TRL7、MyD88和NF-κB蛋白相對表達量呈正相關。也就是說,PARP-1基因及其表達產物與NF-κB信號通路的3個關鍵蛋白TRL7、MyD88和NF-κB存在高度相關性,這為揭示PARP-1基因與HDP的關系提供了新的思路。有學者認為,PARP-1與NF-κB為共活化子,使用PARP-1抑制劑抑制PARP-1基因表達后也會降低促炎因子的表達[25]。也有數據表明,PARP-1與NF-κB基因的表達產物能夠在體內形成一個穩(wěn)定的免疫沉淀復合物[26]。動物研究表明,在心肌細胞中寄生的克魯氏原蟲能夠誘導持續(xù)的PARP-1活化并與線粒體中的活性氧分子形成正反饋,導致細胞內持續(xù)的NF-κB進入細胞核,增強了NF-κB信號通路的促炎作用[27]。一項基礎研究顯示,采用脂多糖(LPS)作用于Ana-1細胞,LPS作用后能夠促進NF-κB進入細胞核,而PARP-1抑制劑能夠阻斷這個過程,說明PARP-1的活化確實對NF-κB介導的信號通路起到了作用[28]。

本研究的局限性在于:僅評估了PARP-1基因3個位點的多態(tài)性及相關信號通路與HDP發(fā)病風險的關系,可能無法完全解釋PARP-1基因多態(tài)性與HDP的關系,后期需要檢查更多的基因位點以驗證PARP-1基因多態(tài)性與HDP的關系。另外,由于HDP患者存在明顯的種族差異和群體異質性,本研究對我國研究人群的參考意義較大,而對于國外其他人種的參考意義有所降低;限于樣本量較小,本研究尚未對HDP不同嚴重程度的孕婦PARP-1基因多態(tài)性進行驗證,后期需要增加樣本量,針對不同嚴重程度的患者來論證。

綜上所述,PARP-1基因表達水平及多態(tài)性與HDP發(fā)病密切相關,特別是rs1805414位點CC突變可作為HDP遺傳易感性的敏感指標;NF-κB信號通路在PARP-1參與HDP發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用。