兒童感染性疾病診斷技術(shù)的應用與進展

張 泓 馬 展 韓丁丁 杜青青

感染性疾病是兒童最常見的一類疾病，也是造成兒童死亡的重要原因，嚴重威脅著兒童的生命健康。感染性疾病的病原體復雜多樣，包括病毒、細菌、真菌、非典型病原體、寄生蟲等。近年來，新型冠狀病毒、甲型流行性感冒病毒、禽流感病毒等新發(fā)，以及再發(fā)的呼吸道感染病原體不斷出現(xiàn)，對患兒家庭和社會造成了嚴重的疾病負擔[1］。呼吸道感染、血流感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等是兒童常見的感染性疾病，盡早明確感染病原體，有助于合理使用抗微生物藥物，從而改善疾病的轉(zhuǎn)歸并降低死亡率，做到對傳染病的早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早報告和早治療。

1 病原體培養(yǎng)

以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為基礎(chǔ)的病原菌鑒定方法一直是感染性疾病診斷的“金標準”，被廣泛應用于大多數(shù)細菌和真菌的病原體檢測。培養(yǎng)法是病原體在體外特定的環(huán)境下繁殖、生長后經(jīng)鑒定最終確定種類的方法，獲得的病原體可以進行藥物敏感試驗，為抗感染治療提供精準依據(jù)。培養(yǎng)法的主要優(yōu)點是特異度高、成本低，但要求操作人員具備較高的專業(yè)技術(shù)水平，且耗時較長，一般需要36～48 h，往往會導致病原學診斷延遲[1］，感染性疾病患兒的起病急、進展快，對病原學診斷的時效性要求高。近年來，臨床微生物鑒定中采用的飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF質(zhì)譜）法擴大了細菌和真菌的鑒定種類范圍，縮短了鑒定時間，使報告周期縮短至18～24 h，時間延遲情況得到了一定程度的改善。需要指出的是，培養(yǎng)結(jié)果受抗菌藥物的使用、病原體載量、培養(yǎng)基的選擇等因素影響[2］，陽性率較低，尤其是兒童常見的苛氧菌因標本采樣不易，其培養(yǎng)陽性率會更低[3］。臨床微生物技術(shù)人員應特別關(guān)注并持續(xù)改善這些影響因素，以提高病原體培養(yǎng)的陽性率。而病毒、支原體和衣原體等非典型病原體的培養(yǎng)難度高，限制了該方法在醫(yī)療機構(gòu)的常規(guī)開展。

2 病原體抗原或抗體檢測技術(shù)

病原體的抗原或抗體檢測是難培養(yǎng)病原體（病毒、支原體等）檢測的重要方法，該方法利用抗原-抗體反應，使用熒光素、酶、發(fā)光底物、膠體金顆粒等對已知抗原、抗體或配體（如金黃色葡萄球菌A蛋白、生物素）進行標記，對樣本中相應的病原體抗原或抗體進行檢測的技術(shù)。臨床廣泛應用的抗原或抗體檢測技術(shù)包括直接或間接免疫熒光法、ELISA、化學發(fā)光和免疫膠體金層析法。免疫熒光法通常配合熒光顯微鏡用于病原體抗原的原位檢測，后三種則主要用于檢測體液或裂解后的組織中所存在的病原體抗原或抗體。

抗原檢測的優(yōu)點是用時短、成本低、操作簡便、特異度較高，常用于門、急診快速篩查，但其缺點是靈敏度不高，易受標本采集質(zhì)量和標本中病原體載量等因素影響[4］。若抗原檢測結(jié)果為陰性，但臨床不能排除感染的情況下，建議采用病原體核酸檢測方法予以確認。

抗體檢測也是診斷感染性疾病的有效補充手段。感染發(fā)生5～7 d即可檢出病原體特異性免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）M抗體，10～14 d可檢出低親和力的IgG抗體，并隨著抗體親和力成熟，逐漸產(chǎn)生高滴度、高親和力的IgG抗體?？贵w檢測受樣本采集的影響小，且抗體水平和抗體亞型、親和力的不同可反映機體感染的狀態(tài)，常用于監(jiān)測疾病進展和療效。Ig M和低親和力的IgG抗體通常作為現(xiàn)癥感染的指標，而高親和力IgG通常作為既往感染的指標。Ig A型抗體的出現(xiàn)常常與膜免疫應答有關(guān)。急性期和恢復期血清抗體滴度增高4倍及以上是病原體感染回顧性診斷的重要依據(jù)[5］。然而，抗體產(chǎn)生“窗口期”的存在可導致該方法在感染早期的假陰性，尤其是患兒的免疫系統(tǒng)尚不成熟，可能導致產(chǎn)生抗體能力相對較低，帶來假陰性或者抗體滴度偏低等問題，抗體檢測結(jié)果需要結(jié)合疾病進程和患兒自身情況綜合分析。

3 核酸擴增技術(shù)

核酸擴增技術(shù)通過擴增核酸序列并檢測病原體特異性目的基因，從而判斷是否存在特定病原體或病原體特定耐藥基因。實時熒光PCR技術(shù)克服了早期PCR技術(shù)的實驗室污染問題，使得核酸檢測在病原診斷中得到推廣應用。相較于傳統(tǒng)的病原體培養(yǎng)法和免疫學技術(shù)（抗原、抗體檢測），該技術(shù)靈敏度高、特異度高、用時短，可大大縮短診斷的“窗口期”，并且可以對病原體進行定量檢測、耐藥基因檢測，以及基因分型。

多重PCR通過多對特異性引物和多色熒光標記，可在一次PCR反應中擴增多個靶標，從而實現(xiàn)同時檢測多種病原體。該技術(shù)有利于兒童混合感染的病原學診斷，同時也為病原體的鑒別診斷及醫(yī)院內(nèi)感染的防控提供了支持[6］。多重PCR操作簡單快速，特異度和靈敏度均較高，尤其適合一類疾病疑似病原體的成組檢測。但是一個多重PCR體系檢測的病原體很難超過30種，因此多重PCR難以滿足菌群分析等高通量測序的需要。

目前，核酸即時檢測（point-of-care testing，POCT）的臨床應用是分子診斷領(lǐng)域的研發(fā)熱點[7］，這些檢測系統(tǒng)通常使用微流控、多重PCR、恒溫擴增等技術(shù)，集樣品制備、擴增、檢測和分析于一體，整個檢測過程在封閉的容器或管路中自動進行，避免了產(chǎn)物污染，無需特殊場地，操作簡便，可在門急診一線快速、便捷地檢測多種病原體靶標和抗菌藥物耐藥基因。2020年的新型冠狀病毒感染疫情帶來的核酸快速檢測需求推動了病原體核酸POCT的迅速發(fā)展。

值得注意的是，病原體核酸擴增結(jié)果為陽性只能說明在標本中存在該病原體的核酸片段，并不代表其中必定含有活的病原體，也不代表感染必然是由該病原體所致，需要考慮該病原體的載量，以及臨床癥狀和體征作出綜合判斷。

4 宏基因組二代測序技術(shù)（metagenomicsnext generation sequencing，mNGS）

m NGS是新發(fā)、突發(fā)傳染病和臨床未知病原體鑒定的重要二代測序技術(shù)方法。m NGS的原理是，對感染部位樣本中提取的所有非人核酸進行高通量測序，通過測序數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫序列的比對分析，推測樣本中包含的病毒、細菌、真菌和寄生蟲等的病原微生物種類。

m NGS不依賴培養(yǎng)法或特異性的核酸擴增，無偏倚性，適用于各種臨床樣本，理論上可在同一次測序中鑒定所有的病原體（病毒、細菌、真菌和寄生蟲），且可同時提供病原的耐藥基因和菌群構(gòu)成信息。在復雜生物樣品如呼吸道感染或侵襲性感染的病原體研究中具有重要優(yōu)勢[8］。

有急危重癥表現(xiàn)，不除外感染；或高度懷疑存在血流感染、呼吸道感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染；或病原體未明的局部感染可能存在不可逆損傷的重癥患兒，若經(jīng)驗治療3 d效果不佳且常規(guī)微生物學檢查結(jié)果為陰性；或疑似存在混合感染，常規(guī)微生物檢查結(jié)果無法解釋臨床表現(xiàn)全貌的患兒可考慮m NGS檢測。另外，疑似新發(fā)病原體，臨床上提示可能有一定的傳染性，感染性疾病的聚集性發(fā)病或疑似院內(nèi)感染暴發(fā)，在常規(guī)檢測無法及時明確病原體時也可以采用m NGS檢測[9］。研究[10］結(jié)果表明，在傳統(tǒng)培養(yǎng)法和PCR檢測結(jié)果為陰性的患兒中，采用mNGS對病原菌的檢出率可達58%。

m NGS結(jié)果的本質(zhì)與PCR相似，可提示樣本中檢出或未檢出某微生物的核酸片段，但無法明確該物種與感染的關(guān)系。除了載量小或核酸抽提困難的病原體（如結(jié)核分枝桿菌）外，m NGS檢測的陰性預測值較高，陰性結(jié)果對于排除感染的價值較大[11］。

m NGS的實驗操作較復雜，對環(huán)境微生物的污染、樣本DNA起始量、測序深度和分析能力的要求高，結(jié)果易受人源宿主和環(huán)境物種遺傳物質(zhì)的噪聲信號干擾導致假陽性，無法完全區(qū)分檢測到的核酸來源微生物是否為感染源，尤其是在出現(xiàn)所檢出病原微生物的讀長（reads數(shù)）較低、與臨床表現(xiàn)不符、檢測到少見或罕見病原微生物的情況下[12］。數(shù)據(jù)分析和結(jié)果報告需綜合患兒臨床表現(xiàn)、抗菌藥物使用情況，以及實驗室檢查結(jié)果等才能判斷其臨床意義。

5 三代測序

在二代測序技術(shù)發(fā)展的同時，三代測序技術(shù)一經(jīng)提出便引起人們關(guān)注，但因其單堿基準確度較低且成本高昂，在人類等基因組較大的生物中尚未得到廣泛應用。三代測序主要有Pacbio和Nanopore兩種。受技術(shù)原理限制，二代測序讀段的常見讀長在100～300 bp左右。而三代測序單個讀段的讀長則大大延長，可達數(shù)十至數(shù)百kb，甚至數(shù)Mb，非常適合對基因組重復區(qū)或結(jié)構(gòu)變異進行測序，因而常被用于基因組從頭組裝。對于原核生物而言，因其基因組較小，用三代測序進行高深度測序，可更準確地獲得全基因組序列而無需復雜的拼接過程[13］。近年來，Nanopore測序儀的單堿基準確度有了較大提高，因而更受臨床關(guān)注。Nanopore的建庫和測序方法簡單且耗時較短，可在4～6 h內(nèi)完成病原體和耐藥基因檢測[14］。未來，隨著測序成本的降低，三代測序有望在臨床檢測上發(fā)揮更重要的作用。

6 結(jié) 語

兒童是感染性疾病的高危人群，早期、快速的精準診斷是進行及時的對癥治療、降低重癥發(fā)生率的重要前提。隨著技術(shù)的發(fā)展，實驗室用于感染性疾病診斷的技術(shù)不斷增多，從傳統(tǒng)的病原體培養(yǎng)、抗原或抗體檢測到核酸擴增技術(shù)，以及m NGS，臨床醫(yī)師和微生物技術(shù)人員應充分了解每一種技術(shù)的優(yōu)勢和不足、合適的應用場景和結(jié)果的解釋，以合理有效地運用傳統(tǒng)技術(shù)和分子診斷技術(shù)，為感染性疾病的精準診治和控制其傳播發(fā)揮積極作用。