川崎病生物標志物組學研究與臨床轉化

黃敏

川崎病是一種好發(fā)于5歲以下兒童的急性發(fā)熱性疾病，其主要病理特征為中小動脈血管炎，侵犯冠狀動脈（簡稱冠脈）可引起冠脈擴張和動脈瘤，遠期可發(fā)生狹窄性病變、AMI乃至猝死，已成為發(fā)達國家兒童獲得性心臟病的主要病因之一。目前，川崎病的診斷仍依賴臨床特征的組合，受評估者主觀判斷影響，早期明確診斷困難，易遺漏癥狀、體征不典型的不完全性川崎病，部分確診患兒對靜脈注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）治療反應不敏感，診治的延誤進一步導致冠脈病變發(fā)生風險升高，損害患兒健康，給患兒家庭帶來經(jīng)濟負擔[1］。因此，尋找生物標志物作為診斷“金標準”是臨床上川崎病診治亟待解決的問題，探索特異性治療靶標是實現(xiàn)川崎病精準醫(yī)療的必然方向。

近年來，研究者們借助高通量測序和質譜技術，對川崎病患者的血漿、尿液、外泌體、組織細胞，以及相關動物模型中的物質進行測定和組學分析，積累了大量生物信息數(shù)據(jù)。目前，主流觀點認為川崎病是遺傳易感個體受病原刺激后免疫系統(tǒng)異常激活觸發(fā)的炎癥風暴，其中蘊含著復雜的多信號交互機制，尤其適合開展組學研究，系統(tǒng)性分子特異性變化的過程正是遺傳和環(huán)境交互作用的結果。組學為全面了解川崎病發(fā)病機制、發(fā)掘生物標志物提供了豐富的數(shù)據(jù)資源，與此同時，數(shù)據(jù)的爆發(fā)增長也使研究者面臨重大挑戰(zhàn)，即如何從海量的數(shù)據(jù)中獲取對科學探索和轉化應用有價值的關鍵信息；如何使實驗設計更趨合理，選用最適宜的前沿技術以充分利用珍貴的臨床樣本，節(jié)約成本；如何將計算機技術與生物信息深度融合以實現(xiàn)更深層次的數(shù)據(jù)挖掘，這些都是科學技術發(fā)展帶來的難點和痛點。

1 基因組學

基因組學研究提供了川崎病遺傳易感性、IVIG治療敏感性、冠狀動脈損傷（coronary arterylesion，CAL）發(fā)生風險和疾病嚴重程度的相關信息。全基因組關聯(lián)分析（genome wide association study，GWAS）對大規(guī)模群體DNA樣本進行高密度遺傳標記分型，包括單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）和拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）等，揭示基因與表型的關聯(lián)。目前研究較多的川崎病易感基因有1，4，5-三磷酸肌醇3激酶C（inositol-1，4，5-trisphosphate3-kinase C，ITPKC）、FCGR2A、半胱天冬蛋白酶3（cysteiny laspartate specific proteinase 3，CASP3）、B淋巴酪氨酸激酶（B lymphoid tyrosine kinase，BLK）、CD40和HLA等。ITPKC作為鈣離子（Ca2+）／活化的T細胞核因子（nuclear factor of activated T cell，NFAT）通路的第二信使，可抑制T細胞活化，CASP3編碼caspase-3調控未成熟細胞凋亡，F(xiàn)CGR2A在樹突狀細胞、單核細胞等多種免疫細胞表面表達低親和力IgG抗體Fc段受體，BLK則參與B細胞受體信號轉導，且對小鼠體內(nèi)γδT細胞發(fā)育起關鍵作用，CD40表達于B細胞、單核或巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞和脂肪細胞表面，這些基因多態(tài)性引起免疫細胞異常激活，細胞因子釋放，ITPKC和CASP3遺傳變異的協(xié)同作用可能導致IVIG無應答或高CAL風險的發(fā)生[2］。盡管已經(jīng)鑒定出大量川崎病相關的遺傳變異位點，但只有少數(shù)研究得出一致的關聯(lián)性，多數(shù)易感基因與川崎病的關聯(lián)在不同地區(qū)、種族或性別的研究中顯示出不同的結果，不同人群間風險等位基因頻率亦存在差異。目前，川崎病易感基因研究可解釋一部分川崎病流行病學特征和發(fā)病機制，但其在臨床場景中用于早期診斷的證據(jù)尚不充分，其臨床轉化更多指向高危人群的篩選，指導特異性藥物的應用。FCGR2A基因功能研究為明確IVIG治療川崎病的效應原理提供了生物學基礎，Ca2+／NFAT通路抑制劑他克莫司和環(huán)孢素A或可作為IVIG無應答者的補救治療。

DNA是生命體遺傳信息的承載者，隨著遺傳學研究的進展，研究者們發(fā)現(xiàn)表型不僅由基因完全決定，在不改變DNA序列的情況下對基因進行的各種修飾同樣影響著個體的分化發(fā)育和疾病進程，聚焦基因表觀修飾的研究被稱為表觀基因組學。DNA甲基化是最早被發(fā)現(xiàn)、最為典型，也是川崎病中研究最為廣泛的表觀修飾方式，甲基與基因組胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（Cp G）島共價結合，調節(jié)基因表達，低甲基化水平可引發(fā)基因活化增強。川崎病相關基因大多處于低甲基化狀態(tài)，集中呈現(xiàn)在炎癥反應、先天免疫反應和凝血反應，以及血小板活化、破骨細胞分化和趨化因子信號途徑等通路，與川崎病全身高炎癥狀態(tài)和冠脈病變形成相關。ITPKC啟動子區(qū)域甲基化與參與NLRP3炎性小體激活[3］，F(xiàn)CGR2A啟動子甲基化與川崎病易感性和IVIG治療結果之間存在顯著關聯(lián)，其啟動子Cp G位點甲基化水平可作為IVIG治療方案優(yōu)化的重要指標[4］。通過比較川崎病患兒接受IVIG治療前后的DNA甲基化改變，已證明IVIG可能通過減少Cp G標志物以抑制免疫炎癥的發(fā)生[5］。鑒于DNA本身性質的穩(wěn)定性和可擴增性，隨著表觀遺傳學研究的深入和技術的進一步發(fā)展，可以預見川崎病基因啟動子異常甲基化的檢測在早期診斷和IVIG治療的敏感性預測等領域具有廣闊的應用前景。

2 轉錄組學

轉錄組學是研究細胞表型和功能的一個重要手段，轉錄組測序的研究對象是特定細胞在特定條件下轉錄出來的所有RNA的總和，主要包括傳統(tǒng)轉錄組學所指的信使RNA（messenger RNA，mRNA）和近年研究火熱的非編碼RNA。川崎病患兒冠脈組織轉錄譜表現(xiàn)出抗病毒反應特征，包括細胞毒性T細胞的活化和I型IFN誘導的信號通路上調[6］，這一發(fā)現(xiàn)支持川崎病的病毒病原學說，并為潛在的致死性冠脈病變高?；純旱拿庖哒{節(jié)治療提供了方向。IVIG無應答與冠脈病變發(fā)生高度相關，目前轉錄組學研究尚未分離到有效預測IVIG反應性的生物標志物，更具分辨力的優(yōu)化算法或可破解這一困局。對于樣本量較多的復雜轉錄組數(shù)據(jù)，加權基因共表達網(wǎng)絡分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）可鑒定表達模式相似的基因集合，并鑒別模塊中權重最高的核心基因，研究者利用這一技術發(fā)現(xiàn)，髓系細胞激活與川崎病患兒的IVIG無應答相關，轉錄因子IL1R2、GK、HK3、C5orf32、CXCL16、NAMPT和EMILIN2在共表達網(wǎng)絡中發(fā)揮關鍵作用[7］。Rambabu等[8］通過定義基因表達的“開”“關”開發(fā)了一種名為布爾分析的方法，發(fā)現(xiàn)外周血單核細胞代謝在IVIG無應答中起到了至關重要的作用。若能對這些代謝參數(shù)開展快速測定，或可幫助臨床醫(yī)師早期識別IVIG無應答者，啟動替代治療，降低冠脈病變發(fā)生風險和治療成本。

微RNA（microRNA，miRNA）是川崎病領域研究最廣泛的非編碼RNA，作為一種長約20 nt的單鏈RNA，可與靶向m RNA直接結合，參與轉錄后水平的基因調控。大量研究[9-11］數(shù)據(jù)顯示，川崎病患兒體內(nèi)失調控的miRNA集中參與了TGF-β信號通路、內(nèi)皮-間充質轉化（Endo MT）、凋亡相關信號、免疫相關信號轉導等過程，提示miRNA調控在川崎病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。miRNA在體液中普遍易得，檢測方法成熟，具有成為生物標志物的巨大潛力，但由于尚未鑒定出足以用于川崎病診斷的單一miRNA，目前的開發(fā)多為基于數(shù)個miRNA結合的診斷面板或合并臨床指標構建診斷模型[12-13］，而現(xiàn)有的研究結論多來自單中心、同種族人群，樣本數(shù)量和來源限制了診斷效能的提升和模型的推廣應用。外源性給予miRNA類似物或抑制物為實現(xiàn)川崎病靶向治療提供了新的思路，但是以miR-223為例，綜合多項研究[14-19］結論顯示，其經(jīng)由不同細胞組織來源和效應通路在川崎病進程中發(fā)揮了迥異的作用，未來應進一步明確miRNA在川崎病患兒體內(nèi)的作用網(wǎng)絡和真實效應，為基于miRNA的靶向藥物開發(fā)提供更可靠的有效性和安全性證據(jù)。

傳統(tǒng)的轉錄組測序是在多細胞基礎上進行的，其得到的是樣本組織或細胞群中所有轉錄產(chǎn)物的平均水平，丟失了細胞異質性的信息，常忽略豐度較低亞群的表達特征。單細胞測序技術克服了這一弊端，從體液或混雜組織中捕獲單個細胞，高分辨率地識別生物組織中以細胞為單位的轉錄組信息，為全面揭示各亞群特異性變化和基因的時空分布提供了有力工具。本課題組首次應用單細胞轉錄組測序（single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq）技術繪制了川崎病患兒外周血單個核細胞免疫圖譜，結果顯示，相較于健康對照組，單核細胞是IVIG治療前主要的差異表達基因來源，治療后可見B細胞豐度下降伴漿細胞比例升高，B細胞受體（B cell receptor，BCR）寡克隆擴增，以及Ig M／Ig D向IgG／Ig A的同型轉化，提示B細胞分化發(fā)育異常在川崎病的發(fā)生、發(fā)展和IVIG應答中扮演重要角色，此外T細胞受體（TCR）和BCR測序結果顛覆了以往對川崎病病原學的認知，提示其免疫激活更可能由特定抗原而非超抗原引發(fā)[20］，但后續(xù)Fan等[21］開展的scRNA-seq結果顯示川崎病患兒B細胞減少而自然殺傷細胞增多，這與本課題組研究的結論不一致，可能是受到樣本量的限制。目前，sc RNA-seq技術還存在諸多問題與爭議，高昂的成本使其大規(guī)模應用難以實現(xiàn)，完全基于機器學習算法的聚類和分析得到的生物學意義可靠性有待商榷，表達譜層面的解釋距離臨床價值還相去甚遠。目前公開發(fā)表的川崎病scRNA-seq數(shù)據(jù)樣本來源單一，以外周血單個核細胞為主，對照組僅有健康和感染性發(fā)熱，IVIG治療無應答川崎病患兒的單細胞基因表達情況尚為空白，未來應當收集更多病程階段和臨床亞型的病例樣本，設置包括各類血管炎、自身免疫性疾病等在內(nèi)的豐富對照，優(yōu)化數(shù)據(jù)分析方法和流程，對已有數(shù)據(jù)開展更具深度和臨床意義的挖掘，驅動科研成果向技術應用轉化，指導川崎病精細分型和精準診療。

3 蛋白質組學

蛋白質組學的研究對象是特定時間、空間下生物體、組織或細胞全部蛋白質的集合，旨在探索其組成、結構、功能和相互作用。與基因組和轉錄組相比，蛋白質作為生命活動的執(zhí)行分子，能更直接反映機體生物學功能和動態(tài)變化。蛋白質組學技術包括分離、鑒定和定量，以及后續(xù)的生物信息分析處理，目前最主流的是基于質譜技術的定量蛋白質組學研究，常用定量方法包括蛋白質非標記定量技術（label-free）、iTRAQ／TMT、DIA／SWATH等。近年來，蛋白質組學已廣泛應用于常見的心血管系統(tǒng)疾病如高血壓、動脈粥樣硬化、心力衰竭、擴張型心肌病等。

血漿蛋白標志物一直是臨床場景下分子診斷的主力軍，以氨基末端腦利鈉肽前體（NTproBNP）為代表的經(jīng)典指標可提示川崎病活動但診斷特異性明顯不足，因此迫切需要開發(fā)更具代表性的蛋白質分子。借助日新月異的蛋白質組學技術，研究者們現(xiàn)已鑒別出與川崎病相關的多種蛋白質，這些蛋白質在炎癥、免疫應答、血管生成和內(nèi)皮細胞損傷等過程中發(fā)揮作用。S100A蛋白家族與炎癥和免疫調節(jié)相關，多個S100A蛋白家族成員的水平在川崎病急性期升高，其中S100A12受到較多關注，S100A12與sRAGE的比值可能有助于評估IVIG無應答的風險[22］；S100A4體外引起內(nèi)皮細胞松散，更易受中性粒細胞侵襲，有希望成為川崎病冠脈病變標志物及潛在治療靶點[23］。其他篩選出的川崎病相關血漿蛋白還包括甲狀腺素轉運蛋白（TTR）、脂多糖結合蛋白（LBP）和富含亮氨酸糖蛋白（LRG1）等[24-25］，盡管這些分子的表達豐度達到了微陣列ELISA檢測的要求，能夠實現(xiàn)快速準確定量，具備臨床應用的潛質，但其對川崎病的鑒別診斷效能還有待進一步驗證。此外，在以尋找臨床生物標志物為導向的蛋白質組學研究中，尿液樣本具有獨特優(yōu)勢，因其取樣過程完全無創(chuàng)，可重復性高，且尿液蛋白質成分簡單，易于檢測分析，是標志物分子的良好來源。尿液蛋白質組學技術已鑒定出免疫調節(jié)分子meprin A、內(nèi)皮和心肌損傷相關蛋白細絲蛋白c在川崎病患兒尿液中高表達，無論是從疑似患者中識別川崎病，還是對不典型患者明確診斷層面，上述分子均展現(xiàn)出良好的效能，優(yōu)于目前使用的實驗室指標ESR和CRP[26］。

外泌體是一種直徑為30～100 nm的細胞外囊泡，內(nèi)容物包含豐富的RNA、蛋白質和脂質成分，參與細胞間通訊。脂質雙分子層的保護作用使得外泌體能在體液內(nèi)穩(wěn)定存在，維持內(nèi)容物的理化性質，頗具臨床診斷價值。與細菌感染性患兒相比，川崎病患兒血清外泌體差異蛋白在補體和凝血級聯(lián)反應中顯著富集，候選蛋白纖維蛋白原γ（FGG）和補體成分1q子成分c（C1QC）有望成為川崎病的補充診斷標志物[27］。比較川崎病患兒接受IVIG治療前后血清外泌體的蛋白質分布發(fā)現(xiàn)，補體C3、載脂蛋白A-Ⅳ和胰島素樣生長因子結合蛋白復合酸不穩(wěn)定亞基存在差異，或可用于IVIG療效監(jiān)測[28］。伴冠脈病變的川崎病患兒血清外泌體中TN、LRG1、RBP4和APOA4差異表達，這些蛋白質參與了免疫、炎癥、發(fā)育、凋亡和黏附等生物學過程，但尚未證明其與冠脈病變有特異性相關，現(xiàn)有研究較小的樣本量可能掩蓋了兩者關聯(lián)的真實性[29］。

4 代謝組學

核酸和蛋白質是生物學過程發(fā)生的基礎，但基因組、轉錄組和蛋白質組的分析結論對功能狀態(tài)僅有提示作用，體內(nèi)代謝物的變化才是生物事件的真實反映。代謝組學是研究生物體被擾動后代謝產(chǎn)物種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的科學。目前，川崎病代謝組學研究仍處于起步階段，主要圍繞脂代謝開展。日本的一項前瞻性研究[30］全面分析了一組川崎病患兒的血清脂質成分并在獨立隊列中開展驗證，發(fā)現(xiàn)急性期氧化磷脂酰膽堿（Ox PC）表達水平升高，氧化磷脂炎癥信號的激活參與了冠狀動脈炎的發(fā)生，但這一研究結論僅來自日本人群，未來應擴大樣本的種族和地區(qū)來源，以探索Ox PC及其相關產(chǎn)物在廣泛人群中用于冠狀動脈瘤預測的可能性。在IVIG反應性方面，一項基于液相色譜液質譜法（LC／MS）的脂質組學研究[31］數(shù)據(jù)顯示，IVIG敏感組和中等反應組脂質譜表達模式相似，但IVIG耐藥組脂質成分在治療前后有顯著差異，其中溶血磷脂酰膽堿（LPC）和溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）在治療前后的差異最大，可用于川崎病患兒IVIG反應性分層，兩者與Gunma評分結合顯著增高了對IVIG無應答的診斷效能，因此，測定血清LPC和LPE有助于在治療前實現(xiàn)對患兒IVIG反應性的準確評估。未來，應擴大川崎病代謝組學研究范圍，納入其他小分子代謝物如氨基酸、有機酸、核苷酸等，深入分析川崎病表型與各種代謝變化的關聯(lián)，發(fā)掘代謝標志物以指導川崎病診斷分型、CAL風險預測、療效與安全性評估等臨床應用。然而，目前的分析技術所能檢測并注釋的代謝物種類數(shù)量非常有限，生物機體本身就是一個動態(tài)的、多因素調控復雜體系，地理、氣候、藥物等外界因素，以及種族、遺傳背景、健康狀況等內(nèi)在環(huán)境都會引起代謝物的聯(lián)動變化，對代謝物的簡單檢測可能很難精確反映川崎病的病程狀態(tài)。

5 展 望

自1967年日本學者川崎富作首次報道川崎病，50余年來隨著技術的不斷進步和科學家的不懈探索，對川崎病的認識已經(jīng)貫穿整個基因表達過程，一方面，現(xiàn)在比以往任何時候都更加接近川崎病發(fā)病的真相；另一方面，臨床上川崎病診療仍有許多懸而未決的難題，早期診斷是減輕疾病負擔的首要任務，也是目前臨床實施最為困難的環(huán)節(jié)。2017版美國心臟協(xié)會（AHA）《川崎病的診斷、治療和長期管理：美國心臟協(xié)會給衛(wèi)生專業(yè)人員的科學聲明》[32］中明確要求診斷川崎病需滿足發(fā)熱≥5 d這一條件。而最新的日本《川崎病診斷指南（第6次修訂版）》[33］已刪除對特定熱程的要求，并將卡介苗瘢痕發(fā)紅納入早期臨床特征。我國2022年發(fā)布的《川崎病診斷和急性期治療專家共識》[34］采用了日本指南的部分更新，但對不完全川崎病的診斷仍要求滿足發(fā)熱≥5 d這一條件。因此，目前仍沒有一套能在不同種族和地區(qū)推廣的統(tǒng)一標準流程可幫助臨床醫(yī)師快速、準確診斷川崎病，尋找生物標志物或是解開這一困局的最佳答案。人類基因組計劃如一陣春風將組學研究吹拂到醫(yī)療科學的各個領域，川崎病特異性生物標志物開發(fā)迎來了前所未有的浪潮，大量不同分子水平的生物信息極速累積，運算能力不斷飛躍，DNA、RNA、蛋白質、代謝產(chǎn)物等各種新標志物層出不窮。但在熱潮之下，研究者們?nèi)孕枥潇o思考，過度膨脹的生物數(shù)據(jù)應用價值如何，套路化的分析流程是否使結論假象叢生；標志物從實驗室走向臨床實踐的過程中還面臨著鑒定方法不便捷、診斷效能不穩(wěn)定等問題；單一組學標志物在川崎病準確診斷方面尚無突破性進展，多組學信息整合分析或可彌補這一不足，但又存在價格高和用時長的劣勢，目前在臨床應用的性價比較低。對于已經(jīng)開發(fā)的生物標志物，未來應當擴大樣本量、納入多種族人群、增加對照類型、聯(lián)合多中心數(shù)據(jù)進一步驗證，加入微生物組、空間組等擴大數(shù)據(jù)類型，繼續(xù)推進單一標志物開發(fā)，優(yōu)化現(xiàn)有模型提高特異度和靈敏度以達到臨床應用要求，多路徑實現(xiàn)川崎病的早期精確診斷，預測治療反應性以盡早啟動替代治療，減少心血管事件發(fā)生風險，使患兒及其家庭真正受益。