外源促生菌聯(lián)合有機(jī)肥對(duì)干旱脅迫下參地土壤性狀及人參抗逆性影響

王艷成， 張紀(jì)月， 馮帥奇， 梁雪， 張振， 董微巍， 姬文秀

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

人參（Panax ginsengC. A. Meyer）為五加科人參屬多年生草本宿根植物，是名貴中藥材，具有安神補(bǔ)氣、養(yǎng)血復(fù)脈、健脾益肺、益智延年等諸多功效[1]。我國的人參種植面積及總產(chǎn)值位居世界之首，其中吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)的人參產(chǎn)量和品質(zhì)最高，是世界人參主產(chǎn)區(qū)。目前，我國由于農(nóng)田參栽培技術(shù)尚未形成標(biāo)準(zhǔn)化體系，且人參主栽地區(qū)頻發(fā)春旱，在水資源相對(duì)緊缺的狀況下，干旱影響人參緩苗及展葉，嚴(yán)重制約了農(nóng)田栽參產(chǎn)業(yè)的綠色健康發(fā)展。

植物通過產(chǎn)生乙烯前體物質(zhì)1-氨基環(huán)丙烷 -1- 羧 酸（1-amino-cyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）來抵抗寒冷、干旱、洪水、病原體侵染和重金屬污染等，但ACC 隨蒸騰液流上升到植物地上部分，會(huì)加速葉片成熟和衰老，導(dǎo)致光合能力下降，從而降低作物產(chǎn)量[2]。植物生長(zhǎng)促進(jìn)根際細(xì)菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）具有降解根際ACC 的作用，使植物退化周期縮短，保持根系健壯，能夠較好地耐受環(huán)境脅迫。有機(jī)肥部分替代氮肥能夠優(yōu)化冠層氮素分配，使植物葉片的蒸騰速度顯著降低，當(dāng)植物處于干旱狀態(tài)時(shí)，能夠協(xié)助其減少水分散失以提升抗旱能力。李剛等[3]研究表明，施用生物有機(jī)肥種植人參可以促進(jìn)人參地上部生長(zhǎng)，增強(qiáng)葉片光合作用，加強(qiáng)植株抗逆能力。薛振東等[4]對(duì)消毒后的土壤進(jìn)行試驗(yàn)，通過施加有機(jī)肥對(duì)農(nóng)田栽參土壤進(jìn)行改良，不僅能夠降低人參根部的感病率、提高人參抗逆能力，還能夠改善土壤結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)土壤肥力，獲得高質(zhì)高產(chǎn)的人參。

有益微生物群落具有改善植物健康的應(yīng)用潛力，植物與微生物互作能夠提升宿主植物的抗逆性，挖掘與植物高生產(chǎn)力相關(guān)的潛在有益細(xì)菌是農(nóng)業(yè)生物肥料開發(fā)的前提條件[5]。目前對(duì)干旱脅迫下農(nóng)田人參促生菌促生效應(yīng)協(xié)同有機(jī)肥方面的研究鮮見報(bào)道。因此，本研究通過外源接種ACC脫氨酶產(chǎn)生菌，結(jié)合施用有機(jī)肥處理，用化學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)手段相結(jié)合的方法，評(píng)價(jià)施用菌肥對(duì)土壤肥效與土壤酶活力、微生物群落以及人參根系酶活力的影響，探討微生物菌肥提高人參抗逆性的可行性，以改善當(dāng)?shù)赝寥婪柿l件，提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)，為人參種植中應(yīng)對(duì)春季干旱、開發(fā)農(nóng)田栽參專用生物菌肥提供依據(jù)，為促進(jìn)農(nóng)田栽參產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

OchrobactrumG119 菌株[6]由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，為人參根際促生功能菌（PGPR）。人參苗（2 年生）由吉林省延邊朝鮮族自治州和龍參場(chǎng)提供。試驗(yàn)有機(jī)肥產(chǎn)品由實(shí)驗(yàn)室腐熟雞糞堆肥發(fā)酵而成，其含水量25.7%、總碳285.4 g·kg-1、總氮19.6 g·kg-1、碳氮比（C/N）16.9、全磷 35.4 g·kg-1、全鉀12.6 g·kg-1。

1.2 試驗(yàn)儀器

制冰機(jī)（SIM-124）購自南京晧海儀器儀表有限公司，恒溫恒濕試驗(yàn)箱（JATH802000）購自上海井岸儀器有限公司，PCR 儀(T100)購自美國伯樂有限公司，連續(xù)流動(dòng)分析儀（AA3）購自天津中通科技發(fā)展有限公司，馬弗爐（HYP-308）購自深圳市三莉科技有限公司，火焰光度計(jì)（FP640）購自青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

篩選健壯人參苗進(jìn)行試驗(yàn)，共設(shè)計(jì)4 個(gè)處理。處理1：未添加有機(jī)肥和促生菌的對(duì)照組（CK）；處理2：僅施用有機(jī)肥（F）；處理3：僅施用促生菌（J）；處理4：有機(jī)肥和促生菌混合施用（J+F）。每處理重復(fù)3次，每重復(fù)3盆，每盆栽植人參苗3株。塑料花盆尺寸25 cm×10 cm，裝入1.65 kg 試驗(yàn)用土。其中，有機(jī)肥施用量均為500 g·盆-1；施用的促生菌為G119，菌含量1.0×10-8cfu·mL-1，用量25 mL。試驗(yàn)前各處理進(jìn)行統(tǒng)一灌溉，試驗(yàn)期間為盆栽人參搭建避雨棚并加蓋1 層遮陰網(wǎng)，以防止降雨對(duì)試驗(yàn)的干擾。當(dāng)各處理含水量達(dá)70%后不再澆水，自然干旱10 d，使各盆栽土壤含水量達(dá)到35%~45%時(shí)取人參植株及其根際土壤帶回實(shí)驗(yàn)室，用于各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.4 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.4.1土壤含水量測(cè)定 收集土壤樣品，立即稱量鮮重（fresh weight，F(xiàn)W），然后放入105 ℃烘干箱烘干48 h，稱干重（dry weight，DW），并計(jì)算土壤含水量（soil water content，SWC）。

1.4.2土壤pH與電導(dǎo)率測(cè)定 土壤pH和電導(dǎo)率（electric conductivity，EC）采用5∶1的水土比，分別用雷磁pH計(jì)和電導(dǎo)率儀測(cè)定。

1.4.3土壤養(yǎng)分含量測(cè)定 采用CaCl2浸提土壤后，用培養(yǎng)皿擴(kuò)散法測(cè)定土壤堿解氮含量；采用0.5 mol·L-1NaHCO3法測(cè)定土壤速效磷含量；采用火焰光度法和火焰光度計(jì)測(cè)定土壤速效鉀含量[7]。

1.4.4土壤酶活性測(cè)定 采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測(cè)定土壤脲酶（urease）活性，以24 h 后每克土壤中NH3-N 的毫克數(shù)來表示脲酶活性；采用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定土壤蔗糖酶（sucrase）活性，用24 h 后每克土壤葡萄糖的毫克數(shù)表示[8-9]。

1.4.5土壤總DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及高通量測(cè)序 采用 PowerSoil?DNA Isolation Kit 試劑盒提取土壤 DNA，通過高通量測(cè)序測(cè)定16S rRNA 基因的V3~V4 區(qū)，PCR 擴(kuò)增引物為F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’；R：5’-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT-3’。PCR 體系20 μL：5×PCR Buffer Ⅱ 4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，0.4 μmol·L-1的正、反向引物各0.8 μL，TransStart FastPfu DNA Polymerase 0.4 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。PCR 程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)試劑盒回收后，采用Illumina HiSeq 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序（北京百邁客生物科技有限公司）。

1.4.6人參抗氧化酶測(cè)定 采用氮藍(lán)四唑（nitroblue tetrazolium，NBT）法檢測(cè)人參超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；采用愈創(chuàng)木酚比色法檢測(cè)人參過氧化物酶（peroxidase，POD）活性；采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性；采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）比色法測(cè)定丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量[9]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

基于 Illumina HiSeq 測(cè)序平臺(tái)，利用雙末端測(cè)序(paired-end)的方法，構(gòu)建小片文庫進(jìn)行測(cè)序。通過對(duì)Reads 拼接過濾，在相似性97%水平上進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）劃分，對(duì)物種進(jìn)行注釋及豐度分析。進(jìn)一步利用Mothur 1.30 軟件分析α 多樣性，包括Chao1指數(shù)和Shannon 指數(shù)。利用QIIME1.8.0 軟件分析β 多樣性，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性與差異性。采用Excel 2016 與SPSS 17 進(jìn)行各處理間土壤理化性質(zhì)、土壤酶活力以及人參酶活力數(shù)據(jù)整理和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下施加促生菌與有機(jī)肥對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

土壤含水率、pH 和EC 的變化對(duì)植物的生長(zhǎng)有顯著影響，土壤中的堿解氮、有效磷和速效鉀是人參生長(zhǎng)所必需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素。從表1 可以看出，不同處理組間的理化性質(zhì)存在顯著差異（P<0.05），其中J+F 處理的土壤含水率、pH、EC 及堿解氮、有效磷和速效鉀含量均高于其他處理，說明促生菌和有機(jī)肥具有協(xié)同作用，有利于提高土壤有效養(yǎng)分含量。F 處理土壤的堿解氮和有效磷含量顯著高于J 處理，而速效鉀含量相反，表明對(duì)于提高土壤氮、磷含量，有機(jī)肥的作用高于促生菌，而在提高土壤鉀含量上，促生菌的作用優(yōu)于有機(jī)肥。

表1 不同處理組土壤的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of soil of different treatments

2.2 干旱脅迫下施加促生菌與有機(jī)肥對(duì)土壤酶活性的影響

土壤脲酶活性與土壤的微生物數(shù)量及有機(jī)質(zhì)、全氮和速效磷含量呈正相關(guān)，因此常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素狀況；蔗糖酶活性與土壤肥力呈正相關(guān)，土壤肥力越高，酶活性越高。從表2可以看出，J+F處理土壤的脲酶和蔗糖酶活性顯著高于其他處理（P<0.05）；且單獨(dú)施用有機(jī)肥或促生菌都能有效提高土壤脲酶和蔗糖酶活性。對(duì)于提高土壤脲酶活性，促生菌的作用優(yōu)于有機(jī)肥；而對(duì)于提高蔗糖酶活性，有機(jī)肥的作用優(yōu)于促生菌。

表2 不同處理組的土壤酶活性Table 2 Soil enzyme activities of different treatments

2.3 干旱脅迫下施加促生菌與有機(jī)肥對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響

不同處理人參根際細(xì)菌在門水平的群落組成如圖1 所示。各處理均共檢測(cè)到7 個(gè)主要優(yōu)勢(shì)菌門，分別為變形菌門（Proteobacteria），擬桿菌門（Bacteroidetes），酸桿菌門（Acidobacteria），放線菌門（Actinobacteria），厚壁菌門（Firmicutes），疣微菌門（Verrucomicrobia）和芽單胞菌門（Gemmatimonadete）。與CK 相比，變形菌門在3 個(gè)處理組的相對(duì)豐度顯著降低，芽單胞菌門的相對(duì)豐度增高。各處理根際細(xì)菌門水平相對(duì)豐度差異較大。擬桿菌門和酸桿菌門在F 和J+F 處理的相對(duì)豐度有所升高，但在J 處理的相對(duì)豐度變化較小。

圖1 不同處理組人參根際細(xì)菌門的組成Fig. 1 Composition of ginseng rhizosphere bacteria in different treatment groups at phylum level

在屬水平上，4 個(gè)處理組的細(xì)菌群落組成如圖2所示，共檢測(cè)到鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、假單胞菌屬 （Pseudomonas）、溶桿菌屬（Lysobacter）、鹽單胞菌屬（Halomonas）、葉黃素單胞菌（Luteimonas）、德沃斯氏菌屬（Devosia）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、波瓦利桿菌（Povalibacter）和新鞘脂菌屬（Novosphingobium）9個(gè)菌屬。

圖2 不同處理組人參根際細(xì)菌在屬水平上的群落組成Fig. 2 Composition of ginseng rhizosphere bacteria in different treatments at genus level

與CK 相比，J 處理中鞘脂單胞菌屬、溶桿菌屬和德沃斯氏菌屬的相對(duì)豐度增加；F 處理中溶桿菌屬的相對(duì)豐度增加，假單胞菌屬的相對(duì)豐度減少；J+F 處理中假單胞菌屬的相對(duì)豐度減少，鹽單胞菌屬的相對(duì)豐度最高。即不同處理根際細(xì)菌群落組成在屬水平上存在顯著差異，通過外源施用有機(jī)肥或促生菌處理可以改變?nèi)藚⒏H細(xì)菌群落在屬水平上的組成和豐度，其中，溶桿菌屬是促生菌處理后與對(duì)照差異較大的共有菌屬。

2.4 干旱脅迫下施加促生菌與有機(jī)肥對(duì)人參抗逆性的影響

植物正常代謝過程和在各種環(huán)境脅迫下均能產(chǎn)生活性氧和自由基，活性氧和自由基的積累引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷，因此，植物需要啟動(dòng)一系列抗氧化酶系統(tǒng)以清除這些物質(zhì)。過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）是活性氧清除系統(tǒng)中的重要抗氧化酶。丙二醛（MDA）含量是植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度的體現(xiàn)，MDA 含量高，說明植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度高，細(xì)胞膜受到的傷害嚴(yán)重。從表3 可以看出，J+F 處理人參的POD、SOD 和CAT 的酶活性顯著高于其他處理（P<0.05）；除CAT外，促生菌對(duì)提高酶活性的作用均優(yōu)于有機(jī)肥，且兩者間還具有協(xié)同作用。J+F處理人參的MDA含量顯著低于其他處理；J 處理的MDA 含量又低于F 處理，說明促生菌對(duì)于緩解干旱對(duì)細(xì)胞的傷害起主要作用，且有機(jī)肥與促生菌間還具有協(xié)同作用。以上結(jié)果表明，在干旱脅迫條件下，單獨(dú)施用有機(jī)肥或促生菌處理均能提升人參在干旱脅迫下的抗氧化能力，而有機(jī)肥和促生菌配合施用效果最優(yōu)。

表3 不同處理組之間抗逆性相關(guān)因子的變化Table 3 Changes of stress resistance-related factors among different treatment groups

3 討論

活性氧是氧化傷害的最重要來源，當(dāng)植物處于不利環(huán)境時(shí)，會(huì)啟動(dòng)保護(hù)自身的抗氧化酶系統(tǒng)以消除過量的氧自由基。在脅迫環(huán)境下，植物的抗氧化酶活性越高，清除體內(nèi)活性氧的能力越強(qiáng)，對(duì)植物體自身的保護(hù)程度越高[10]。有關(guān)人參干旱脅迫的研究中，大多從干旱脅迫下人參的栽培技術(shù)、不同種人參抗性生理指標(biāo)的比較以及干旱脅迫程度對(duì)人參生理生化指標(biāo)的影響等方面展開[11-13]。然而，通過PGPR 和有機(jī)肥的不同組合探討其對(duì)人參抗旱性影響的研究還鮮見報(bào)道。研究表明，將產(chǎn)ACC 脫氨酶的促生菌接入可降解乙烯的中間產(chǎn)物 ACC，有利于植物抵御干旱脅迫[14]。本研究表明，將人參接種PGPR，或與有機(jī)肥配合施用，其抗氧化酶（SOD、POD 和CAT）活性均較CK 顯著提高，表明PGPR 的施用有利于提高人參的抗旱性。

鄭冬梅[15]研究表明，三七的抗氧化酶活性在一定范圍內(nèi)隨著硝態(tài)氮含量的增加逐漸上升，這是由于植物吸收大量的硝酸根離子，對(duì)根系起到一定的保護(hù)作用，使根部抗氧化酶活性較高。李憲利等[16]研究表明，在一定范圍內(nèi)增加土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量，蘋果根系的SOD 和POD 活性升高。本研究表明，添加有機(jī)肥或有機(jī)肥協(xié)同促生菌處理土壤的硝態(tài)氮含量明顯較高，且人參SOD、POD活性顯著高于CK，與前人研究結(jié)果一致。

作物在吸收硝態(tài)氮過程中，會(huì)引起土壤pH特別是根際土壤環(huán)境pH的變化，若能使土壤保持較好的氣體流動(dòng)和通氣效果，土壤中的硝化細(xì)菌可將硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮，同時(shí)釋放某種物質(zhì)，從而引起土壤pH 下降，這種現(xiàn)象又會(huì)影響植物對(duì)2 種氮素的吸收利用[17]。本研究表明，施用有機(jī)肥或有機(jī)肥與促生菌配合施用處理的土壤硝態(tài)氮含量較高，且人參根際土壤環(huán)境 pH較低。張衛(wèi)東等[18]研究表明，施入有機(jī)肥后短期內(nèi)不能被完全吸收，引起鹽分的聚集，導(dǎo)致土壤EC 上升，但隨著肥料被吸收土壤EC 會(huì)逐漸下降，這與本研究結(jié)果一致。

有機(jī)肥的施入使土壤營(yíng)養(yǎng)元素得到轉(zhuǎn)化，同時(shí)能夠加速土壤環(huán)境中的有機(jī)-無機(jī)物轉(zhuǎn)化，這些過程有大量細(xì)菌、真菌等微生物參與，尤其在植物根部微生物活動(dòng)更加活躍[19]。植物殘?bào)w作為肥料施入土壤后不僅能夠提高土壤肥沃程度，改善土壤結(jié)構(gòu)，對(duì)土壤的生物學(xué)特性也有重要影響[20]。此外，將秸稈作為肥料施入土壤2 個(gè)月后，對(duì)土壤肥沃程度和微生物群落組成影響較大，這是由于植物殘?bào)w中含有大量的纖維素等物質(zhì)，激活了土壤環(huán)境中纖維素降解菌群的繁殖和代謝能力[21]。因此有機(jī)肥或有機(jī)肥與促生菌配施2 個(gè)處理中的營(yíng)養(yǎng)元素含量顯著高于CK，且施入有機(jī)肥后的土壤更適宜促生菌生長(zhǎng)，使其發(fā)揮作用，顯著提升根系土壤的銨態(tài)氮、速效磷含量。

田稼等[22]研究發(fā)現(xiàn)，土壤脲酶與蔗糖酶活性呈極顯著正相關(guān)，同時(shí)在一定范圍內(nèi)這2 種酶的活性與土壤肥沃程度呈正比。土壤中氮肥的水解需要脲酶，脲酶發(fā)生酶促反應(yīng)后其產(chǎn)物可為作物提供營(yíng)養(yǎng)元素。宋日等[23]研究表明，生物有機(jī)肥可顯著提高土壤脲酶、蔗糖酶活性。有機(jī)肥不僅能夠改善植物根際營(yíng)養(yǎng)條件，改良土壤結(jié)構(gòu)，增加微生物豐度等，還能顯著提高植物抗逆性[24-25]。因此在干旱條件下單獨(dú)施用促生菌雖不能提高土壤脲酶活性，但能夠顯著提升蔗糖酶活性，且配合有機(jī)肥混合施用效果更顯著。

綜上所述，產(chǎn)ACC 脫氨酶促生菌G119 與有機(jī)肥協(xié)同配合施用能夠提高人參抵御干旱脅迫的能力，表現(xiàn)為人參SOD、POD 和CAT 活性增加，分別可達(dá)232.89、25.00 和39.50 U·g-1·min-1。促生菌和有機(jī)肥處理參地土壤對(duì)根際細(xì)菌在門水平和屬水平的群落組成和豐度存在較大影響，能適度降低人參根際土壤pH，同時(shí)提高土壤EC；人參根際土壤養(yǎng)分含量以及土壤脲酶、蔗糖酶活性均顯著上升。