一株雞源血清4 型禽腺病毒的分離鑒定及動物回歸試驗

吳 植，黃 佳，吳 雙，謝 軍，顧陳怡，徐 艷，張 聰，袁慧莎

（江蘇農牧科技職業(yè)學院 江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室江蘇現代畜牧與新獸藥工程技術中心，江蘇 泰州 225300）

禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)歸屬于腺病毒科禽腺病毒屬，因為群特異性抗原不同分為三群。我國流行的禽腺病毒以I 群禽腺病毒（Fowl aviadenovirusgroupⅠ,FAdV-Ⅰ）為主，發(fā)病率逐年增加。Ⅰ群禽腺病毒有12 個血清型(FAdV 1-12)，近幾年我國主要流行的禽腺病毒血清型為FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b 和FAdV-11 型，其中由血清4型I 群禽腺病毒（FAdV-4）引起的雞心包積水- 肝炎綜合征(IBH-HPS)對家禽養(yǎng)殖危害最大。由于不同血清型的混合感染以及與其他病毒形成混合感染和繼發(fā)感染，其復雜性對疫苗的研制以及對防控FAdV-4 產生較大困難，給國內養(yǎng)雞行業(yè)帶來嚴重的經濟損失。本研究對廣西送檢疑似感染4 型禽腺病毒病死雞組織通過病毒分離，PCR 擴增與序列測定，確定分離出一株血清4 型禽腺病毒并進行了動物回歸試驗，為臨床開展該病的綜合防控提供了一定的技術指導。

1 材料和方法

1.1 病料來源及試驗動物2021 年廣西送檢一份疑似血清4 型禽腺病毒感染的患病雞；SPF 種雞蛋購自山東昊泰實驗動物繁育有限公司，由本實驗室自行孵化至7 日齡或出雛，雛雞轉移隔離器中飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑Viral RNA/DNA Kit DNA/RNA提取試劑盒購自CWBIO，2×Taq Master Mix、Fast-Pure Gel DNA Extraction Mini Kit 凝膠回收試劑盒、FastPure plasmid Mini Kit 質粒提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，DNA marker 購自Solarbio，VETEC 瓊脂粉購自上海百研生物科技有限公司，克隆載體T-easy 購自Promega 公司，E.coli DH5α 購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 病毒分離無菌采取0.3 g 病死雞肝臟，放入裝有碾磨珠和900 μLPBS 緩沖液的滅菌碾磨管中，經FastPrep-24TM5G 高速勻漿儀研磨1 min，反復凍融3 次，5000 rpm，離心10 min，取組織研磨上清液用0.22 μm 無菌濾器過濾除菌，采用卵黃囊接種方法接種7 日齡SPF 雞胚，0.2 mL/枚，37 ℃孵育，照蛋2 次/d，剔除24 h 內死亡雞胚，繼續(xù)孵化至5 d，將未死亡雞胚在4 ℃條件下放置4 h 以上，收集雞胚的尿囊液用0.22 μm 無菌濾器過濾再次接種7 日齡SPF 雞胚，連續(xù)盲傳3 代，收集尿囊液離心取上清液通過PCR 方法進行病毒鑒定。

1.4 血凝實驗取50 μL 尿囊液于96 孔血凝板中，依次用生理鹽水進行倍比稀釋至11 孔，棄去液體，第12 孔加50 μL 生理鹽水做陰性對照，每孔加入50 μL 的1%新鮮制備的雞紅細胞，37℃反應30 min 后觀察結果，觀察尿囊液是否具有凝集紅細胞的能力。

1.5 PCR 鑒定與序列測定根據GenBbank 發(fā)表的Hexon 保守序列設計引物，FAdV-F：CAACTACATCGGGTTCAGGGATAACTTC，FAdV-2：CCAGTT TCTGTGGTGGTTGAAGGGGTT，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。參照DNA/RNA 提取試劑盒說明書進行尿囊液病毒基因組提取，取2 μL病毒DNA 為模板進行PCR 擴增。反應體系為25 μL：2×Taq Master Mix12.5 μL，上游引物和下游引物各1 μL(20μmoL/L）、病毒基因組2 μL、滅菌水8.5 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR 產物于100 V電壓下經1.5%瓊脂糖凝膠進行核酸電泳，觀察目的片段大小。將純化的目的片段克隆至pGEM T-easy載體，將重組質粒送南京擎科生物科技有限公司測序，對測序結果通過DNAStar 軟件進行同源性分析。

1.6 動物回歸實驗以0.2 mL/只的劑量將接毒收集到的尿囊液以肌肉注射方式接種5 只3 周齡SPF 雛雞，另設對照組5 只以0.2 mL/只的劑量肌肉注射PBS 緩沖液，接毒組與對照組分籠隔離飼養(yǎng)，每日觀察記錄雞的臨床表現和發(fā)病情況，連續(xù)觀察10 d。取死亡雞肝臟組織進行研磨了提取病毒核酸進行PCR 鑒定。

2 結 果

2.1 病毒分離將研磨好的組織上清液接種卵黃囊盲傳三代，雞胚在24 h 后出現死亡，48～72 h 為死亡高峰期。死亡雞胚主要表現皮下、背部出血，胚體小于同日齡正常雞胚，生長發(fā)育緩慢（圖1）。

圖1 雞胚組織病變

2.2 血凝實驗通過尿囊液進行血凝實驗，結果顯示收獲的尿囊液不能使1%雞紅細胞凝集，排除了禽流感、新城疫等血凝性病毒的感染。

2.3 PCR 鑒定瓊脂糖凝膠電泳結果顯示（圖2），病料接種雞胚收集的尿囊液經PCR 擴增得到的條帶長度約667 bp，與預期擴增條帶大小相符，送檢發(fā)病雞感染了禽腺病毒。

圖2 尿囊液PCR 檢測結果

2.4 測序與同源性分析測序成功的基因序列與GenBank 上禽腺病毒參考株的序列進行比較分析。結果顯示，分離株與GenBank 上4 型FAdV 參考株同源性達99.2%，證實分離得到的毒株為血清4 型FAdV，將此毒株命名為GX20210602。

2.5 動物回歸實驗SPF 雞接種病毒后2 d 內無明顯臨床癥狀。第3 d 有雛雞出現精神沉郁，不喜動，并出現雛雞死亡，死雞剖檢可見淡黃色透明心包積液，腎臟微微腫大，肝臟出血腫大，邊緣呈土黃色（圖3）。采集病死雞和攻毒第5 d 的雞肝臟，提取病毒核酸后進行PCR 鑒定，PCR 結果顯示病死雞檢測陽性，對照組為陰性。

圖3 剖檢組織病變

3 討 論

Ⅰ群禽腺病毒是國內家禽與野禽常見的傳染性病原，血清4 型禽腺病毒在國內流行的Ⅰ群腺病毒占主要地位，雞心包積水- 肝炎綜合征是血清4型的顯著特征，主要感染3～5 周齡的雛雞，常呈隱性感染，感染雞群免疫力下降，易于其他病毒形成混合感染，造成死亡率升高。研究證明腺病毒在肝臟，胰腺和腸管容易繁殖存活，Ⅰ群禽腺病毒可在雞胚中繁殖，矯海婷等發(fā)現卵黃囊中的存在病毒滴度最高。本研究對送檢有心包積液、肝炎臨床癥狀，疑似感染FAdV-4 病料對肝組織研磨上清液，采用卵黃囊接種雞胚方式進行擴增分離得到病毒，對分離毒株進行病毒鑒定，測序分析等一系列實驗。

隨著分子生物學的不斷發(fā)展，PCR 方法因敏感性、檢測效率高，在檢測腺病毒方面應用廣泛。禽腺病毒為DNA 病毒，六鄰體蛋白(Hexon)是最主要的結構蛋白，對致病性密切相關，由于不同血清型病毒的Hexon 基因高度保守，根據Hexon 基因設計合成的特異性引物進行PCR 檢測技術可以對不同的血清型進行診斷。本實驗根據送檢病雞的臨床癥狀判斷FAdV-4 感染，根據Hexon 基因序列設計合成一對特異性引物，對分離毒株進行PCR 擴增，結果顯示擴增條帶與預期大小一致，懷疑該分離株為4 型禽腺病毒，切下目的條帶進行純化回收，與克隆載體進行連接轉化，提取重組質粒，送至南京擎科生物科技有限公司進行測序，通過與GenBank 發(fā)布的Hexon 基因序列對比，發(fā)現分離株與4 型FAdV 參考株序列同源性達99.2%，證明分離得到的毒株為血清4 型Ⅰ群禽腺病毒，將此毒株命名為GX20210602。對GX20210602 毒株進行動物回歸實驗，剖檢病死雞可見肝臟出血，邊緣呈現土黃色，心包有淡黃色積液產生，腎臟腫大較明顯，實驗結果符合FAdV-4 毒株的臨床病理變化。

禽腺病毒可以垂直和水平傳播，能長期潛伏于雞群體內及排泄物中，傳播范圍廣，對禽腺病毒的防治造成困難，這一株血清4 型禽腺病毒毒株的分離鑒定，為進一步研制血清型疫苗，以及對禽腺病毒的防控提供材料。