基于RhoA/ROCK信號通路探討人參皂苷Rg2對曲妥珠單抗引起的大鼠心功能及心肌細(xì)胞損傷的影響

孟培培,王 蓓,劉 光,董魁星,麻繼臣

隨著生活習(xí)慣的改變和生活壓力的增加,全球惡性腫瘤發(fā)生率均呈上升趨勢,乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢[1]。相關(guān)研究顯示,人表皮生長因子受體2(HER2)是一種跨膜受體樣蛋白,在乳腺癌病人體內(nèi)過表達(dá)[2],HER2陽性乳腺癌具有侵襲能力強(qiáng)、轉(zhuǎn)移率高等特點(diǎn),對常規(guī)放療、化療不敏感,易復(fù)發(fā),預(yù)后不良[3]。曲妥珠單抗(Trastuzumab,商品名:赫賽汀)是一種重組人源化單克隆抗體,研究證實(shí)其可靶向HER2抑制乳腺癌細(xì)胞增殖,發(fā)揮顯著的治療效果,提高HER2陽性乳腺癌病人存活率[4-5]。曲妥珠單抗的抗腫瘤效果值得肯定,隨著用藥時間的延長和用藥劑量的增加,對病人心臟功能具有明顯的副作用[6],如充血性心力衰竭、高血壓、缺血性心臟病、血栓栓塞性疾病等[7-8]。人參皂苷是我國傳統(tǒng)中藥人參的主要有效成分之一,是一種糖氧苷類化合物[9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,人參皂苷對心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均具有不同程度的保護(hù)作用[10],但其對曲妥珠單抗引起的心功能損傷影響尚未明確。RhoA/RhoA相關(guān)蛋白激酶(ROCK)信號通路是機(jī)體內(nèi)的一種基礎(chǔ)信號通路,參與多種生命活動,有研究顯示,抑制RhoA/ROCK信號通路的表達(dá)可有效抑制炎癥與氧化應(yīng)激發(fā)生,減少細(xì)胞凋亡[11]。本研究采用曲妥珠單抗引起大鼠心功能受損及曲妥珠單抗培養(yǎng)心肌細(xì)胞H9c2,探討人參皂苷Rg2調(diào)控RhoA/ROCK信號通路對心功能及心肌細(xì)胞損傷的影響,為臨床應(yīng)用人參皂苷Rg2預(yù)防曲妥珠單抗引起的心功能受損提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞

無特定病原體(SPF)級Wistar雌性大鼠30只,8周齡,體質(zhì)量為200～220 g,購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心,動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(冀)2018-004。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例進(jìn)行,符合“3R”原則。心肌細(xì)胞H9c2由美國ATCC細(xì)胞庫提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

曲妥珠單抗(19/108)購自美國NIBSC公司;人參皂苷Rg2(YT64382)購自北京伊塔生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基(iCell0001)購自上海賽百慷生物技術(shù)有限公司;肌酸激酶同工酶(CK-MB)檢測試劑盒(SEKR-0059)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(BC0685)購自北京索萊寶生物技術(shù)公司;腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測試劑盒(H052-1)、白細(xì)胞介素(IL)-6檢測試劑盒(H007-1-1)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(A003-1-2)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(A001-3-2)購自南京建成生物工程研究所;膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒(SOS-174)購自北京凱詩源生物科技有限公司;RhoA抗體(ab187027)、ROCK抗體(ab45171)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(ab6721)購自英國Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

LOGIQ V3超聲診斷儀購自南京貝登醫(yī)療股份有限公司;CytoFLEX SRT桌面型流式細(xì)胞分選儀購自貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司;Miulab GIS-500凝膠成像分析系統(tǒng)購自北京乾明基因技術(shù)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及處理

將Wistar雌性大鼠隨機(jī)分為對照組、曲妥珠單抗組(Trz組)及曲妥珠單抗+人參皂苷Rg2干預(yù)組(Trz+Rg2組),每組10只。曲妥珠單抗采用專屬溶媒溶解后得到22 mg/mL溶液,加入生理鹽水稀釋至2 mg/mL。根據(jù)人體用藥量與體表面積換算得到大鼠注射用量。除對照組外,其余兩組給予曲妥珠單抗尾靜脈注射50.4 mg/kg[12],每2 d注射1次,共注射7次。Trz+Rg2組首次注射曲妥珠單抗24 h給予人參皂苷Rg 20 mg/kg[13]灌胃,每日1次,共給藥28 d。

1.4.2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將心肌細(xì)胞H9c2培養(yǎng)于含10%磷酸緩沖鹽溶液(FBS)和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件為37 ℃、5%二氧化碳。細(xì)胞融合度≥80%時,將細(xì)胞分為對照組、Trz組(100 μg/mL Trz,37 ℃培養(yǎng)24 h)、Trz+Rg2組(100 μg/mL Trz,37 ℃培養(yǎng)24 h后,于200 μmol/L人參皂苷Rg2中37 ℃培養(yǎng)12 h)[14]。

1.4.3 心功能指標(biāo)測量

腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠,將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺,剪去胸前雜毛,采用超聲診斷儀于胸骨旁左室長軸切面處測定左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)等各項(xiàng)心功能指標(biāo),并計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室短軸縮短率(LVFS),其中LVEF(%)=(LVEDD3-LVESD3)/LVEDD3×100%,LVFS(%)=(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100%。

1.4.4 心肌損傷血清標(biāo)志物及血清炎性因子水平檢測

固定已麻醉的大鼠,腹主動脈取血約3 mL,靜置30 min,4 ℃,以3 000 r/min離心15 min取上清(血清),采用試劑盒測定血清CK-MB、LDH及TNF-α、IL-6含量。

1.4.5 心肌組織與心肌細(xì)胞中氧化應(yīng)激水平檢測

取血后處死大鼠,開胸分離心肌組織,剝除多余組織,一部分心肌組織-80 ℃凍存,另一部分心肌組織剪碎勻漿后取上清液,采用試劑盒檢測上清液中MDA含量及SOD活性。收集培養(yǎng)后的各組H9c2細(xì)胞培養(yǎng)液,以3 000 r/min離心5 min收集上清液,進(jìn)行上述指標(biāo)檢測。

1.4.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡情況

收集培養(yǎng)后的各組H9c2細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL,先加入10 μL的Annexin V-FITC,再加入5 μL的PI,混合均勻,避光孵育10 min,采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.4.7 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測心肌組織與H9c2細(xì)胞中RhoA/ROCK信號通路相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

收集培養(yǎng)后的各組H9c2細(xì)胞,并取出-80 ℃凍存的心肌組織,采用RIPA高效蛋白裂解液提取總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白定量。分別取30 μg蛋白上樣,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜,5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h。洗膜后加入RhoA、ROCK、Bax、Bcl-2、GAPDH一抗,4 ℃孵育過夜,再次洗膜,加入二抗室溫孵育1 h,加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑顯影,凝膠成像分析系統(tǒng)拍攝圖像并分析條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參蛋白,計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 人參皂苷Rg2對曲妥珠單抗誘導(dǎo)大鼠心功能指標(biāo)的影響

與對照組比較,Trz組大鼠LVEDD、LVESD升高,LVEF、LVFS降低(P<0.05);與Trz組比較,Trz+Rg2組大鼠LVEDD、LVESD降低,LVEF、LVFS升高(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較(±s)

2.2 人參皂苷Rg2對曲妥珠單抗誘導(dǎo)大鼠心肌損傷及炎癥反應(yīng)的影響

與對照組比較,Trz組大鼠血清CK-MB、LDH及TNF-α、IL-6含量均升高(P<0.05);與Trz組比較,Trz+Rg2組大鼠血清CK-MB、LDH及TNF-α、IL-6含量均降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠血清CK-MB、LDH及TNF-α、IL-6含量比較(±s)

2.3 人參皂苷Rg2對曲妥珠單抗誘導(dǎo)大鼠心肌組織和H9c2細(xì)胞中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與對照組比較,Trz組大鼠心肌組織與H9c2細(xì)胞中MDA水平均升高,SOD活性下降(P<0.05);與Trz組比較,Trz+Rg2組大鼠心肌組織與H9c2細(xì)胞中MDA水平均降低,SOD活性升高(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠心肌組織與心肌細(xì)胞中MDA水平、SOD活性比較(±s)

2.4 人參皂苷Rg2對曲妥珠單抗誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響及細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況

與對照組比較,Trz組H9c2細(xì)胞凋亡率升高,H9c2細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)下降(P<0.05);與Trz組比較,H9c2細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05),H9c2細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)下降(P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。詳見圖1、圖2和表4。

圖1 各組H9c2細(xì)胞凋亡情況

圖2 各組H9c2細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)條帶圖

表4 各組H9c2細(xì)胞凋亡率與細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較(±s)

2.5 人參皂苷Rg2對曲妥珠單抗誘導(dǎo)大鼠心肌組織與H9c2細(xì)胞RhoA、ROCK蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較,Trz組大鼠心肌組織與H9c2心肌細(xì)胞RhoA、ROCK蛋白表達(dá)均升高(P<0.05);與Trz組比較,Trz+Rg2組大鼠心肌組織與H9c2細(xì)胞中RhoA、ROCK蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)。詳見圖3、表5。

圖3 各組大鼠心肌組織與H9c2心肌細(xì)胞中RhoA、ROCK蛋白表達(dá)條帶圖

表5 各組大鼠心肌組織與H9c2心肌細(xì)胞中RhoA、ROCK蛋白表達(dá)比較(±s)

3 討 論

HER2作為一種促癌基因表達(dá)產(chǎn)物,可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲[2],HER2相關(guān)信號通路在心肌組織與血管內(nèi)皮損傷中發(fā)揮一定的保護(hù)作用,具有促進(jìn)血管內(nèi)皮生長、減輕氧化應(yīng)激損傷及抗纖維化等作用[15]。目前臨床常見的抗HER2靶向治療手段為曲妥珠單抗治療[16]。多項(xiàng)研究顯示,曲妥珠單抗治療乳腺癌可提高病人預(yù)后生存率,同時對病人心臟功能有不良影響,主要表現(xiàn)為LVEF降低、心力衰竭、心動過速等心臟毒性癥狀[17-18],同時影響HER2相關(guān)通路表達(dá),導(dǎo)致心肌受損嚴(yán)重,誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生,最終造成心肌細(xì)胞大量凋亡[19]。本研究結(jié)果顯示,注射過曲妥珠單抗的大鼠LVEDD、LVESD升高,LVEF、LVFS降低,同時心肌受損血清指標(biāo)CK-MB和LDH升高,提示曲妥珠單抗導(dǎo)致大鼠心功能受損模型建立成功。本研究結(jié)果表明,與對照組比較,Trz組大鼠血清TNF-α、IL-6含量及心肌組織與H9c2細(xì)胞中MDA含量升高,SOD活性降低,H9c2細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)升高,Bcl-2蛋白表達(dá)下降,且H9c2細(xì)胞凋亡率升高,提示曲妥珠單抗誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生,導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。

有研究顯示,人參皂苷Rg2在抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗纖維化及神經(jīng)保護(hù)方面發(fā)揮著重要作用[20]。Li等[21]研究顯示,人參皂苷Rg2在心肌梗死小鼠體內(nèi)可發(fā)揮抗心肌細(xì)胞纖維化、抑制膠原蛋白沉積和改善心功能的作用。本研究結(jié)果顯示,人參皂苷Rg2干預(yù)后,曲妥珠單抗引起的大鼠心功能受損減輕,LVEF、LVFS升高,CK-MB和LDH水平降低,提示人參皂苷Rg2可有效逆轉(zhuǎn)曲妥珠單抗對心功能損傷的影響。人參皂苷Rg2干預(yù)后,曲妥珠單抗誘導(dǎo)的大鼠血清TNF-α、IL-6含量及心肌組織與H9c2細(xì)胞中MDA含量降低,SOD活性升高,H9c2細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)下降,Bcl-2蛋白表達(dá)升高,且H9c2細(xì)胞凋亡率降低,說明人參皂苷Rg2對曲妥珠單抗引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)有明顯的改善作用,通過下調(diào)Bax蛋白表達(dá),上調(diào)Bcl-2表達(dá),抑制H9c2細(xì)胞凋亡。

RhoA通過其下游效應(yīng)因子ROCK參與各種細(xì)胞生理活動,與心肌細(xì)胞凋亡及心肌梗死具有密切聯(lián)系[22]。有研究表明,心肌缺血再灌注過程中,RhoA、ROCK表達(dá)水平上調(diào),引起核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB磷酸化,誘導(dǎo)炎性細(xì)胞的浸潤與募集,促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生[23]。RhoA/ROCK信號通路通過促進(jìn)活性氧產(chǎn)生,參與氧化應(yīng)激反應(yīng)[24]; RhoA/ROCK信號通路可被細(xì)胞中多種途徑激活,參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25]。本研究結(jié)果顯示,曲妥珠單抗誘導(dǎo)后大鼠心肌組織與H9c2細(xì)胞中RhoA、ROCK蛋白表達(dá)均上調(diào),提示曲妥珠單抗可誘導(dǎo)RhoA/ROCK信號通路激活。說明RhoA/ROCK信號通路可能參與氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)過程,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。采用人參皂苷Rg2干預(yù)后,曲妥珠單抗誘導(dǎo)的大鼠心肌組織與H9c2細(xì)胞中RhoA、ROCK蛋白表達(dá)均下調(diào),提示人參皂苷Rg2可抑制RhoA/ROCK信號通路表達(dá),從而抑制氧化應(yīng)激,減輕炎癥反應(yīng),改善心肌細(xì)胞凋亡,恢復(fù)心功能。

綜上所述,人參皂苷Rg2可減輕曲妥珠單抗引起的心功能障礙和心肌細(xì)胞損傷,可能通過調(diào)控RhoA/ROCK信號通路發(fā)揮作用。本研究為臨床應(yīng)用曲妥珠單抗治療乳腺癌的過程中聯(lián)合人參皂苷Rg2輔助減輕心臟毒性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。