鉀肥對苜蓿低溫脅迫下抗氧化酶活性的影響

張慶昕， 張玉霞*， 孫明雪， 夏全超， 王顯國， 劉庭玉， 杜曉艷

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)飼用作物工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028041；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

苜蓿(Medicago sativa)作為多年生豆科草本植物[1]，具有營養(yǎng)價值高、適口性好、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點[2]。雖然苜蓿的抗逆性較強(qiáng)，但是我國北部高寒地區(qū)冬季寒冷少雪，冬春兩季常會因寒流侵襲發(fā)生倒春寒、極端低溫等現(xiàn)象，這已經(jīng)成為限制苜?？沙掷m(xù)生產(chǎn)的重要因素[3]。

低溫脅迫下，植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化過程加劇，膜系統(tǒng)的氧化性損傷嚴(yán)重，會生成氧化分解產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）[4]，對生物膜造成傷害，此時植物會通過超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）等抗氧化酶清除一定范圍內(nèi)在低溫脅迫刺激下植物代謝過程中產(chǎn)生的活性氧[5]，維持細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。因此低溫脅迫下的MDA 含量可以衡量苜蓿的抗寒性[6]，抗氧化酶活性強(qiáng)弱是評價苜蓿抗氧化能力的生理指標(biāo)[7-8]。

鉀是植物生長必需的三大元素之一，素有“抗逆元素”之稱，是植物細(xì)胞內(nèi)含量最高的陽離子，能高速通過生物膜[9-11]；鉀元素還是大多數(shù)酶的關(guān)鍵輔助因子，其中抗氧化酶系統(tǒng)中酶活性的啟動就需要鉀元素的參與[12-14]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的鉀肥種類有KCl、K2SO4和KH2PO4等[15-16]，已有的研究主要是圍繞苜蓿對低溫脅迫的響應(yīng)及單一種類鉀肥對其他作物的影響[17-20]，關(guān)于鉀肥種類和用量對苜?？寡趸硖匦缘挠绊懯欠翊嬖诓町惖难芯枯^少。因此，本研究對不同鉀肥種類和用量對苜蓿根頸在低溫脅迫下生理響應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，闡釋不同鉀肥處理的苜蓿根頸在低溫脅迫下膜質(zhì)氧化程度和抗氧化特性，提出種植苜蓿最適宜施用的鉀肥種類及用量，旨在為科爾沁沙地苜?？购弋a(chǎn)栽培中鉀肥的高效管理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于內(nèi)蒙古通遼市開魯縣東風(fēng)鎮(zhèn)林輝草業(yè)公司基地（43°61′N，121°30′E），該地區(qū)屬于溫帶大陸性半干旱氣候，四季分明，降水主要集中在夏季，冬季干旱少雪，≥10 ℃年積溫為3 000～3 200 ℃，年平均氣溫5.6 ℃，無霜期138～153 d，年平均降水量375 mm，年平均風(fēng)速3.0～4.4 m·s-1，土壤有機(jī)質(zhì)含量6.41 g·kg-1，速效磷含量3.62 mg·kg-1，速效鉀含量77.85 mg·kg-1，堿解氮含量35.84 mg·kg-1，全氮含量44.03 g·kg-1。

1.2 試驗材料

供試紫花苜蓿品種(M. sativa‘Gibraltar’)為‘北極熊’，由北京百思特有限公司提供。該品種的秋眠級為2.0級，幼苗強(qiáng)壯、根系發(fā)達(dá)，是抗寒性能非常突出的苜蓿品種。供試肥料KCl（K2O≥60%）、K2SO4（K2O≥52%）和KH2PO4（K2O≥34%）分別來源于中化化肥有限公司、國投新疆羅布泊鉀鹽有限責(zé)任公司和四川省綿竹市漢旺無機(jī)鹽化工有限公司。

1.3 試驗設(shè)計

試驗地土壤類型為沙壤土，該土壤類型保水保肥能力較差，透氣性好，土壤持水量小，土溫變幅較大，易耕作。試驗采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，播種前一次性施入過磷酸鈣(P2O5含量為44%)200 kg·hm-2作基肥。2020年7月1日播種，播種量為22.5 kg·hm-2。分別施用KCl、K2SO4和KH2PO43種鉀肥，單施的施用量分別為100、200和300 kg K2O·hm-2（分別用K1、K2和K3表示），并設(shè)置不施鉀肥（0 kg K2O·hm-2）作為對照(CK)，每個處理設(shè)置3 次重復(fù)，共30 個小區(qū)，小區(qū)面積為3 m×5 m=15 m2，行距為20 cm，供試鉀肥均作為基肥于播種前一次性施入，施肥方式為撒施。試驗田灌水使用指針式噴灌，期間進(jìn)行正常的田間管理。

于封凍前（11 月15 日）挖取長勢一致的苜蓿根系（越冬器官），帶回室內(nèi)進(jìn)行低溫處理。參照朱愛民等[21]的低溫處理方法，每個小區(qū)取60 株長勢均勻一致的苜蓿根頸，用蒸餾水洗凈擦干后平均分成4 份，其中1 份放入4 ℃冰箱中儲存（低溫冷藏），將另外3份苜蓿根系整齊的排放在20 cm×30 cm 的脫脂純棉布上包裹好，然后用適量蒸餾水將卷好的脫脂純棉布均勻噴灑，使棉布保持濕潤，最后用30 cm×30 cm的錫箔紙包裹好，放入可程式恒溫恒濕試驗箱[6-8,13-14,21]分別進(jìn)行-10、-20、-30 ℃低溫處理（低溫冷凍）。可程式恒溫恒濕試驗箱設(shè)置為：以4 ℃為起點，先以4 ℃·h-1的速率降溫，達(dá)到目標(biāo)溫度后保持6 h，然后以4 ℃·h-1的速度升溫至4 ℃。低溫冷凍材料取出后在4 ℃下放置12 h，與冷藏處理材料一同取苜蓿根頸下1 cm 長度，切為薄片后測定根頸MDA 含量及CAT、POD 和SOD活性。

1.4 測定指標(biāo)及方法

丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[22]測定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法[14]測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法[22]測定，過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法[13]測定。

1.5 統(tǒng)計分析方法

試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 軟件處理、制作表格，用DPS 7.0軟件進(jìn)行方差顯著性分析及相關(guān)性分析，采用Duncan 檢驗方法新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉀肥對低溫脅迫下苜蓿根頸丙二醛含量的影響

如表1所示，4、-20和-30 ℃低溫脅迫處理下，KCl處理的苜蓿根頸丙二醛（MDA）含量在K1處理下達(dá)到最小值，分別較CK 顯著（P<0.05）降低了13.56%、20.11%和17.01%。4、-20 和-30 ℃低溫脅迫處理下，K2SO4處理的苜蓿根頸MDA 含量在K2處理下達(dá)到最小值，分別較CK顯著（P<0.05）降低了18.64%、41.85%和44.44%。4、-10、-20 和-30 ℃低溫脅迫處理下，KH2PO4處理的苜蓿根頸MDA 含量均在K2處理下達(dá)到最小值，且與CK 差異顯著（4 ℃處理除外），在-10、-20 和-30 ℃下分別較CK 顯著（P<0.05）降低了34.62%、28.80%和39.24%。3 種鉀肥處理下，在4、-10、-20 和-30 ℃低溫脅迫下K2SO4處理的苜蓿根頸MDA含量均最?。?30 ℃的K1處理除外）。以上說明K2SO4種類鉀肥更利于緩解苜蓿根頸細(xì)胞膜質(zhì)氧化過程，且以K2處理（200 kg·hm-2K2O施用量）為宜。

表1 不同鉀肥種類和用量下低溫脅迫處理苜蓿根頸丙二醛的含量Table 1 MDA content in alfalfa root crowns with different potassium fertilizer types and dosages under low temperature stress（nmol·g-1）

2.2 鉀肥對低溫脅迫下苜蓿根頸超氧化物歧化酶活性的影響

如表2 所示，4、-10、-20 和-30 ℃低溫脅迫處理下，KCl 處理的苜蓿根頸超氧化物歧化酶（SOD）活性在不同鉀肥施用量處理下均顯著（P<0.05）高于CK（-10 和-30 ℃處理的K3處理除外），且均在K1處理下達(dá)到最大值，分別較CK 增長了23.50%、21.54%、30.13%和35.00%；K2SO4處理的苜蓿根頸SOD 活性在不同鉀肥施用量處理下均顯著高于CK（P<0.05），且在K2處理下達(dá)到最大值，分別較CK 增長了36.06%、30.02%、63.37%和52.06%；KH2PO4處理的苜蓿根頸SOD活性在不同鉀肥施用量處理下均顯著（P<0.05）高于CK（-10 ℃的K3處理除外），且均在K2處理下達(dá)到最大值，分別較CK 增長了28.91%、24.28%、36.12%和47.69%。3 種鉀肥處理下，在4、-10、-20和-30 ℃低溫脅迫時均以K2SO4處理的苜蓿根頸SOD 活性最高（4 ℃的K1處理除外），其中在K2和K3處理下與KCl 處理之間差異顯著（P<0.05）。說明K2SO4種類鉀肥最有利于增強(qiáng)苜蓿根頸的SOD活性，且K2處理（200 kg K2O·hm-2）效果最佳。

表2 不同鉀肥種類和用量下低溫脅迫處理苜蓿根頸超氧化物歧化酶的活性Table 2 SOD activity in alfalfa root crowns with different potassium fertilizer types and dosages under low temperature stress（U·g-1 FW）

2.3 鉀肥對低溫脅迫下苜蓿根頸過氧化氫酶活性的影響

如表3所示，4、-20和-30 ℃低溫脅迫處理下，KCl 處理的苜蓿根頸過氧化氫酶（CAT）活性均在K1處理下達(dá)到最大值，分別較CK 顯著(P<0.05)增長25.66%、31.26%和17.19%。4、-10、-20和-30 ℃低溫脅迫下，K2SO4處理的苜蓿根頸CAT活性在不同鉀肥施用量下均顯著高于CK（P<0.05），且均在K2處理下達(dá)到最大值，分別較CK 增長63.36%、37.37%、75.83%和38.10%。4、-10 和-20 ℃低溫脅迫下，KH2PO4處理的苜蓿根頸CAT 活性在不同鉀肥施用量下均顯著高于CK（P<0.05），且均在K2處理下達(dá)到最大值，分別較CK 增長46.12%、15.20%和44.57%。3種鉀肥處理下，在4、-10、-20和-30 ℃低溫脅迫時均以K2SO4處理的苜蓿根頸CAT 活性最高，且在不同鉀肥施用量下均與KCl 處理的CAT 活性差異顯著（P<0.05）（-20 ℃的K1處理除外）。說明K2SO4種類鉀肥K2處理（200 kg K2O·hm-2）最有利于增強(qiáng)CAT 活性，清除H2O-2，減輕有毒害作用的物質(zhì)對細(xì)胞的傷害。

表3 不同鉀肥種類和用量下低溫脅迫處理苜蓿根頸過氧化氫酶的活性Table 3 CAT activity in alfalfa root crowns with different potassium fertilizer types and dosages under low temperature stress（U·g-1·min-1）

2.4 鉀肥對低溫脅迫下苜蓿根頸過氧化物酶活性的影響

如表4所示，4、-10和-20 ℃低溫脅迫處理下，KCl 處理的苜蓿根頸過氧化物酶（CAT）活性均在K2處理下達(dá)到最大值，分別較CK 顯著（P<0.05）增長26.70%、27.36%和18.89%。4、-10、-20和-30 ℃低溫脅迫處理下，K2SO4處理的苜蓿根頸CAT活性在不同鉀肥施用量下均顯著高于CK（P<0.05），且均在K2處理下達(dá)到最大值，分別較CK 增長58.59%、59.10%、44.13%和16.39%。4、-10、-20和-30 ℃低溫脅迫處理下，KH2PO4處理的苜蓿根頸CAT活性在不同鉀肥施用量下均顯著（P<0.05）高于CK（-30 ℃的K1處理除外），且均在K2處理下達(dá)到最大值，分別較CK 增長45.86%、48.47%、23.35%和10.06%。3種鉀肥處理下，在4、-10、-20和-30 ℃低溫脅迫時均以K2SO4處理的苜蓿根頸CAT 活性最高（4 ℃的K1處理除外），且在不同鉀肥施用量下與KCl 處理的CAT 活性差異顯著（-30 ℃的K1處理除外），在-20 和-30 ℃下與KH2PO4處理的CAT 活性差異顯著（P<0.05）。說明K2SO4種類鉀肥K2處理下（200 kg·hm-2K2O）增強(qiáng)POD活性的效果最明顯。

表4 不同鉀肥種類和用量下低溫脅迫處理苜蓿根頸過氧化物酶的活性Table 4 POD activity of alfalfa root crowns with different potassium fertilizer types and dosages under low temperature stress（U·g-1·min-1）

2.5 根頸中丙二醛與抗氧化酶活性的相關(guān)性分析

如表5 所示，4、-10、-20 和-30 ℃低溫脅迫處理下的苜蓿根頸CAT 活性均與POD 活性呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；-10、-20 和-30 ℃低溫脅迫處理下的苜蓿根頸SOD活性與MDA含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與CAT 活性呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；4、-10和-20 ℃低溫脅迫處理下的苜蓿根頸SOD 活性與POD 活性呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；4 ℃低溫脅迫處理下的MDA 含量與SOD 活性呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），4 和-30 ℃低溫脅迫處理下的MDA 含量與CAT 活性呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；-30 ℃低溫脅迫處理下的POD 活性與MDA 含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），與SOD 活性呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；-10 和-20 ℃低溫脅迫處理下的MDA 含量與POD 活性均呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），以上說明苜蓿根頸中抗氧化酶（CAT、POD 和SOD）活性越高，MDA 含量就越低，苜蓿根頸細(xì)胞中清除毒害物質(zhì)的能力就越強(qiáng)，膜質(zhì)過氧化程度就越輕，苜蓿的抗寒能力更強(qiáng)。

表5 苜蓿根頸丙二醛與抗氧化酶活性的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of alfalfa root crown malondialdehyde and antioxidant enzyme activity

3 討論

植物受到低溫脅迫時，植物細(xì)胞膜的膜質(zhì)會發(fā)生過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)的氧化性損傷[23]，MDA 含量的多少可反映植物細(xì)胞受傷害的程度[24-25]。本研究表明，隨著低溫脅迫溫度的降低，苜蓿根頸MDA 含量持續(xù)增加，說明低溫脅迫會破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，溫度越低，細(xì)胞膜質(zhì)的過氧化過程越劇烈，積累的過氧化產(chǎn)物就越多。李雙銘等[26]研究表明，隨著溫度的降低，結(jié)縷草葉片中的MDA 含量升高；孫予璐等[27]研究也發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下4 個供試品種紫花苜蓿丙二醛含量較對照組有所提高，且隨著溫度降低，丙二醛含量呈上升趨勢，均與本研究結(jié)果一致。本研究還表明，KCl、K2SO4和KH2PO43 種鉀肥對苜蓿根頸的MDA 含量均有顯著影響，并且隨著鉀肥施用量的增加，MDA 含量表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢，說明適量的鉀肥有利于降低苜蓿根頸的MDA 含量，而過量的鉀肥會對苜蓿細(xì)胞產(chǎn)生脅迫，對細(xì)胞膜質(zhì)產(chǎn)生進(jìn)一步的傷害，進(jìn)而導(dǎo)致MDA 含量增長[28]。本研究中，K2SO4處理的苜蓿根頸MDA 含量在不同低溫脅迫處理下明顯小于KCl 和KH2PO4處理，可能的原因是K2SO4中有，其中S元素也有影響植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的作用，且周杰[29]的研究表明，施硫能降低小麥旗葉MDA含量，因此與KCl和KH2PO4處理相比，K2SO4處理更有利于緩解細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。

當(dāng)植物受到低溫脅迫時，會產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS 能參與各種新陳代謝，是調(diào)控細(xì)胞生長及死亡的第二信使，在正常的生長環(huán)境中，ROS 在植物體內(nèi)應(yīng)處于動態(tài)平衡的狀態(tài)；低溫脅迫下，ROS的大量產(chǎn)生會造成DNA 受損、蛋白質(zhì)失活、細(xì)胞膜質(zhì)過氧化甚至細(xì)胞功能紊亂、死亡等一系列生化反應(yīng)[30]，進(jìn)而激活由酶抗氧化防御系統(tǒng)和非酶抗氧化防御系統(tǒng)組成的ROS 清除系統(tǒng)，其中酶抗氧化防御系統(tǒng)包括SOD、CAT 和POD 等抗氧化酶[31]。SOD 作為清除ROS 的第一道防線，能催化超氧陰離子（O2-）歧化為過氧化氫（H2O2），其活性的強(qiáng)弱直接影響了植物的抗寒性；POD 具有防止羥基在植物體內(nèi)合成，催化各種細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)合成及降解H2O2的作用；CAT 則是以鐵卟啉為輔基，既能催化H2O2分解，減輕H2O2對細(xì)胞的毒害作用，又能協(xié)助SOD清除ROS[32-33]。本研究表明，在-20 ℃低溫處理下3種抗氧化酶活性最強(qiáng)，但當(dāng)?shù)蜏孛{迫溫度低于-20 ℃，已超過抗氧化酶系統(tǒng)可清除的閾值，系統(tǒng)遭到破壞[34]，即CAT、POD 和SOD 活性降低。李波等[35]研究表明，隨著低溫脅迫溫度的降低，‘龍牧807’苜蓿幼苗POD、SOD 活性呈先升后降的變化趨勢；于丹等[36]的研究也表明杏樹雌蕊的CAT 和POD 活性隨溫度的降低呈先上升后下降的趨勢，均與本研究結(jié)果一致。本研究中，KCl、K2SO4和KH2PO4均對苜蓿根頸的CAT、POD 和SOD 活性有顯著影響，并且隨著鉀肥施用量的增加表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢，且在不同低溫脅迫處理下的CAT、POD 和SOD 活性在不同鉀肥施用量下均明顯高于CK（POD 活性在-30 ℃下除外），說明施鉀有利于提高苜蓿根頸中的CAT、POD 和SOD活性，與沈超[37]、羅帥[38]的研究結(jié)果一致。并且本研究中，K2SO4處理較KCl 和KH2PO4處理的苜蓿根頸中抗氧化酶活性更強(qiáng)，可能是因為K2SO4中的S 作為酶化反應(yīng)活性中心的重要元素[39]，對抗氧化酶活性的變化也有重要作用，且王媛媛等[40]的研究也表明，施S 明顯提高了花生葉片中CAT、POD 和SOD 活性。此外，本試驗中K2SO4處理的苜蓿根頸在200 kg K2O·hm-2施用量處理下CAT、POD 和SOD 活性顯著高于CK 及其他鉀肥施用量（P<0.05），說明施用K2SO4增強(qiáng)苜蓿根頸抗氧化酶活性的效果最明顯，并且以200 kg K2O·hm-2施用量為宜。