響應(yīng)面法改良牟氏角毛藻培養(yǎng)基

李琦， 張樹林， 張達(dá)娟， 賈瀅暄， 王澤斌

（天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392）

微藻是水生態(tài)系統(tǒng)初級(jí)生產(chǎn)力的主要貢獻(xiàn)者，含有豐富的蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不僅是水生動(dòng)物的優(yōu)質(zhì)天然餌料，而且在保健食品、藥物、飼料、化妝品、生物農(nóng)藥、廢水治理等方面具有較廣泛的應(yīng)用前景，亦可用于改善水質(zhì)[1-5]，進(jìn)行水質(zhì)調(diào)控。牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）是一種海洋硅藻，隸屬硅藻門（Bacillariophyta），其營(yíng)養(yǎng)豐富、生長(zhǎng)迅速、大小適宜，便于對(duì)蝦早期幼體攝食，是對(duì)蝦育苗中常用的餌料微藻，其規(guī)?；囵B(yǎng)一直是研究的熱點(diǎn)之一。

朱昔恩等[6]研究表明，NaNO3效果優(yōu)于CO(NH2)2且NaNO3在25～100 mg·L-1時(shí)效果最好，磷和硅分別在2.5 和30 mg·L-1時(shí)有利于牟氏角毛藻生長(zhǎng)；林權(quán)卓等[7]、張貴杰等[8]研究不同的氮源對(duì)牟氏角毛藻增殖的影響，均認(rèn)為CO(NH2)2效果優(yōu)于NaNO3；于瑾等[9]通過(guò)單因素試驗(yàn)研究表明，氮、磷和鐵對(duì)牟氏角毛藻生長(zhǎng)影響顯著，在正交試驗(yàn)中，當(dāng)?shù)土踪|(zhì)量濃度分別為35和1.5 mg·L-1時(shí)，牟氏角毛藻生長(zhǎng)最快，此時(shí)受氮的影響，鐵對(duì)牟氏角毛藻的生長(zhǎng)影響不顯著。以上研究表明，營(yíng)養(yǎng)鹽的不同種類和含量水平對(duì)牟氏角毛藻的生長(zhǎng)有顯著影響，但各研究結(jié)果之間存在一定的差異，歸其原因是培養(yǎng)基成分種類繁多，關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜。單因素法僅考慮單一因素的影響，缺乏因素間的交互性，正交試驗(yàn)法雖能同時(shí)考慮多種因素，但不能得出因素和響應(yīng)值之間明確的函數(shù)表達(dá)式（即回歸方程），進(jìn)而無(wú)法求得整個(gè)區(qū)域中因素的最佳組合和最優(yōu)值[10]。因此選用高效的方法尤為重要，數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)中的優(yōu)化方法已廣泛應(yīng)用于微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，其中以響應(yīng)面法的效果最顯著[11]。響應(yīng)面法克服正交試驗(yàn)法不能給出直觀圖像的缺點(diǎn)，彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法中非線性關(guān)系的深度不足并且考慮誤差，建立多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，對(duì)模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)并得出最優(yōu)值。本研究用響應(yīng)面法優(yōu)化牟氏角毛藻培養(yǎng)基，篩選營(yíng)養(yǎng)鹽最佳質(zhì)量濃度，為其高密度培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

牟氏角毛藻購(gòu)自上海光語(yǔ)生物科技有限公司，在f/2 培養(yǎng)基上于光照培養(yǎng)箱（MLR352-PC，日本三洋有限公司）中進(jìn)行培養(yǎng)，鹽度29，培養(yǎng)溫度為（22±1）℃，光照強(qiáng)度為50 μmol·m-2·s-1，光照/黑暗時(shí)間為12 h/12 h，每天搖瓶3次，防止沉淀。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用單因素試驗(yàn)法對(duì)f/2培養(yǎng)基的各營(yíng)養(yǎng)鹽濃度進(jìn)行篩選，氮（NaNO3）、磷（NaH2PO4·H2O）、硅（Na2SiO3）、鐵（C6H8FeNO7），每種營(yíng)養(yǎng)鹽均設(shè)置1 個(gè)對(duì)照組（0 mg·L-1）和6 個(gè)試驗(yàn)組（表1），每個(gè)試驗(yàn)組分別設(shè)置3 次重復(fù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的牟氏角毛藻離心（5 000 r·min-1，5 min，4 ℃）并去上清液，將藻泥加入經(jīng)高溫滅菌的上述各試驗(yàn)組的培養(yǎng)基中，藻細(xì)胞初始密度均為1×106cell·mL-1。試驗(yàn)進(jìn)行14 d，培養(yǎng)條件同1.1 藻種培養(yǎng)，在第8 天使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行藻細(xì)胞計(jì)數(shù)，確定4 種營(yíng)養(yǎng)鹽的最適質(zhì)量濃度范圍。

表1 營(yíng)養(yǎng)鹽單因素水平Table 1 Single factor level of nutrients （mg·L-1）

1.2.2響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以A、B、C 和D 分別代表NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3和C6H8FeNO7，經(jīng)單因素試驗(yàn)法篩選出的A、B、C 和D 的適宜質(zhì)量濃度，以此為基礎(chǔ)分別設(shè)置3 個(gè)水平（表2），以密度（Y）為響應(yīng)值，采用Design Expert 11.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件的響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗(yàn)[11-15]，每組設(shè)置3 次重復(fù)，共設(shè)計(jì)29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（中心點(diǎn)重復(fù)5 次，用于估計(jì)試驗(yàn)誤差），以獲取最佳營(yíng)養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平Table 2 Box Behnken experimental factor level（mg·L-1）

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Design-Expert11.0 軟件繪制等高線和響應(yīng)曲面圖。利用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，使用Original繪圖制表。

2 結(jié)果與分析

2.1 營(yíng)養(yǎng)鹽單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

不同質(zhì)量濃度的單一營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)牟氏角毛藻生長(zhǎng)的影響如圖1 所示，在培養(yǎng)至第8 天時(shí)，牟氏角毛藻密度分別在NaNO3質(zhì)量濃度為20 mg·L-1、NaH2PO4·H2O質(zhì)量濃度為2 mg·L-1、Na2SiO3質(zhì)量濃度為50 mg·L-1、C6H8FeNO7質(zhì)量濃度為0.3 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值，分別為6.90×106，6.07×106，5.15×106，5.12×106cell·mL-1，均顯著高于對(duì)照組和其他試驗(yàn)組（P<0.05），根據(jù)牟氏角毛藻生長(zhǎng)情況初步選擇10~30 mg·L-1的NaNO3、1.0~3.0 mg·L-1的NaH2PO4·H2O、20~80 mg·L-1的Na2SiO3和0.1~0.5 mg·L-1的C6H8FeNO7進(jìn)行響應(yīng)優(yōu)化。

圖1 不同營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)牟氏角毛藻生長(zhǎng)的影響Fig. 1 Growth of Chaetoceros muelleri with different nutrient species

2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1回歸分析 響應(yīng)面法結(jié)果見(jiàn)表3，將數(shù)據(jù)通過(guò)Design-Expert 11.0 軟件擬合，得到細(xì)胞密度（Y）和NaNO3（A）、NaH2PO4·H2O（B）、Na2SiO3（C）和C6H8FeNO7（D）的回歸方程如下。

表3 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental results of response surface method

2.2.2方差及殘差分析 對(duì)上述模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4 所示，該回歸方程的F值為29.89，P<0.000 1，模型極顯著；由顯著性水平檢驗(yàn)可知，A、B、C、AC、BC、BD、CD、A2、B2、C2和D2項(xiàng)對(duì)細(xì)胞密度影響顯著（P<0.05）；其中決定系數(shù)R2＝0.967 6，矯正系數(shù)R2＝0.935 3；該模型中精密度值測(cè)量精度為19.407 7，當(dāng)精密度值測(cè)量精度大于4 時(shí)可用；通過(guò)殘差分析，殘差的正態(tài)概率分布圖和預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)實(shí)際值的分布圖（圖2～4）可以看出，圖里的各個(gè)散點(diǎn)都靠近同一條直線。綜上所述，該模型中細(xì)胞密度對(duì)NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3和C6H8FeNO7有較好的擬合性。

圖2 殘差的正態(tài)概率分布Fig. 2 Normal probability distribution of residuals

圖3 殘差與方程預(yù)測(cè)值分布Fig. 3 Residual error and predicted value distribution of the equation

圖4 預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)實(shí)際值分布Fig. 4 Distribution diagram of predicted value and actual value in experiment

2.2.3響應(yīng)面法交互作用分析 NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3、C6H8FeNO7間交互作用的響應(yīng)面分析見(jiàn)圖5，當(dāng)NaH2PO4·H2O（B）和C6H8FeNO7（D）分別為2 和0.3 mg·L-1時(shí)，NaNO3（A）和Na2SiO3（C）的交互作用對(duì)牟氏角毛藻密度的影響，結(jié)合方差分析表可知P<0.05，等高線呈橢圓形且密集，說(shuō)明這2 個(gè)因素有較強(qiáng)的交互作用；隨著NaNO3和Na2SiO3質(zhì)量濃度的增加，藻細(xì)胞密度先上升后下降，NaNO3的幅度大于Na2SiO3的幅度，表明NaNO3在兩者之間的交互影響大于Na2SiO3；同時(shí)質(zhì)量濃度適當(dāng)?shù)腘aNO3和Na2SiO3可在一定程度上提高藻細(xì)胞密度。由圖5 結(jié)合表4可知，等高線明顯呈橢圓形且較密集，說(shuō)明各因素間交互作用強(qiáng)，對(duì)密度影響極顯著；隨著質(zhì)量濃度的增加，曲面呈先升后降趨勢(shì)，在水平靠近0時(shí)，藻密度（Y）最大。Na2SiO3（C）和C6H8FeNO7（D）分別為50 和0.3 mg·L-1時(shí)，NaNO3（A）和NaH2PO4·H2O（B）的交互作用對(duì)牟氏角毛藻密度的影響，等高線呈橢圓形，說(shuō)明NaNO3和NaH2PO4·H2O 有交互作用，結(jié)合方差分析可知P>0.05，表明這2 個(gè)因素交互作用較弱；隨著NaNO3和NaH2PO4·H2O 質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞密度分別在水平0右側(cè)和靠近水平1的地方達(dá)到最大密度。NaNO3和C6H8FeNO7等高線呈橢圓特征，說(shuō)明 NaNO3和C6H8FeNO7有交互作用，在表4中2因素表現(xiàn)為P>0.1，密度影響不顯著，交互作用較弱。

圖5 各因素交互作用對(duì)細(xì)胞密度的等高線和響應(yīng)面圖Fig. 5 Contour line and response surface diagram of interaction of various factors on cell density

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)分析

通過(guò)響應(yīng)面軟件Design-Expert 11.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)一步的擬合分析，得到NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3和C6H8FeNO7的最佳質(zhì)量濃度分別為21.8、2.93、54.2 和0.158 mg·L-1時(shí)，藻細(xì)胞密度達(dá)到最大值。

將牟氏角毛藻接種于優(yōu)化后的培養(yǎng)基，NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3和C6H8FeNO7的最佳質(zhì)量濃度分別為21.8、2.93、54.2 和0.158 mg·L-1，其余營(yíng)養(yǎng)鹽以f/2 培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)。牟氏角毛藻生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖6，在培養(yǎng)12 d 時(shí)藻密度達(dá)到最大值，為10.62×106cell·mL-1，顯著高于對(duì)照組（8.3×106cell·mL-1），藻細(xì)胞密度提高27.95%。從圖7 可以看出，試驗(yàn)組與對(duì)照組中都具有一定的光合活性。試驗(yàn)組中光合系統(tǒng)PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)換效率的值逐漸上升，一直在較高的范圍內(nèi)浮動(dòng)，而對(duì)照組在第8天后開始緩慢下降。

圖6 試驗(yàn)組與對(duì)照組的生長(zhǎng)曲線Fig. 6 Growth curves of experimental and control group

圖7 試驗(yàn)組與對(duì)照組的最大光能轉(zhuǎn)化效率Fig. 7 Maximum light energy conversion efficiency of experimental group and control group

3 討論

氮、磷、硅和鐵是藻類生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，在硅藻培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)揮不可替代的作用。其中,氮可以讓藻類大量繁殖，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、成熟和分裂；磷是細(xì)胞膜的重要組成成分，在細(xì)胞中起傳遞能量的作用，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)酸堿度對(duì)培養(yǎng)基起緩沖作用；硅不僅是硅藻細(xì)胞壁的主要組成成分，而且還是生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，參與細(xì)胞的多種生長(zhǎng)代謝過(guò)程；鐵是底棲硅藻重要的電子傳遞體，也是細(xì)胞內(nèi)某些還原酶系的組成成分，鐵源缺乏會(huì)降低硝態(tài)氮的還原水平，同時(shí)會(huì)抑制藻類細(xì)胞的生長(zhǎng)[16]。

研究表明，氮、磷、硅和鐵均對(duì)藻類的生長(zhǎng)有顯著性影響，其中氮的影響最顯著。張國(guó)慶等[17]研究表明，氮、磷、硅和鐵濃度分別在30、2、10、0.2 mg·L-1時(shí)細(xì)胞密度最大。本研究中，當(dāng)?shù)獮?0 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞密度達(dá)到6.93×106cell·mL-1，顯著高于對(duì)照組和其他試驗(yàn)組(P<0.05)，隨著氮質(zhì)量濃度的升高，牟氏角毛藻可能通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和葉綠素的合成，提高光合系統(tǒng)PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)換效率，促進(jìn)藻類的生長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，張國(guó)慶等[17]試驗(yàn)周期和選用藥品與本研究不同，可能是周期較短，藻類生長(zhǎng)速率較低，故造成密度上的差異；NaH2PO4·H2O 培養(yǎng)液呈酸性，牟氏角毛藻在消耗硝酸鹽并進(jìn)行光合作用的過(guò)程中pH會(huì)逐漸上升，酸性NaH2PO4·H2O培養(yǎng)液可維持相對(duì)穩(wěn)定的pH，為牟氏角毛藻創(chuàng)造良好的生長(zhǎng)和增殖環(huán)境。硅是微型硅藻合成細(xì)胞壁的必需元素，缺硅則無(wú)法形成外殼并完成其正常生長(zhǎng)周期[6]。Shifrin等[18]研究發(fā)現(xiàn)，微藻在缺硅的條件下1 周，細(xì)胞就會(huì)停止分裂甚至死亡。本研究中硅源的最適質(zhì)量濃度為50 mg·L-1，藻細(xì)胞密度可達(dá)5.15×106cell·mL-1，培養(yǎng)溫度及光強(qiáng)分別為（22±1）℃和50 μmol·m-2·s-1，明顯低于張國(guó)慶等[17]培養(yǎng)條件，由此可見(jiàn)牟氏角毛藻對(duì)溫度和光照比較敏感，培養(yǎng)液中添加C6H8FeNO7后，牟氏角毛藻的密度試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組，印證了鐵是硅藻生長(zhǎng)中必需的微量元素，由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知在0.1～0.5 mg·L-1時(shí)最適宜牟氏角毛藻生長(zhǎng)。

綜合上述研究發(fā)現(xiàn)，前人試驗(yàn)大多集中在篩選營(yíng)養(yǎng)鹽的種類并使用單因素試驗(yàn)得出各最適水平。本研究采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，考慮到多種營(yíng)養(yǎng)鹽種類并結(jié)合起來(lái)優(yōu)化對(duì)比分析，更系統(tǒng)地得到牟氏角毛藻最佳的營(yíng)養(yǎng)鹽水平，對(duì)局部最具特征的點(diǎn)進(jìn)行研究試驗(yàn)，又在點(diǎn)的基礎(chǔ)上對(duì)整體的“面”進(jìn)行精準(zhǔn)地預(yù)測(cè)，回歸擬合整體范圍內(nèi)各因素之間的雙方的關(guān)系[19-21]。結(jié)合方差分析和等高線圖得到各營(yíng)養(yǎng)鹽間存在交互作用，進(jìn)而得出4因素對(duì)提升牟氏角毛藻細(xì)胞密度的最優(yōu)值，平衡各營(yíng)養(yǎng)鹽，提高藻的生長(zhǎng)速率。從回歸模型方差分析中可以看出NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3、NaNO3和Na2SiO3、NaH2PO4·H2O和Na2SiO3、NaH2PO4·H2O和C6H8FeNO7、Na2SiO3和C6H8FeNO7均對(duì)牟氏角毛藻生長(zhǎng)有顯著性影響，而NaNO3和NaH2PO4·H2O 與C6H8FeNO7影響不顯著，可能磷和鐵的水平較低，氮起主導(dǎo)性作用會(huì)對(duì)磷和鐵有一定的抑制。于瑾等[9]表明，當(dāng)?shù)|(zhì)量濃度為35 mg·L-1時(shí)，顯著抑制牟氏角毛藻對(duì)鐵的吸收。響應(yīng)面反映的是NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3和C6H8FeNO74 個(gè)因素中任意2個(gè)取零水平時(shí)，剩余2個(gè)因素相互作用對(duì)牟氏角毛藻密度的影響。通過(guò)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)一步擬合分析，給出最佳反應(yīng)條件，得到最優(yōu)值，即在NaNO3為21.8 mg·L-1、NaH2PO4·H2O 為2.93 mg·L-1、Na2SiO3為54.2 mg·L-1、C6H8FeNO7為0.158 mg·L-1時(shí)藻細(xì)胞密度達(dá)到最大值，對(duì)比原培養(yǎng)基，藻細(xì)胞密度提高了27.95%。