大耳白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與生物學(xué)鑒定

周世瑩， 劉晏辰， 張洋， 楊雪松， 關(guān)偉軍， 高揚(yáng)*

（1.首都體育學(xué)院體育教育訓(xùn)練學(xué)院，北京 100191； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

干細(xì)胞的應(yīng)用前景不斷擴(kuò)大，其體外多向分化潛力、造血功能、促進(jìn)移植、免疫調(diào)節(jié)和自我復(fù)制的優(yōu)勢(shì)也引起了人們的重視[1-2]。間充質(zhì)干細(xì)胞最初在骨髓中分離鑒定出來(lái)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)是干細(xì)胞家族的重要成員，來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層[3-6],具有自我復(fù)制和多向分化潛能。間充質(zhì)干細(xì)胞可以在體內(nèi)或體外的特定環(huán)境中被誘導(dǎo)分化成脂肪、骨骼、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝臟、心臟、皮膚等多種細(xì)胞，即使是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的培養(yǎng)和冷凍保存，依然具備多向分化的潛力，可以作為一種優(yōu)質(zhì)的種子細(xì)胞，用來(lái)治療、修復(fù)、補(bǔ)充受損或缺損的肝、肌肉、以及衰老和病變所致的組織器官損傷[7-9]。隨著干細(xì)胞技術(shù)越來(lái)越成熟，其能夠再造一種全新的、正常的甚至更年輕的的細(xì)胞、組織和器官[10-11]。由于間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源廣泛，易于分離培養(yǎng)，并且具有較強(qiáng)的分化潛能和自體移植等優(yōu)點(diǎn)，研究者認(rèn)為其是不久即將被引入臨床治療的最優(yōu)干細(xì)胞[12-14]。日本大耳白兔是常用的試驗(yàn)動(dòng)物，其BMSCs 方便采集，易于培養(yǎng)，適合生物學(xué)特性研究和應(yīng)用[5,15-17]。本研究以日本大耳白兔BMSCs為材料，采用全骨髓貼壁法進(jìn)行分離培養(yǎng)和多功能分化研究，建立日本大耳白兔BMSCs 細(xì)胞系及鑒定技術(shù)平臺(tái)，為利用BMSCs 進(jìn)行組織工程研究和動(dòng)物遺傳資源的保存提供參考，同時(shí)也為干細(xì)胞療法和干細(xì)胞應(yīng)用技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物 日本大耳白胎兔1 周齡，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)基地提供。

1.1.2主要試劑與儀器 DMEM/F12、L-DMEM、胎牛血清FBS、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、地塞米松、DAPI染色液、ITS均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；抗壞血鹽酸、β-甘油磷酸、L-脯氨酸、吲哚美辛、Ⅰ胰島素、IBMX、油紅O、V 型膠原酶、胰蛋白酶、Triton X-100 均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；HGF、Bfgf 均購(gòu)自美國(guó)Peprotech 公司；RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 購(gòu)自TaKaRa 公司；茜素紅染液、冰醋酸、無(wú)水甲醇、多聚甲醛均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；山羊封閉血清、FITC標(biāo)記山羊抗兔二抗均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；阿利新藍(lán)購(gòu)自北京中衫金橋生物有限公司；Trizol 購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司；100×青霉素、100×鏈霉素均購(gòu)自北京索萊寶公司；CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、CD45 抗體均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Giemsa染液購(gòu)自北京佳辰科技有限公司。HF100 37.5 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱，德國(guó)Heraeus公司；DL-CJ-2N 高性能無(wú)菌實(shí)驗(yàn)臺(tái)，中國(guó)哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；TDZS-WS 多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)，中國(guó)上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；1-15K 高速離心機(jī)，美國(guó)Sigma 公司；電子分析天平BS124S，德國(guó)賽多利斯；IX-71 倒置顯微鏡、CX31 生物顯微鏡、體視顯微鏡OLYMPUS SZ61，日本Olympus公司。

1.2 日本大耳白兔BMSCs的體外分離培養(yǎng)

1.2.1細(xì)胞分離 胎兔全身用75%乙醇消毒，放置在無(wú)菌操作臺(tái)解剖，取其脊椎放置于含有1×青霉素、鏈霉素的PBS中，浸泡1 min后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)拿出脊椎，用含5×雙抗的PBS 連續(xù)清洗5~10 次，放入60 mm 的無(wú)菌培養(yǎng)皿，用無(wú)菌鑷子和眼科剪將脊椎周圍的結(jié)締組織、肌肉等剔除干凈，用微型注射器將脊椎椎體的骨髓腔沖至無(wú)菌培養(yǎng)皿中，然后將沖出的骨髓液用離心管收集，1 2000 r·min-1下離心5 min，棄上清液。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 將上述分離的細(xì)胞用完全培養(yǎng)基（DMEM/F12 培養(yǎng)基、14% FBS、10 ng·mL-1Bfgf）重懸，接種于60 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將余下的脊椎椎體用眼科剪剪碎，采用全骨髓貼壁法置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[11]。接種1 周后細(xì)胞密度在80%~85%時(shí)進(jìn)行換液傳代，用PBS 連續(xù)清洗1~2 次，0.25%胰酶消化，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否脫落，可以輕輕拍打，之后用完全培養(yǎng)基終止消化，以1∶2 傳代至新的60 mm 無(wú)菌培養(yǎng)皿，標(biāo)記為P1 代，培養(yǎng)4 代細(xì)胞逐漸純化。

1.3 日本大耳白兔BMSCs的細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

細(xì)胞凍存：用顯微鏡觀察法測(cè)定，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度在90%~95%時(shí)進(jìn)行消化，2 min后加入1 mL終止消化液(DMEM/F12培養(yǎng)基、15% FBS)，把15 mL離心管置于水平離心機(jī)，1 200 r·min-1離心8 min，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞總數(shù)，使用完全培養(yǎng)基稀釋調(diào)整細(xì)胞密度為1×105cell·mL-1，加入1 mL 細(xì)胞凍存液(DMEM/F12 培養(yǎng)基、10% DMSO、40% FBS)至凍存管中，梯度降溫存儲(chǔ)(4 ℃ 1 h，-80 ℃ 24 h，液氮長(zhǎng)期)。

細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮中取出需要的細(xì)胞凍存管，快速在37 ℃水浴鍋解凍，1~2 min 后用75%乙醇消毒，然后在超凈工作臺(tái)中操作，加入4~5倍完全培養(yǎng)基，1 200 r·min-1離心10 min，棄掉上清液，加入DMEM/F12 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量和活力調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)至60 mm 無(wú)菌培養(yǎng)皿中[16]。在倒置式顯微鏡下，觀察培養(yǎng)傳代BMSCs細(xì)胞形態(tài)、貼壁狀況并記錄拍照。

1.4 日本大耳白兔BMSCs 不同代次的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)

分別選取代次為5（P5）、10（P10）、15（P15）的細(xì)胞，用顯微鏡觀察法測(cè)定，當(dāng)密度達(dá)到80%~90%時(shí)常規(guī)消化收集細(xì)胞于15 mL 離心管，繪制生長(zhǎng)曲線。①用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使用完全培養(yǎng)基稀釋調(diào)整每孔的細(xì)胞密度在1.0×104cell·mL-1；②把細(xì)胞接種于24 孔板，2 mL 完全培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)；③培養(yǎng)24 h后隨機(jī)選取3孔P5、P10、P15 細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞數(shù)，為防止數(shù)值偏差每次取3 個(gè)孔取其平均值，連續(xù)7 d 計(jì)算細(xì)胞數(shù)量、根據(jù)數(shù)值繪制曲線，用公式（1）計(jì)算群體倍增時(shí)間（pupolation doubling time, PDT）[16]。

式中，to為起始時(shí)間；t為終止時(shí)間；N0為初始細(xì)胞個(gè)數(shù)；Nt為終止細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.5 日本大耳白兔BMSCs 劃痕試驗(yàn)及克隆形成能力檢測(cè)

為研究細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)和修復(fù)能力，采集P5代細(xì)胞，待細(xì)胞密度至90%~99%時(shí)，用200 μL 的槍頭尖在細(xì)胞皿中快速?gòu)淖蟮接掖怪眲? 次痕，槍頭保持垂直于培養(yǎng)皿，PBS 清洗3 次除去被劃去的細(xì)胞，加入3 mL 完全培養(yǎng)基，拍照后放置于培養(yǎng)箱，每3 h 觀察并拍照，直到細(xì)胞再次覆蓋終止試驗(yàn)，以此模擬細(xì)胞修復(fù)“劃痕傷口”，也稱傷口愈合試驗(yàn)。

取P3、P9、P15 代的BMSCs，用0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，分別以100·孔-1的細(xì)胞密度接種于六孔板中，放置于飽和濕度培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)；當(dāng)出現(xiàn)多數(shù)形狀呈團(tuán)狀的克隆團(tuán)時(shí)，棄培養(yǎng)基，PBS 清洗2~3 次，加入2 mL 4%多聚甲醛30 min，加入3 mL Giemsa 染液染色30 min；然后用蒸餾水緩慢沖洗，加入1~2 mL PBS，通過(guò)倒置式顯微鏡對(duì)克隆團(tuán)的形態(tài)和數(shù)量進(jìn)行觀察，并用公式（2）計(jì)算克隆形成率[12]。

1.6 日本大耳白兔BMSCs 的免疫熒光檢測(cè)

取密度在90%左右的P5 代細(xì)胞，常規(guī)消化，分置在6 孔板中，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h 后用新配的4%多聚甲醛固定細(xì)胞25 min；PBS 緩慢沖洗2 次，每孔加入1 mL 0.1% Triton X-100 通透細(xì)胞，PBS 緩慢沖洗2 次，加入1 mL PBS 稀釋的10%山羊血清封閉30 min，吸出后直接加入PBS 按1∶10稀釋的山羊抗鼠一抗CD29、CD44、CD73、CD105，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS 緩慢沖洗3 次，加入0.99 mL PBS、0.01 mL FITC 標(biāo)記山羊抗鼠二抗，37 ℃避光1 h，PBS 緩慢沖洗2 次，加入DAPI 染液，37 ℃避光 15 min，PBS 緩慢沖洗1 次，加入1 mL PBS，在激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照并記錄。以造血干細(xì)胞表面分子標(biāo)記CD45進(jìn)行免疫熒光鑒定。

1.7 日本大耳白兔BMSCs RT-PCR檢測(cè)

用Trizol 法提取P5 代細(xì)胞總RNA，提取成功后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系容量為20 μL。從NCBI 查找間充質(zhì)干細(xì)胞特異性基因（GAPDH、CD29、CD44、CD73、CD105）、造血干細(xì)胞分子基因CD45、成骨特異性基因（collage typeⅠ、osteopontin）、成脂特異性基因（PPAR-γ，LPL）成軟骨特異性基因（GAPDH、ACAN、SOX9）序列,通過(guò)Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物（表1）,引物均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系50 μL：2×TaqPCR Mix 25 μL,Rnase Free H2O 19 μL, 模板cDNA 2μL，上、下游引物各2 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 min，72 ℃延伸30 s，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1.7%瓊脂多糖凝膠電泳30~35 min后凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.8 日本大耳白兔BMSCs誘導(dǎo)分化能力鑒定

1.8.1成骨誘導(dǎo) 取P3 代大耳白兔BMSCs，當(dāng)細(xì)胞密度至60%~70%時(shí)加入成骨誘導(dǎo)液（DMEM/F12 培養(yǎng)基+5% FBS+100 μg·mL-1青、鏈霉素+0.5μmol·L-1地塞米松+10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉+50 μg·mL-1抗壞血酸），每3 d 換液1 次，誘導(dǎo)培養(yǎng)2周左右，參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行茜素紅染色鑒定。

1.8.2成軟骨誘導(dǎo) 取P3 代大耳白兔BMSCs，當(dāng)細(xì)胞密度為60% 左右時(shí)加入成軟骨誘導(dǎo)液（DMEM/F12 培養(yǎng)基+2.5%FBS+ 0.1 μmol·L-1地塞米松+50 μg·mL-1抗壞血酸+0.9 mmol·L-1丙酮酸鈉+1%ITS+50 μg·mL-1脯氨酸+100 μg·mL-1青、鏈霉素+10 ng·mL-1TGF-β3）進(jìn)行誘導(dǎo)。在2~3 周的時(shí)間里，每2~3 d 換液1 次，每天觀察細(xì)胞是否向軟骨細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，參照說(shuō)明書(shū)加入阿利新藍(lán)染液進(jìn)行染色并拍照。

1.8.3成脂誘導(dǎo) 取P3 代大耳白兔BMSCs，當(dāng)細(xì)胞密度至60%時(shí)棄原培養(yǎng)基，加入成脂誘導(dǎo)液（DMEM/F12 培養(yǎng)基+10%FBS+1.1 μmol·L-1地塞米松+10 mg·L-1胰島素+0.5 mol·L-1IBMX+100 μg·mL-1青鏈霉素+200 μmol·L-1吲哚美辛）。在3 周左右的誘導(dǎo)時(shí)間內(nèi)，每2~3 d 給細(xì)胞換液1 次，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)較多脂滴形態(tài)后，加入2 mL 4%多聚甲醛 20 min，用PBS 清洗2~3 次，參照說(shuō)明書(shū)使用油紅O染色液染色并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本大耳白兔BMSCs形態(tài)學(xué)分析

采用全骨髓貼壁法在培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 周后，合適的組織塊周圍開(kāi)始不斷有呈長(zhǎng)梭形、小弓箭型、漩渦形排列的細(xì)胞長(zhǎng)出（圖1）：P1 代細(xì)胞除了間充質(zhì)細(xì)胞外，可能還存在其他成纖維性細(xì)胞，細(xì)胞純度會(huì)隨著代次增加而提高，在換代的過(guò)程中逐漸棄掉其他細(xì)胞；P3 代間充質(zhì)細(xì)胞純度較高，細(xì)胞呈對(duì)數(shù)期增長(zhǎng)，1~2 d 傳代1 次；至P28 代時(shí)，細(xì)胞顏色渾濁，排列混亂，細(xì)胞黑斑出現(xiàn)，細(xì)胞密度在50%~60%，空泡較多，傳代后增殖緩慢，沒(méi)有活力，甚至不再增殖，細(xì)胞開(kāi)始脫落，傳代時(shí)間達(dá)到4~5 d，這些都是細(xì)胞衰老的特征，說(shuō)明BMSCs 的增殖能力是有限的，隨著傳代次數(shù)增加衰老特征逐漸明顯，符合細(xì)胞生長(zhǎng)正常規(guī)律。

圖1 日本大耳白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)Fig. 1 BMSCs morphology of Japanese large ear white rabbits

2.2 日本大耳白兔BMSCs復(fù)蘇前后活力形態(tài)

在細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中，P10 代之前細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和增殖活力強(qiáng)，按1 傳2 的比例進(jìn)行傳代，為了實(shí)現(xiàn)更有效的細(xì)胞資源合理配置，遵循可持續(xù)發(fā)展原則，在傳代的過(guò)程中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存。在試驗(yàn)過(guò)程中，將P7 代凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，對(duì)比觀察復(fù)蘇前和復(fù)蘇后的細(xì)胞發(fā)現(xiàn), 復(fù)蘇前后細(xì)胞狀態(tài)變化不明顯，仍具有很強(qiáng)的生命活力（圖2）。

圖2 日本大耳白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇前后形態(tài)Fig. 2 Resuscitation morphology of Japanese large ear white rabbits BMSCs before and after recovery

2.3 日本大耳白兔BMSCs 不同代次生長(zhǎng)曲線及群體倍增時(shí)間

將日本大耳白兔BMSCs 以1×104cell·mL-1接種于24 孔板培養(yǎng)，選取P5、P10、P15 代細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定與繪制(圖3)，日本大耳白兔BMSCs低、中、高代次的生長(zhǎng)曲線和增值時(shí)間大致相似，都呈“S”形，第1~2 天增殖緩慢，為潛伏期；第3~4天增殖加快，代次越低，增殖越快，第4~5 天為細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；第6~7 天趨于平緩，為平臺(tái)期。P5、P10、P15 代間充質(zhì)干細(xì)胞的群體倍增時(shí)間分別是47.37、52.06、56.10 h。

圖3 日本大耳白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及群體倍增時(shí)間Fig. 3 Growth curve， population doubling time of BMSCs in Japanese large ear white rabbits

2.4 日本大耳白兔BMSCs 細(xì)胞遷移及克隆形成率

劃痕后，每3 h觀察拍照1次，6 h內(nèi)細(xì)胞已完全覆蓋(圖4A)。克隆鋪板2周后，對(duì)不同代次大耳白兔BMSCs 進(jìn)行Giemsa 染色，觀察克隆染色形成情況，P3、P9、P15克隆形成率分別是（31.50%±1.57%）、(26.70%±2.00%)和（29.15%±1.97%）(圖4B)。

圖4 日本大耳白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞劃痕試驗(yàn)及不同代次克隆形成能力Fig. 4 Scratching experiment and clonogenic ability of Japanese large ear white rabbits BMSCs

2.5 日本大耳白兔BMSCs 相關(guān)表面標(biāo)記物鑒定分析

基于間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)記基因CD29、CD44、CD73、CD105，檢測(cè)P4 代日本大耳白兔BMSCs免疫熒光表面標(biāo)記物，均呈陽(yáng)性表達(dá)。造血細(xì)胞表面分子標(biāo)記CD45呈陰性表達(dá)(圖5)。對(duì)日本大耳白兔BMSCs進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，除了不表達(dá)CD45外，CD29、CD44、CD73、CD105均呈陽(yáng)性表達(dá)，符合間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性(圖6)。

圖5 日本大耳白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫熒光Fig. 5 Immunofluorescence of Japanese large ear white rabbits BMSCs

圖6 表面標(biāo)記物RT-PCR檢測(cè)Fig. 6 RT-PCR result of marker genes

2.6 日本大耳白兔BMSCs成骨誘導(dǎo)分化

第4 代細(xì)胞開(kāi)始采用成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)21 d后，細(xì)胞不再是長(zhǎng)梭形，開(kāi)始逐漸形成不規(guī)則的骨結(jié)節(jié)形態(tài)；經(jīng)茜素紅染液染色后，骨結(jié)節(jié)呈現(xiàn)鮮艷深紅色（圖7）。RT-PCR 結(jié)果顯示，Ⅰ型膠原蛋白(collage type Ⅰ)和骨橋蛋白(osteopontin, OPN)基因均呈陽(yáng)性表達(dá)。

圖7 日本大耳白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化鈣沉積茜素紅染色和RT-PCR檢測(cè)Fig. 7 Detection of calcium deposition in osteoblastic differentiation of Japanese large ear white rabbits BMSCs using alizarin red and RT-PCR

2.7 日本大耳白兔BMSCs成軟骨誘導(dǎo)分化

P4 代細(xì)胞經(jīng)軟骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)，其形態(tài)并未發(fā)生明顯變化，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)軟骨結(jié)節(jié)才慢慢凸顯，14 d后經(jīng)阿利新藍(lán)染液染色后，周圍形態(tài)和排列發(fā)生改變，軟骨結(jié)節(jié)呈藍(lán)色。提取RNA 后經(jīng)RT-PCR 鑒定，該細(xì)胞表達(dá)ACAN 和SOX9 基因（圖8）。

圖8 日本大耳白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化阿利新藍(lán)染色和RT-PCR檢測(cè)Fig. 8 Detection of chondrogenic differentiation of Japanese large ear white rabbits BMSCs using Alixin blue and RT-PCR

2.8 日本大耳白兔BMSCs成脂誘導(dǎo)分化

傳代至P4 代細(xì)胞時(shí)，采用成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)14 d 后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)數(shù)量不等、大小不一、透亮的脂滴，均呈環(huán)樣分布；經(jīng)油紅O 染色后，脂滴呈現(xiàn)鮮艷深紅色。提取RNA 后，RT-PCR 鑒定結(jié)果顯示，成脂特性基因LPL 和PPAR-γ 呈陽(yáng)性表達(dá)（圖9）。

圖9 日本大耳白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化油紅O染色和RT-PCR檢測(cè)Fig.9 Oil red O staining and RT-PCR detection of adipogenic differentiation of Japanese large ear white rabbits BMSCs

3 討 論

本研究采用全骨髓貼壁法獲取日本大耳白兔BMSCs，考慮到細(xì)胞生長(zhǎng)所需和材料設(shè)備有限等因素，以及在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)含有12%胎牛血清的培養(yǎng)基可使細(xì)胞達(dá)到最優(yōu)生長(zhǎng)狀態(tài)，符合細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律，因此選出大耳白兔BMSCs 最佳培養(yǎng)體系為217.5 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基+32.5 mL 胎牛血清（FBS）+100 μL 10 ng·mL-1Bfgf+50 μL 20 ng·mL-1EGF+1%谷氨酰胺+1%雙抗。其中Bfgf、EGF 是促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的因子，具有聯(lián)合促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，谷氨酰胺是必需氨基酸，能夠維持細(xì)胞正常的生長(zhǎng)和代謝，但極不穩(wěn)定，所以試驗(yàn)過(guò)程中需要及時(shí)換液[18-21]。在傳代消化過(guò)程中，要嚴(yán)格把控時(shí)間，盡量減少胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞活性的影響，在量的使用和消化時(shí)間的把控方面需要嚴(yán)格控制，以延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命[22]。細(xì)胞增殖數(shù)量呈“S”形，經(jīng)過(guò)潛伏期，細(xì)胞能達(dá)到最快生長(zhǎng)階段即對(duì)數(shù)期，隨即進(jìn)入平臺(tái)期和衰敗期。在劃痕試驗(yàn)中，人為制造“劃痕/傷口”，該細(xì)胞在6 h 內(nèi)再次長(zhǎng)滿，說(shuō)明細(xì)胞遷移能力和增殖能力較強(qiáng)，隨著細(xì)胞代次更迭，以及胰酶、離心等操作對(duì)細(xì)胞造成了一定傷害，在P10代之后細(xì)胞遷移能力下降，修復(fù)能力減弱，劃痕試驗(yàn)可能在免疫、炎癥、腫瘤轉(zhuǎn)移、損傷修復(fù)及胚胎發(fā)育中都會(huì)涉及、參與和相互影響[23-24]，因此用干細(xì)胞治療損傷，最好選取代次低的細(xì)胞，從而保證修復(fù)效果?？寺∧芰z測(cè)試驗(yàn)中，細(xì)胞從單個(gè)均勻分散的狀態(tài)，經(jīng)過(guò)快速增殖，變成單個(gè)克隆團(tuán)，說(shuō)明細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力。在免疫熒光試驗(yàn)中，需要注意細(xì)胞密度不宜過(guò)大，以免影響細(xì)胞正常形態(tài)，在此前提下進(jìn)行后續(xù)操作，可提高試驗(yàn)的成功率和完成度。利用CD29、CD44、CD73、CD105這4 種細(xì)胞表面標(biāo)記物基因，對(duì)大耳白兔BMSCs 進(jìn)行RT-PCR 鑒定，除了陰性對(duì)照CD45外，其他都呈陽(yáng)性表達(dá)，鑒定該細(xì)胞就是日本大耳白兔BMSCs。CD45是造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的標(biāo)志，在造血干細(xì)胞中表達(dá)，造血干細(xì)胞主要存在于造血組織，骨髓中分布最多，其次是臍帶[25]，因此該陰性對(duì)照對(duì)大耳白兔BMSCs 的生物學(xué)鑒定有重要作用和意義。在檢測(cè)細(xì)胞多潛能分化能力試驗(yàn)中，在細(xì)胞中加入成骨、成軟骨、成脂肪誘導(dǎo)液[26]，經(jīng)2~3 周誘導(dǎo)，通過(guò)觀察判斷細(xì)胞誘導(dǎo)程度，本試驗(yàn)中成骨誘導(dǎo)時(shí)間快于成軟骨誘導(dǎo)快于成脂肪誘導(dǎo)，該細(xì)胞成功分化出了成骨、成軟骨和成脂細(xì)胞，說(shuō)明細(xì)胞具有多向分化的潛能，與Liu等[28]對(duì)誘導(dǎo)分化時(shí)間的研究結(jié)果一致。

本研究通過(guò)全骨髓貼壁法成功獲取大耳白兔BMSCs，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察，并進(jìn)行了分子生物學(xué)相關(guān)鑒定，該細(xì)胞在一定的誘導(dǎo)條件下能夠分化為骨骼、軟骨、脂肪細(xì)胞，具有良好的體外增殖能力和多向分化潛能；可為治療運(yùn)動(dòng)損傷提供優(yōu)質(zhì)的種子細(xì)胞[29-30]，也為利用BMSCs 進(jìn)行組織與工程學(xué)研究和動(dòng)物遺傳資源的保存研究奠定理論基礎(chǔ)。