CRISPR/Cas系統(tǒng)在感染性疾病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展*

潘 興,林永紅,楊 柳,馬 可 綜述,于 霞△ 審校

1.重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院,重慶 400016;2.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院/成都市婦女兒童中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川成都 610091

感染性疾病是各種病原微生物感染機(jī)體造成的疾病,如人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)等。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2019年全球死亡原因統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),全球范圍內(nèi)因感染病原體死亡人數(shù)達(dá)1 020萬,占全部死亡病例的18%[1]。截至2022年4月,在全球快速傳播的新型冠狀病毒感染病例已超過5.04億,死亡600萬例[1]?？焖?、靈敏、特異的病原體檢測方法是預(yù)防和控制感染性疾病暴發(fā)的重要保證[2]。根據(jù)WHO的標(biāo)準(zhǔn),最理想的病原體檢測方法應(yīng)低成本、高靈敏度、特異性、即時(shí)和便攜[3]。目前,常用的病原體檢測方法包括:形態(tài)學(xué)檢查、分離培養(yǎng)與鑒定、免疫學(xué)方法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)、基因組測序方法、質(zhì)譜法等。但這些方法存在檢測周期長、操作復(fù)雜、依賴昂貴儀器等缺陷,極大地限制了其在感染性疾病中的應(yīng)用。

規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白(CRISPR/Cas)系統(tǒng)是由細(xì)菌和古細(xì)菌在抵御病毒的過程中演化而來的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[4-6]。當(dāng)病毒感染細(xì)菌時(shí)會(huì)將病毒的DNA切下一部分并整合入CRISPR序列中,CRISPR基因可加工成靶向特定病毒DNA的小向?qū)NA(sgRNA),sgRNA隨即指導(dǎo)Cas核酸酶蛋白對(duì)病毒DNA進(jìn)行精準(zhǔn)切割,從而起到清除外來物的作用[7-8]。理論上,通過改變sgRNA序列可定向識(shí)別切割任一核酸序列[9]。CRISPR/Cas系統(tǒng)最早被應(yīng)用于基因編輯,隨著人們對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)的不斷研究,發(fā)現(xiàn)了其在分子診斷領(lǐng)域的巨大前景。因此,本文針對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)及其在感染性疾病診斷領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)簡介

1.1結(jié)構(gòu) CRISPR/Cas系統(tǒng)主要包括CRISPR基因和Cas基因2個(gè)部分。CRISPR基因包含位于上游的前導(dǎo)序列(leader)、重復(fù)序列(repeat)和間隔序列(spacers)。前導(dǎo)序列啟動(dòng)CRISPR基因轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生一個(gè)長度約為200 bp 的CRISPR RNA(即crRNA),富含AT堿基;有許多高度保守的重復(fù)序列,序列長度24～47 bp,平均長度32 bp,其中包括回文序列5～7 bp,可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu);間隔序列分隔多個(gè)重復(fù)序列,是一系列長度相等的非重復(fù)序列,由病毒等外源DNA被細(xì)菌識(shí)別切割而整合入重復(fù)序列之間,長度為17～84 bp,平均長度為36 bp。Cas基因位于CRISPR基因的上游,被稱為CRISPR的相關(guān)基因。Cas編碼的Cas蛋白為一類核酸酶,在crRNA引導(dǎo)下識(shí)別并切割與crRNA互補(bǔ)的核酸片段。Cas基因也可以編碼解旋酶、聚合酶、RNA結(jié)合酶等,這些酶參與了免疫過程并發(fā)揮免疫功能[8,10-11]。DELTCHEVA等[12]還發(fā)現(xiàn)了位于Cas基因上游的反式編碼的CRISPR RNA(tracrRNA)。tracrRNA與crRNA通過堿基互補(bǔ)作用結(jié)合,從而靶向外源DNA并指導(dǎo)Cas蛋白發(fā)揮核酸酶水解作用[13]。

1.2分類 2011年,MAKAROVA等[14]提出了多元分類法,整合系統(tǒng)發(fā)育、基因序列和結(jié)構(gòu)分析將CRISPR/Cas系統(tǒng)分成三大類:Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型(type Ⅰ～Ⅲ),即僅含有Cas3蛋白為Ⅰ型,僅含Cas9蛋白為Ⅱ型,以及含有Cas10蛋白為Ⅲ型,Ⅰ～Ⅲ都含有Cas1、Cas2。這是最早的CRISPR/Cas系統(tǒng)公認(rèn)的分類方法。2015年,MAKAROVA等[15]利用PSSM矩陣庫綜合分析2 751個(gè)細(xì)菌與真菌的基因組數(shù)據(jù),提出了Ⅳ型與Ⅴ型兩個(gè)新型別,繼而得出更廣泛的分類方式,即將CRISPR/Cas系統(tǒng)分成兩大類:第1類具有多重亞基crRNA效應(yīng)子復(fù)合物,包含多個(gè)執(zhí)行單一功能的Cas蛋白,而第2類效應(yīng)子復(fù)合物的所有功能均由單一Cas蛋白執(zhí)行,如Cas9蛋白。隨后,MAKAROVA等[16]又豐富了CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類,發(fā)現(xiàn)了33個(gè)亞型和靶向RNA切割的Ⅵ型[17]。最新的分類將已鑒定的CRISPR/Cas系統(tǒng)分為兩大類,第1類包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型,標(biāo)志性蛋白分別為Cas3、Cas10、Csf1,第2類包括Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型,標(biāo)志性蛋白為Cas9、Cas12a、Cas13[18]。每一型根據(jù)Cas蛋白的作用位點(diǎn)不同又可分為多種亞型。由于第2類CRISPR/Cas系統(tǒng)用單一、多功能Cas蛋白進(jìn)行基因編輯,相較于第1類系統(tǒng)更為高效簡單,因此一直是研究應(yīng)用的熱點(diǎn)。

2 工作原理

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌對(duì)病毒入侵的免疫防御系統(tǒng),其發(fā)揮功能的機(jī)制分為3個(gè)階段:適應(yīng)、表達(dá)、干擾[14-15]。在適應(yīng)階段,病毒DNA片段被剪切整合進(jìn)CRISPR基因的間隔序列中,細(xì)菌便保留了對(duì)病毒的記憶性,以抵抗病毒的再次入侵。在表達(dá)階段,CRISPR基因的前導(dǎo)序列啟動(dòng)一級(jí)轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生pre-crRNA,然后經(jīng)過加工成熟處理,生成crRNA。在干擾階段,crRNA能引導(dǎo)Cas蛋白識(shí)別目標(biāo)DNA的前間區(qū)序列鄰近序列(PAM)從而引起DNA雙鏈斷裂。

2.1CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9工作原理與免疫機(jī)制類似,不同在于crRNA還需與tracrRNA結(jié)合成sgRNA,sgRNA指導(dǎo)Cas9蛋白識(shí)別外源DNA的PAM序列使靶標(biāo)序列解鏈,同時(shí)Cas9蛋白的HNH與RuvC-like結(jié)構(gòu)域分別剪切crRNA互補(bǔ)鏈和非互補(bǔ)鏈[19]。DNA雙鏈斷裂(DSB)會(huì)啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制包括非同源末端結(jié)合(NHEJ)與同源重組修復(fù)(HDR)[20]。因而改變sgRNA序列即可對(duì)任何DNA進(jìn)行基因編輯。

2.2CRISPR/Cas12 CRISPR/Cas12包括Cas12a和Cas12b。以Cas12a為例,對(duì)比CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用機(jī)制有以下不同:(1)不需tracrRNA幫助crRNA成熟和指導(dǎo)Cas蛋白識(shí)別切割靶標(biāo)序列[21]。(2)Cas12a包含RuvC-like結(jié)構(gòu)域與NuC結(jié)構(gòu)域,不包含HNH結(jié)構(gòu)域,僅RUvC結(jié)構(gòu)域切割DNA雙鏈即順式切割[22]。(3)Cas12a具有反式切割活性,即非特異性DNA剪切活性,能將非靶標(biāo)序列的任意單鏈DNA切割[23]。利用Cas12a的反式切割活性,通過在反應(yīng)系統(tǒng)中加入信號(hào)標(biāo)記的單鏈DNA從而實(shí)現(xiàn)特異基因的檢測。

2.3CRISPR/Cas13 CRISPR/Cas13包括Cas13a、Cas13b、Cas13c和Cas13d。Cas13特點(diǎn)在于它可以識(shí)別剪切單鏈RNA。Cas13a由REC結(jié)構(gòu)域與NUC結(jié)構(gòu)域組成,為雙瓣葉形的球狀蛋白結(jié)構(gòu)。REC結(jié)構(gòu)域包含NTD和Helical-1結(jié)構(gòu)域,其中NUC結(jié)構(gòu)域包括兩個(gè)HEPN結(jié)構(gòu)域、Helical-2結(jié)構(gòu)域以及連接兩個(gè)HEPN結(jié)構(gòu)域的連接結(jié)構(gòu)域(Helical-3)[24-25]。Helical-1負(fù)責(zé)切割crRNA前體使之成熟。HEPN結(jié)構(gòu)域識(shí)別靶標(biāo)RNA的PFS位點(diǎn)(protospacer flanking sites),進(jìn)而激活Cas13a蛋白R(shí)NA酶活性對(duì)靶標(biāo)RNA順式切割,在順式切割后Cas13a還會(huì)對(duì)非靶標(biāo)單鏈RNA進(jìn)行反式切割[17,26]。

3 CRISPR/Cas系統(tǒng)在感染性疾病中的應(yīng)用

3.1CRISPR/Cas9 將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于感染性疾病檢測的首次亮相是在2016年。2016年,PARDEE等[27]研發(fā)了一種能以單堿基分辨率檢測寨卡病毒的紙基傳感器,該檢測系統(tǒng)將等溫RNA擴(kuò)增技術(shù)NASBA、toehold開關(guān)RNA傳感器和CRISPR/Cas9系統(tǒng)相結(jié)合,根據(jù)NASBA反應(yīng)擴(kuò)增的雙鏈DNA有無特異性PAM序列和sgRNA作用靶點(diǎn),使Cas9對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生不同切割活性。未被切割的DNA雙鏈轉(zhuǎn)錄出長鏈RNA而激活傳感器,從而使紙基上發(fā)生顏色變化。2018年,HUANG等[28]建立了一種基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的等溫指數(shù)核酸擴(kuò)增方法(CAS-EXPAR),擴(kuò)增的引物由Cas9/sgRNA復(fù)合物對(duì)目標(biāo)DNA序列定點(diǎn)剪切而產(chǎn)生,從而誘導(dǎo)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生大量DNA,并采用qPCR進(jìn)行檢測。將其用于李斯特菌檢測,靈敏度可達(dá)0.82 a mol/L級(jí)(阿摩爾每升級(jí)),且有識(shí)別單堿基錯(cuò)配的特異性。2020年,WANG等[29]結(jié)合CRISPR/Cas9系統(tǒng)與側(cè)向橫流技術(shù),構(gòu)建了新型的比色生物傳感器CASLFA(CRISPR/Cas9-mediated lateral flow nucleic acid assay),該技術(shù)能夠在1 h內(nèi)對(duì)非洲豬瘟病毒進(jìn)行檢測。

除了利用Cas9的定點(diǎn)切割功能檢測外,對(duì)于失去剪切能力但保留了結(jié)合能力的dCas9(nuclease-deactivated Cas9)也能很好地應(yīng)用于病原體檢測中。2017年,ZHANG等[30]利使用一對(duì)具有熒光素酶分離結(jié)構(gòu)域的dCas9對(duì)兩個(gè)靶向序列進(jìn)行檢測,當(dāng)兩個(gè)熒光素酶的分離結(jié)構(gòu)域靠近時(shí),會(huì)發(fā)生熒光素氧化反應(yīng)產(chǎn)生可檢測的熒光信號(hào);GUK等[31]基于SYBR GREEN Ⅰ熒光染料開發(fā)了dCas9/sgRNA-SG Ⅰ DNA-FISH系統(tǒng):dCas9/sgRNA復(fù)合物能夠特異性識(shí)別靶標(biāo)序列并形成三元復(fù)合物。由于dCas9蛋白帶有His標(biāo)簽,所以利用anti-His磁珠可以將三元復(fù)合物分離,最后加入SYBR GREEN Ⅰ與體系中的靶標(biāo)DNA結(jié)合實(shí)現(xiàn)檢測。該方法成功用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的檢測。2019年,REZA等[32]聯(lián)合dCas9和石墨烯晶體管建立了高靈敏度的便攜電化學(xué)生物傳感器。將dCas9連接到石墨烯晶體管上,當(dāng)dCas9識(shí)別并結(jié)合靶向序列會(huì)引起石墨烯電導(dǎo)率發(fā)生變化,從而可檢測到電信號(hào)。這種方法無需擴(kuò)增,靈敏度達(dá)1.7 fmol/L級(jí)(飛摩爾每升級(jí))。此外,KUMAR等[33]利用了一種能與特定SARS-CoV-2突變株中核酸序列特異結(jié)合的Cas9蛋白(FnCas9),開發(fā)了用于診斷SARS-CoV-2感染的FELUDA(FnCas9 editor-linked uniform detection assay)平臺(tái)。這種Cas9蛋白對(duì)靶標(biāo)序列變化高度敏感,可利用側(cè)向橫流技術(shù)檢測這種特定的Cas9蛋白,從而檢測SARS-CoV-2。

3.2CRISPR/Cas12 最先應(yīng)用于感染性疾病核酸檢測中的是Cas12a,最早于2015年被張鋒團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn),又稱為Cpf1[34]。由于Cas12a既能順式切割靶標(biāo)雙鏈DNA(dsDNA),又能反式切割非靶標(biāo)單鏈DNA(ssDNA),因此在感染性疾病核酸檢測方面較Cas9應(yīng)用更為廣泛。2018年,CHEN等[35]將重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)與CRISPR/Cas12系統(tǒng)結(jié)合,建立了靈敏準(zhǔn)確的病原體檢測系統(tǒng)DETECTR(DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter),成功應(yīng)用于人乳頭狀病毒(HPV)的診斷,靈敏度達(dá)amol/L級(jí)。該檢測系統(tǒng)在反應(yīng)體系中引入分子探針(一端連接熒光基團(tuán),一端連接猝滅基團(tuán)),Cas12a識(shí)別靶標(biāo)序列后產(chǎn)生非特異性切割活性,熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)分離從而釋放熒光信號(hào)。RPA使熒光信號(hào)累積從而提高檢測靈敏度。2020年,DETECTR被用于基于CRISPR/Cas12的SARS-CoV-2檢測,結(jié)合側(cè)向橫流技術(shù)能快速(30～40 min)檢測臨床樣本中SARS-CoV-2[36]。2018年,LI等[37]將檢測系統(tǒng)DETECTR中的RPA擴(kuò)增步驟替換成傳統(tǒng)的PCR研發(fā)了快速、有效的核酸檢測平臺(tái)HOLMES(one hour low-cost multipurpose highly efficient system),其可用于檢測偽狂犬病病毒(DNA病毒)和日本乙型腦炎病毒(RNA病毒)。2019年,YAN等[38]開發(fā)出基于Cas12b和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)的檢測平臺(tái)HOLMESv2。該檢測系統(tǒng)利用了一種來自酸土環(huán)脂芽孢桿菌的Cas12b(AacCas12b),這種Cas12b在48 ℃有最佳的DNA切割活性,由于Cas12b和LAMP的工作溫度相同,可將LAMP擴(kuò)增和Cas12b反式切割整合到一個(gè)恒溫的一步系統(tǒng)中,從而為檢測提供了方便,同時(shí)還能有效消除LAMP反應(yīng)產(chǎn)生的非特異性信號(hào),提高靈敏度。2022年,BHATT等[39]聯(lián)合逆轉(zhuǎn)錄-LAMP(RT-LAMP)、CRISPR/Cas12系統(tǒng)以及側(cè)向橫流技術(shù),建立了一種無需RNA提取步驟并可直觀診斷SARS-CoV-2感染的方法,稱為CLEVER assay。該診斷技術(shù)在保證靈敏度、特異性及速度的情況下,還大大簡化了檢驗(yàn)程序、降低檢測成本,適合于資源有限的地區(qū)進(jìn)行大規(guī)模SARS-CoV-2感染檢測。

為避免移液和開蓋過程造成的污染,SUN等[40]提出一管化的CRISPR/Cas12系統(tǒng)檢測系統(tǒng)OR-DETECTR。在此檢測系統(tǒng)中,將RPA擴(kuò)增體系與Cas12a混合物在一個(gè)管內(nèi)進(jìn)行反應(yīng),2個(gè)體系采用物理隔離方式分開,RPA擴(kuò)增后通過瞬時(shí)離心混合,RPA產(chǎn)物即可被Cas12a識(shí)別切割產(chǎn)生熒光信號(hào)。利用免疫層析試紙條可視化檢測反應(yīng)產(chǎn)物可以簡化儀器,使結(jié)果呈現(xiàn)更為直觀[41-43]。若采用耐熱的AacCas12b和LAMP擴(kuò)增方法,即可一管化混合反應(yīng)且無需物理隔離和離心混合。JOUNG等[44]便是基于這一原理提出了STOPCovid一步化檢測的方法,應(yīng)用于SARS-CoV-2感染的檢測。該檢測方法使用了AacCas12b和LAMP共同反應(yīng)緩沖液,將RT-LAMP擴(kuò)增和切割反應(yīng)混合于一管進(jìn)行,并采用磁珠提取RNA,去掉了乙醇提取和洗脫的過程,簡化了檢測步驟。除了借助儀器監(jiān)測熒光信號(hào),還可直接肉眼觀察。2023年,CHEN等[45]設(shè)計(jì)了一種基于CRISPR/Cas的便攜式猴痘病毒裸眼檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用了CRISPR/Cas12的高選擇性和RPA的等溫核酸擴(kuò)增能力,放大熒光信號(hào),隨即用LED照射反應(yīng)產(chǎn)物可肉眼觀察顏色變化,使用智能手機(jī)捕捉圖像獲得顏色隨時(shí)間的變化。

上述研究均以熒光作為信號(hào)輸出,此外,電化學(xué)傳感作為一種高靈敏度的信號(hào)傳導(dǎo)裝置已被應(yīng)用于基于CRISPR/Cas12的核酸檢測中,使得檢測系統(tǒng)不需要通過擴(kuò)增來增加反應(yīng)靈敏度。DAI等[46]建立了一種名為E-CRISPR的電化學(xué)生物傳感器。在該方法中,亞甲基藍(lán)修飾的ssDNA通過硫醇鍵固定在金電極上,作為電化學(xué)報(bào)告探針。當(dāng)Cas12a識(shí)別靶標(biāo)序列激活反式切割活性,剪切電化學(xué)報(bào)告探針,從而MB從金電極表面釋放并產(chǎn)生峰值電流改變。因此可通過電信號(hào)檢測靶標(biāo)序列的有無。該方法用于HPV的無擴(kuò)增直接檢測,靈敏度為50 pmol/L級(jí)(皮摩爾每升級(jí))。隨后,ZHANG等[47]對(duì)此進(jìn)行了改善,用發(fā)夾狀DNA代替了線性ssDNA,這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使得MB與電極之間距離更近,從而提高了峰值電流,同時(shí)還提高了Cas12a的切割效率,極大地提高了檢測靈敏度。

3.3CRISPR/Cas13 Cas13與靶標(biāo)序列識(shí)別結(jié)合后會(huì)激活對(duì)非靶標(biāo)ssRNA反式切割的活性。2017年,張鋒團(tuán)隊(duì)利用該特性開發(fā)了SHERLOCK技術(shù),該方法先將底物DNA或RNA經(jīng)重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)或逆轉(zhuǎn)錄-RPA(RT-RPA),提高檢測靈敏度,再利用T7轉(zhuǎn)錄酶將擴(kuò)增后的DNA轉(zhuǎn)錄為可被Cas13靶向識(shí)別的RNA,并與LwaCas13、crRNA反應(yīng)液混合[48]。當(dāng)crRNA引導(dǎo)LwaCas13識(shí)別切割靶標(biāo)后,激活LwaCas13對(duì)非靶標(biāo)ssRNA剪切活性,非靶標(biāo)ssRNA兩端的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)因此分離,從而釋放熒光信號(hào)。SHERLOCK技術(shù)整合了等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)RPA和Cas13的檢測能力,將反應(yīng)靈敏度提升至amol/L級(jí)。該團(tuán)隊(duì)利用SHERLOCK成功檢測寨卡病毒和登革熱病毒。后來,多項(xiàng)研究以SHERLOCK技術(shù)為基礎(chǔ)將CRISPR/Cas13a應(yīng)用于HIV、禽流感病毒、SARS-CoV-2、HBV、非洲豬瘟病毒的核酸檢測技術(shù)中[49-53]。2018年,張鋒團(tuán)隊(duì)通過對(duì)SHERLOCK技術(shù)進(jìn)行改進(jìn),推出了SHERLOCKv2[43],將Csm6與Cas13串聯(lián)使用使反應(yīng)靈敏度增加了3.5倍。Csm6是Ⅲ型CRISPR/Cas系統(tǒng)中的二聚體RNA內(nèi)切核酸酶,基于其在信號(hào)放大中的內(nèi)源性功能,能提高RNA檢測的靈敏度。此外,還根據(jù)不同Cas13剪切活性設(shè)計(jì)具有不同序列、帶有不同熒光基團(tuán)的非靶標(biāo)分子,從而實(shí)現(xiàn)多通道檢測平臺(tái)。2021年,LIU等[54]也將Csm6和Cas13a聯(lián)用,研發(fā)了快速串聯(lián)集成核酸酶檢測(FIND-IT)的無擴(kuò)增技術(shù)。由于減少了核酸擴(kuò)增步驟大大加快了檢測速度,能夠快速診斷SARS-CoV-2(約20 min)且不犧牲測試的靈敏度,極大適用于感染性疾病的即時(shí)診斷。為優(yōu)化RNA提取步驟以適應(yīng)現(xiàn)場快速檢測,MYHRVOLD等[55]將HUDSON(指一種通過加熱或化學(xué)還原反應(yīng)來溶解病毒顆粒和滅活RNA酶的方法)與SHERLOCK結(jié)合,建立了一種能直接從體液中檢測病毒的方法。經(jīng)HUDSON處理過的尿液或唾液可以直接進(jìn)行RPA反應(yīng),無需提取純化RNA。該方法能在2 h內(nèi)檢測出低于單拷貝(1 copy/μL)的寨卡病毒和登革熱病毒。ARIZTI-SANZ等[56]對(duì)HUDSON進(jìn)行優(yōu)化,縮短了HUDSON的孵育時(shí)間,并利用智能手機(jī)攝像頭實(shí)時(shí)監(jiān)測管內(nèi)熒光讀數(shù)變化,避免了反復(fù)開蓋造成的污染,開發(fā)了SHINE(streamlined high lighting of infections to navigate epidemics)檢測系統(tǒng)。該檢測方法可在10 min內(nèi)快速滅活鼻咽拭子和唾液中的SARS-CoV-2,檢測時(shí)間縮短到50 min,極大地提高了診斷能力。

類似于基于CRISPR/Cas12b的STOPCovid檢測方法,MAHAS等[57]發(fā)現(xiàn)了一種來自盲腸熱梭狀芽孢桿菌的Cas13a(TccCas13a),這種耐熱Cas13a與LAMP的工作溫度相同,能于一管混合反應(yīng),因此建立了基于CRISPR/Cas13a檢測SARS-CoV-2的一管化系統(tǒng),稱為OPTIMA-dx。若采用側(cè)向橫流讀取熒光信號(hào),必須打開反應(yīng)管讀數(shù)增加了交叉污染的概率。而該方法用便攜式熒光觀察儀代替?zhèn)认驒M流讀數(shù),智能手機(jī)實(shí)時(shí)讀取和收集檢測結(jié)果,整個(gè)檢測過程全封閉無需開蓋,實(shí)現(xiàn)了一體化檢測病毒的模式。

微流控技術(shù)具有小型化、集成化和自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)[58]。微流控技術(shù)與CRISPR系統(tǒng)的結(jié)合可以彌補(bǔ)基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測技術(shù)的缺陷,在病原體的診斷上具有巨大前景。QIN等[59]將CRISPR/Cas13a與微流控技術(shù)結(jié)合,建立了一種用于檢測埃博拉RNA的自動(dòng)化POC系統(tǒng)。該檢測系統(tǒng)不需要核酸擴(kuò)增,能同時(shí)進(jìn)行數(shù)十個(gè)樣本中埃博拉病毒的檢測,5 min內(nèi)檢測限可達(dá)20 PFU/mL(PFU為空斑形成單位,PFU/mL為感染性滴度的單位)。ACKERMAN等[60]將微孔陣列芯片與CRISPR/Cas13a結(jié)合,開發(fā)了一種用于核酸多重檢測的組合陣列系統(tǒng)(CARMEN)。該平臺(tái)能夠?qū)崿F(xiàn)169種人類病毒的區(qū)分、甲型流感病毒的全面分型以及數(shù)十種HIV耐藥突變的多重鑒定。受此啟發(fā),WELCH等[61]設(shè)計(jì)了一種用于高通量檢測SARS-CoV-2及其他呼吸道病毒的檢測系統(tǒng),稱為mCARMEN。mCARMEN增加了監(jiān)控功能,能在1 d內(nèi)測試數(shù)百個(gè)樣本,能夠快速檢測包括SARS-CoV-2在內(nèi)的21種呼吸道病毒。

4 小結(jié)與展望

現(xiàn)有的病原體檢測方法大多操作復(fù)雜、耗時(shí)長且依賴昂貴的儀器設(shè)備,而CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一種強(qiáng)大的基因編輯手段,能結(jié)合核酸擴(kuò)增技術(shù)PCR、RPA、LAMP等,將核酸剪切或結(jié)合的過程轉(zhuǎn)換為熒光、比色、電子等信號(hào),并通過熒光檢測儀、LFAD、肉眼、智能手機(jī)、電化學(xué)傳感器、微流控芯片等讀取從而檢測病原體核酸?；贑RISPR/Cas系統(tǒng)設(shè)計(jì)開發(fā)的新型核酸檢測技術(shù)具有突出優(yōu)勢:(1)檢測周期短、一般2 h內(nèi)可出結(jié)果;(2)靈敏度高,可實(shí)現(xiàn)amol/L級(jí)的檢測,而傳統(tǒng)PCR檢測限為fmol/L級(jí);(3)特異性強(qiáng)、能識(shí)別單堿基變化;(4)簡單便攜、不依賴昂貴的儀器和實(shí)驗(yàn)環(huán)境,更適用于床旁即時(shí)檢測(POCT);(5)結(jié)果讀取方便,通過熒光檢測和肉眼讀取結(jié)果。這些優(yōu)勢必將使得CRISPR/Cas檢測技術(shù)在感染性疾病檢測領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。

然而,CRISPR診斷工具仍然存在一些局限性:(1)樣本中靶標(biāo)濃度低,大多需要借助核酸擴(kuò)增技術(shù),使檢測步驟煩瑣,易造成污染,同時(shí)容易出現(xiàn)假陽性或假陰性的檢測結(jié)果;(2)CRISPR/Cas技術(shù)的脫靶效應(yīng)會(huì)造成假陰性的檢測結(jié)果。在sgRNA的引導(dǎo)下Cas蛋白識(shí)別靶標(biāo)序列過程中,可能會(huì)與非靶點(diǎn)核酸序列部分錯(cuò)配,造成錯(cuò)誤切割;(3)目前大多數(shù)基于CRISPR/Cas系統(tǒng)建立的分子診斷平臺(tái)還難以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病原體的高通量檢測;(4)需要根據(jù)已知病原體的基因序列來設(shè)計(jì)crRNA,難以應(yīng)對(duì)新出現(xiàn)或發(fā)生突變的病原體的檢測;(5)sgRNA精準(zhǔn)識(shí)別靶標(biāo)序列依賴于PAM序列,且不同類型Cas蛋白識(shí)別不同PAM序列。這一特性雖然增加了CRISPR/Cas系統(tǒng)的特異性,但也限制了靶標(biāo)區(qū)域的選擇,同時(shí)降低了CRISPR/Cas系統(tǒng)的靈活性。

基于以上挑戰(zhàn),未來可在如下方面進(jìn)行改進(jìn)。(1)簡化CRISPR/Cas診斷程序:采用一系列措施減少工作步驟,如優(yōu)化或免除核酸提取及擴(kuò)增,可通過使用更高靈敏度的檢測設(shè)備如電化學(xué)傳感器,結(jié)合免疫磁富集、微流控富集技術(shù),開發(fā)對(duì)靶標(biāo)序列變化高敏感的新型Cas蛋白,豐富CRISPR工具箱等手段。目前雖然已出現(xiàn)了基于CRISPR/Cas系統(tǒng)無需擴(kuò)增的核酸檢測技術(shù),但仍存在靈敏度偏低的問題,因此未來還需對(duì)體系進(jìn)一步改善。此外,可引入智能設(shè)備實(shí)時(shí)監(jiān)測結(jié)果,數(shù)據(jù)自動(dòng)上傳,避免開蓋降低污染,同時(shí)使檢測結(jié)果讀取簡便直接。(2)降低CRISPR/Cas系統(tǒng)脫靶效應(yīng)和PAM約束:Cas 蛋白作為 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的核心元件之一,其結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制在很大程度上決定了該系統(tǒng)的功能走向,因此可對(duì)Cas蛋白進(jìn)行工程化改造,設(shè)計(jì)高靶向特異性和更寬范圍的PAM識(shí)別序列以優(yōu)化提升CRISPR/Cas系統(tǒng)。對(duì)crRNA優(yōu)化設(shè)計(jì)可提高Cas蛋白特異性,進(jìn)而減少脫靶效應(yīng)。除了改造CRISPR/Cas系統(tǒng)自身之外,還可以通過外源蛋白結(jié)構(gòu)域的引入。(3)設(shè)計(jì)多通道或高通量檢測系統(tǒng):新材料、新技術(shù)與CRISPR系統(tǒng)的結(jié)合是實(shí)現(xiàn)高通量檢測的關(guān)鍵。CARMEN平臺(tái)即是將微孔陣列芯片與CRISPR/Cas13a結(jié)合成功用于核酸多重檢測。微流控技術(shù)以其低成本、小體積和自動(dòng)化的優(yōu)勢在高通量檢測領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注。將微流控技術(shù)與新興材料,如納米材料、水凝膠相結(jié)合,將會(huì)使CRISPR/Cas檢測平臺(tái)向高通量、便攜化、自動(dòng)化發(fā)展的重要研究方向發(fā)展。盡管CRISPR/Cas技術(shù)存在一定局限,但其無可比擬的優(yōu)勢仍使其在核酸檢測領(lǐng)域擁有革命性的應(yīng)用潛力,相信隨著科學(xué)家的不斷研究和技術(shù)的不斷發(fā)展,CRISPR/Cas技術(shù)有望能成為感染性疾病診斷領(lǐng)域的利器。