活化轉(zhuǎn)錄因子4參與甲基化修飾與巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的關(guān)聯(lián)研究

趙奕琳 劉田恬 馮舒云 張育才 王春霞

膿毒癥是危重癥患者死亡的主要原因?！澳摱景Y3.0”定義膿毒癥為由宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙，其臨床特征表現(xiàn)為早期的急性炎癥因子風(fēng)暴和后期的免疫抑制所致的二次感染風(fēng)險(xiǎn)的增加，從而誘發(fā)多器官功能障礙，導(dǎo)致患者預(yù)后不良[1-3］。據(jù)估計(jì)，全球范圍內(nèi)每年約有120萬兒童膿毒癥病例和300萬新生兒膿毒癥病例[4］。膿毒癥免疫炎癥反應(yīng)與細(xì)胞代謝變化息息相關(guān)，尤其是固有免疫細(xì)胞的功能改變。已有學(xué)者提出了“膿毒癥免疫代謝”的概念[5］。表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、轉(zhuǎn)錄因子等綜合分析研究[6］發(fā)現(xiàn)，基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)組蛋白的修飾標(biāo)記[如組蛋白H3第4位賴氨酸上單甲基化修飾（monomethylation of histone H3 on lysine 4，H3K4me1）和組蛋白H3第4位賴氨酸上三甲基化修飾（trimethylation of histone H3 on lysine 4，H3K4me3）等］與免疫活性調(diào)控有關(guān)。與非膿毒癥患者相比，膿毒癥患者全血DNA的443個(gè)基因中存在668個(gè)甲基化位點(diǎn)差異，多聚焦于IFN-γ等免疫反應(yīng)信號途徑，從而影響患者的病情嚴(yán)重程度[7］。目前，膿毒癥表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制的研究尚處于起步階段[8］，而甲基化修飾為膿毒癥的病理生理研究提供了新視角，亟待深入探索。

表1 ATF4參與巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的甲基化修飾相關(guān)基因的GO分析

活化轉(zhuǎn)錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4）靶向下游基因，參與脂肪細(xì)胞糖脂能量代謝[9-11］、肝臟糖異生和脂質(zhì)代謝[12-13］等病理生理過程。本課題組前期研究[14-15］發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞內(nèi)ATF4表達(dá)水平增高及其介導(dǎo)的肝細(xì)胞自噬激活是膿毒癥發(fā)生時(shí)肝臟自我保護(hù)的重要機(jī)制。相關(guān)研究[16］也顯示，ATF4可作為新型調(diào)節(jié)因子調(diào)控單核細(xì)胞向腸道駐留巨噬細(xì)胞分化。在人單核巨噬細(xì)胞中，ATF4被toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）招募，促進(jìn)炎癥因子分泌[17］；或者ATF4調(diào)控細(xì)胞代謝重編程，以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2亞型極化[18］。鑒于甲基化修飾在膿毒癥病理生理機(jī)制調(diào)控中的重要作用，本研究擬采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞系（即RAW264.7細(xì)胞系），并基于染色質(zhì)免疫共沉淀測序（ChIP-seq）和RNA高通量測序（RNA-seq）技術(shù)，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)探究ATF4作為甲基化修飾調(diào)節(jié)因子參與巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及其分組 采用1μg／m L LPS（批號為E.coli 0111：B4，美國默克Sigma-Aldrich公司）處理小鼠RAW 264.7細(xì)胞系（購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫）8 h，納入LPS組；采用PBS（廣州蘭杰柯科技有限公司Biosharp）在同等條件下處理RAW 264.7細(xì)胞系8 h，納入對照組。每組各3例樣本，收集各組細(xì)胞系用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）將設(shè)計(jì)好的引物粉末[生工生物工程（上海）股份有限公司］以12 000 r／min（離心半徑為16.5 cm）常溫離心2 min后，加入雙蒸水溶解；在96孔板（美國Corning公司）中以1μL前引物+1μL后引物+5μL SYBR Green+3μL稀釋過的樣本工作液的體系加樣；于Light Cycler儀器（瑞士羅氏公司）進(jìn)行q RT-PCR。目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率均為100%，采用2-△△CT法分別計(jì)算LPS組和對照組目的基因ATF4 mRNA相對于內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)量。

1.3 免疫印跡（Western Blotting）實(shí)驗(yàn) LPS組和對照組細(xì)胞系均經(jīng)RIPA裂解液提取總蛋白質(zhì)。配置好電泳凝膠后，將煮沸、離心后的蛋白質(zhì)樣品吹打均勻后上樣。加樣完成后，設(shè)置電泳儀為恒壓150 V，電泳50 min，待目的蛋白質(zhì)分離至所需位置，終止電泳。電泳完成后，準(zhǔn)備適當(dāng)大小聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，在低溫條件下，將凝膠與PVDF膜固定，設(shè)置電泳儀為恒流200 m A，轉(zhuǎn)膜90 min。轉(zhuǎn)膜完成后，先將PVDF膜置于5%脫脂牛奶內(nèi)封閉60 min。封閉完成后，將目的蛋白質(zhì)對應(yīng)的PVDF膜置于以ATF4抗體（批號為60035-1-Ig，美國Proteinted公司；使用5%脫脂牛奶稀釋，稀釋比例為1∶1 000）配制的溶液中，4℃條件下孵育過夜，以GAPDH作為內(nèi)參。一抗孵育完成后，使用配置好的山羊抗兔辣根過氧化酶標(biāo)記二抗（上海萊茲生物科技有限公司），室溫孵育1 h后曝光。應(yīng)用ImageJ軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值，以定量蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量。

1.4 ATF4 ChIP-seq分析 以1×107／m L的密度接種細(xì)胞系于10 cm培養(yǎng)皿中，經(jīng)LPS處理8 h后，使用1%甲醛交聯(lián)，使DNA與蛋白質(zhì)的相互作用被交聯(lián)固定；交聯(lián)完成后，裂解細(xì)胞系，得到全細(xì)胞的裂解液，去除蛋白質(zhì)，分離純化核酸，去除雜質(zhì)等，提取核DNA；隨后行超聲處理，將基因組DNA打斷，取部分破碎產(chǎn)物解交聯(lián)。應(yīng)用凝膠電泳檢測總DNA完整性和片段化情況，后分別結(jié)合ATF4抗體或免疫球蛋白（Ig）G（對照抗體），孵育過夜。應(yīng)用免疫沉淀試劑盒（上海Aksmics公司）沉淀與目的蛋白質(zhì)結(jié)合的染色質(zhì)片段，應(yīng)用TruSeq Nano DNA樣本制備試劑盒（美國Illumina公司）制備測序文庫DNA樣本，并在Illumina HiSeq 4000平臺(tái)（美國Illumina公司）進(jìn)行測序?；谀Ｐ偷腃hIP-seq分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的芯片富集區(qū)域（即峰，P≤0.01）進(jìn)行進(jìn)一步分析，以差異倍數(shù)（Fold Change，F(xiàn)C）值≥2.0、P≤0.001作為差異富集區(qū)的分類標(biāo)準(zhǔn)，利用ChIP-seq數(shù)據(jù)生成UCSC WIG文件格式的信號剖面（分辨率為10 bp），并在UCSC基因組瀏覽器上完成可視化。

1.5 RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序分析 應(yīng)用TRIzol試劑（批號為15596018，美國英杰生命技術(shù)有限公司）提取RAW264.7細(xì)胞系總RNA，應(yīng)用RNAseq文庫準(zhǔn)備試劑盒（美國Illumina公司）將總RNA轉(zhuǎn)化為測序文庫，應(yīng)用Agilent 2100 Bioanalyzer（美國Agilent Technologies公司）評估RNA文庫質(zhì)量后，在Illumina HiSeq 4000平臺(tái)進(jìn)行測序。以log2｜FC｜≥0.585、P≤1作為差異表達(dá)基因（DEGs）的分類標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 甲基化相關(guān)DEGs的富集分析 整合ATF4 ChIP-seq分析和RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果，采用京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG；網(wǎng)址為https：∥www.genome.jp／kegg／）、基因本體（Gene Ontology，GO）分析，尋找與甲基化修飾相關(guān)通路，設(shè)定P＜0.05，獲得最終富集通路。從富集通路中獲取ATF4調(diào)控的甲基化修飾核心基因。

1.7 胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（Cp G）島分布情況分析應(yīng)用MethPrimer平臺(tái)（http：∥www.urogene.org／methprimer）[19］在線預(yù)測ATF4參與巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)甲基化修飾的關(guān)鍵靶基因的Cp G島的分布情況。

1.8 通路富集分析和蛋白質(zhì)相互作用分析 基于甲基化修飾相關(guān)DEGs，應(yīng)用STRING在線工具（https：∥cn.string-db.org／）識別蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用Cytoscape軟件（3.9.1版本）的MCODE插件分析出最重要的功能模塊，以及各基因間的相互作用關(guān)系。應(yīng)用DAVID 6.8在線生物信息數(shù)據(jù)庫（https：∥david.ncifcrf.gov／）進(jìn)行DEGs的功能和通路富集分析。應(yīng)用Sangerbox 3.0在線分析網(wǎng)站[20］（http：∥sangerbox.com／home.html）制作上述分析結(jié)果的可視化圖像。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Graphpad Prism 8.0.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用非配對t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LPS刺激RAW 264.7細(xì)胞系后ATF4蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)情況 LPS組ATF4蛋白質(zhì)和mRNA的相對表達(dá)量分別為0.446±0.049和0.089±0.009，分別顯著高于對照組的0.079±0.049和0.047±0.009（t＝7.507、4.771，P值均＜0.001）。見圖1。

圖1 RAW264.7細(xì)胞系A(chǔ)TF4蛋白質(zhì)的表達(dá)情況

2.2 ATF4介導(dǎo)參與巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的甲基化修飾相關(guān)基因 對LPS組開展ATF4的ChIPseq和RNA-seq分析實(shí)驗(yàn)，并經(jīng)KEGG和GO通路富集分析發(fā)現(xiàn)，ATF4參與巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的甲基化修飾相關(guān)基因?yàn)?0個(gè)，其功能分別聚焦于組蛋白甲基化、組蛋白去甲基化、蛋白質(zhì)甲基化、mRNA甲基化通路。見表1、圖2。

圖2 經(jīng)GO通路富集分析發(fā)現(xiàn)的40個(gè)核心基因的功能富集分析

2.3 篩選受c AMP反應(yīng)元件（c AMP response element，CRE）調(diào)控且存在甲基化修飾功能的關(guān)鍵基因 基于KEGG與GO富集通路分析結(jié)果，對40個(gè)相關(guān)基因中的單個(gè)基因甲基化修飾的功能進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，鎖定潛在的19個(gè)靶基因：Bcor，Brca1，Btg1，Carm1，Ehmt1，Ezh2，Jmjd1c，Kdm3a，Kdm4b，Kdm4c，Mettl8，Mettl14，Mettl16，Nsd3，Nsun2，Prmt2，Prmt6，Tet2，Tet3。CRE為ATF4公認(rèn)的DNA結(jié)合位點(diǎn)，以此參與基因表達(dá)調(diào)控。進(jìn)一步結(jié)合文獻(xiàn)檢索結(jié)果，根據(jù)上述基因是否存在CRE位點(diǎn)調(diào)控，篩選并獲得ATF4調(diào)控甲基化修飾相關(guān)的7個(gè)潛在靶基因：Brca1，Btg1，Carm1，Ezh2，Kdm3a，Kdm4b，Prmt6。

2.4 Cp G島分布情況 通常將基因的啟動(dòng)子區(qū)域5’端非翻譯區(qū)（5’UTR）和第1個(gè)外顯子區(qū)的鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）配對占比≥50%的區(qū)域稱為Cp G島，其長度為200 bp～1 kb。DNA的Cp G島被甲基化后，蛋白質(zhì)不能結(jié)合DNA，進(jìn)而使轉(zhuǎn)錄沉默。為了揭示ATF4潛在靶基因是否受甲基化修飾影響，本研究應(yīng)用MethPrimer平臺(tái)在線預(yù)測7個(gè)基因翻譯起始位點(diǎn)的Cp G島，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Prmt6有1個(gè)CpG島，為48～1 135 bp；Kdm3a有2個(gè)CpG島，分別為48～611 bp、1 073～1 224 bp；Brca1有2個(gè)CpG島，分別為49～239 bp、405～533 bp；Ezh2有1個(gè)CpG島，為48～1 161 bp；Carm1有1個(gè)Cp G島，為46～647 bp；Btg1有3個(gè)CpG島，分別為48～407 bp、467～1 020 bp、1 096～1 232 bp；Kdm4b有2個(gè)Cp G島，分別為49～718 bp、748～898 bp。見圖3。

圖3 7個(gè)潛在靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島分布情況

2.5 ATF4調(diào)節(jié)甲基化修飾的PPI網(wǎng)絡(luò)分析與GO分析 PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，Brca1、Btg1、Carm1、Ezh2、Kdm3a、Kdm4b，Prmt6之間分別存在交互作用。進(jìn)一步通過Sangerbox3.0在線分析網(wǎng)站的GO分析發(fā)現(xiàn)，Brca1、Btg1、Carm1、Ezh2、Kdm3a、Kdm4b、Prmt6的功能主要聚焦于組蛋白甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)的共價(jià)修飾等。見圖4。

圖4 7個(gè)潛在靶基因的GO分析

3 討 論

在膿毒癥的病理生理學(xué)過程中，機(jī)體的巨噬細(xì)胞可通過適度的免疫炎癥反應(yīng)上調(diào)一定水平的炎癥因子清除感染病原體。本研究采用LPS處理RAW264.7細(xì)胞系，基于ATF4 ChIP-seq和RNA-seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)ATF4參與的巨噬細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng)與甲基化修飾的相關(guān)通路緊密相關(guān)，亦發(fā)現(xiàn)Brca1、Btg1、Carm1、Ezh2、Kdm3a、Kdm4b、Prmt6是潛在的靶基因，并通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，ATF4通過參與調(diào)控巨噬細(xì)胞的基因甲基化修飾，進(jìn)而參與免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)控。

近年來，甲基化修飾作為表觀遺傳學(xué)的修飾方式之一而受到廣泛關(guān)注，其涵蓋蛋白質(zhì)甲基化、蛋白質(zhì)去甲基化和mRNA甲基化等多個(gè)通路。蛋白質(zhì)甲基化通常發(fā)生在賴氨酸或精氨酸殘基，組氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸和天冬氨酸都可發(fā)生甲基化反應(yīng)。甲基化修飾影響蛋白相分離，以及調(diào)控蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與DNA、蛋白質(zhì)與RNA的相互作用，影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等[21-24］。目前，甲基化修飾在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中的作用日益受到重視。本項(xiàng)研究結(jié)果顯示，在LPS處理RAW264.7細(xì)胞系的炎癥反應(yīng)激活過程中，ATF4參與甲基化修飾的核心基因?yàn)?0個(gè)，其功能主要聚焦于組蛋白甲基化、組蛋白去甲基化、蛋白質(zhì)甲基化、mRNA甲基化通路；提示ATF4是巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中調(diào)控甲基化修飾的關(guān)鍵因子。

本研究發(fā)現(xiàn)，40個(gè)基因中有7個(gè)基因具有CRE調(diào)節(jié)位點(diǎn)和Cp G島特征，分別為Brca1、Btg1、Carm1、Ezh2、Kdm3a、Kdm4b和Prmt6。Btg1屬于BTG抗增殖蛋白家族，在針對B細(xì)胞性慢性淋巴細(xì)胞白血病的研究中首次被發(fā)現(xiàn)。近期有研究[25］證實(shí)，ATF4直接靶向調(diào)控Btg1基因；也有研究[26］發(fā)現(xiàn)，Btg1在肝細(xì)胞中通過介導(dǎo)ATF4來調(diào)控肝臟脂質(zhì)累積。Ezh2編碼一種組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶，是目前腫瘤學(xué)研究較多的免疫靶點(diǎn)。Ezh2參與巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)和極化[27-30］、膿毒癥相關(guān)的急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）性肺損傷[29-30］等病理過程。另有研究[31］發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞中加入Ezh2抑制劑沉默Ezh2基因，導(dǎo)致ATF4啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白H3第9位賴氨酸上三甲基化修飾（H3K9me3）和組蛋白H3第27位賴氨酸上三甲基化修飾（H3K27me3）水平顯著降低，組蛋白乙酰化修飾的增加可促進(jìn)ATF4表達(dá)水平的上調(diào)，加劇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)氧化應(yīng)激等病理生理過程的發(fā)生。在巨噬細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng)過程中，ATF4是否直接靶向調(diào)控Ezh2，是否與膿毒癥相關(guān)的氧化應(yīng)激和器官損傷有關(guān)，目前鮮見相關(guān)研究報(bào)道。

Brca1、Carm1、Kdm3a、Kdm4b和Prmt6與ATF4相關(guān)的研究報(bào)道較少。Brca1編碼DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵調(diào)控蛋白，參與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤，與患者預(yù)后密切相關(guān)，是新型的肝癌預(yù)后生物標(biāo)志物[32］。Carm1與組蛋白乙酰化修飾、NF-κB基因表達(dá)相關(guān)[33-34］，筆者推測，該基因可能與巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)路徑相關(guān)。此外，Kdm3a、Kdm4b作為編碼組蛋白去甲基化酶的基因，與腫瘤發(fā)生、線粒體合成密切相關(guān)[35-36］，其可能在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中參與免疫代謝的調(diào)控。精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因Prmt6在腫瘤代謝中，可感受低氧環(huán)境，激活丙酮酸激酶M2-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶介導(dǎo)的Warburg效應(yīng)[37］。Warburg效應(yīng)及糖酵解是巨噬細(xì)胞啟動(dòng)免疫炎癥反應(yīng)的必要條件，故Prmt6可能是ATF4經(jīng)甲基化修飾調(diào)控巨噬細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng)的重要介導(dǎo)分子。

膿毒癥的免疫炎癥反應(yīng)的機(jī)制解析為臨床開發(fā)新型膿毒癥治療方案提供了可能。本研究著力于ATF4介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng)的甲基化修飾水平，探究參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)甲基化修飾的可能分子機(jī)制，并分別聚焦于組蛋白甲基化、組蛋白去甲基化、m RNA甲基化等通路，結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和生物信息學(xué)分析手段，鎖定了7個(gè)（Btg1、Ezh2、Brca1、Carm1、Kdm3a、Kdm4b和prmt6）與ATF4調(diào)控甲基化修飾相關(guān)的潛在靶基因，這為進(jìn)一步探究ATF4通過甲基化修飾調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng)提供了機(jī)制層面的研究線索。但本研究尚存在一定局限性，RAW264.7為小鼠來源的巨噬細(xì)胞系，LPS刺激該細(xì)胞系的膿毒癥模型不能有效模擬菌血癥、陽性細(xì)菌感染引發(fā)的巨噬細(xì)胞的免疫炎癥反應(yīng)。此外，細(xì)胞系與原代培養(yǎng)的細(xì)胞，以及鼠源細(xì)胞和人源細(xì)胞在表型和功能上存在一定差異，故本研究結(jié)果仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證。其次，本研究未進(jìn)一步開展細(xì)胞及動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)層面的靶基因功能分析，故ATF4與潛在靶基因的上下游關(guān)系仍需進(jìn)一步明確。但本研究結(jié)果仍在一定程度上證實(shí)了ATF4可能是巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程中參與甲基化修飾的新型調(diào)節(jié)因子，為后續(xù)的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。