健脾清化方對急性腎缺血再灌注SD大鼠氧化應激損傷的影響

陳文浩 何立群

摘要 目的：探討健脾清化方對急性腎缺血再灌注SD大鼠氧化應激損傷的影響。方法：將40只SD大鼠隨機分成正常組、急性腎缺血再灌注模型組、健脾清化方干預組和鹽酸羅格列酮干預組，每組10只。健脾清化方干預組給予健脾清化方灌胃（19.3 g/kg，20倍人體劑量），鹽酸羅格列酮組給予羅格列酮灌胃（1.3 mg/kg，20倍人體劑量），其他組給予生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥1周后，造模并取材。觀察各組SD大鼠血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平，觀察各組大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、羥自由基（OH）抑制能力的水平，ELISA檢測各組大鼠血清IL-1β、IL-10水平，免疫印跡法觀察各組大鼠腎組織TNF-α、NF-κB蛋白表達水平。結(jié)果：與正常組比較，模型組的Scr、BUN均顯著增加（P<0.05），抑制羥自由基能力、NOS、NO水平提升（P<0.05），SOD水平明顯下降（P<0.05）。與模型組比較，健脾清化方干預組及羅格列酮干預組Scr、BUN（P<0.05）水平均明顯降低，NOS（P<0.05）、NO顯著下降，抑制羥自由基能力與SOD水平顯著提升（P<0.05）。模型組、鹽酸羅格列酮組與健脾清化方組IL-1β、IL-10水平均較正常組明顯升高（P<0.05），與模型組比較，鹽酸羅格列酮組與健脾清化方組的IL-1β水平更低，IL-10的水平更高。鹽酸羅格列酮組的IL-1β水平比健脾清化方組更高，IL-10水平更低。與正常組比較，模型組、鹽酸羅格列酮組與健脾清化方組大鼠腎組織的NF-κB、TNF-α蛋白表達量均顯著提升。與模型組比較，鹽酸羅格列酮組與健脾清化方組NF-κB、TNF-α蛋白表達量均顯著下調(diào)。與鹽酸羅格列酮組比較，健脾清化方組的NF-κB、TNF-α蛋白表達量更低。結(jié)論：健脾清化方可明通過降低NO、NOS水平，增強SOD和抑制OH自由基能力，從而延緩急性腎缺血再灌注SD大鼠氧化應激損傷水平，抑制炎性反應，從而減少對腎臟的損傷。

關(guān)鍵詞 急性腎缺血再灌注損傷;氧化應激損傷;炎性反應;健脾清化方;大鼠;實驗

Abstract Objective：To investigate the effects of Jianpi Qinghua decoction on oxidative stress injury in SD rats with acute renal ischemia reperfusion.Methods：A total of 40 SD rats were randomly divided into a normal group（n=10），an acute renal ischemia-reperfusion model group（n=10），a Jianpi Qinghua decoction intervention group（n=10），a rosiglitazone hydrochloride intervention group（n=10）.The Jianpi Qinghua decoction intervention group was given Jianpi Qinghua recipe（19.3 mg·kg-1，20 times human dose），and the rosiglitazone hydrochloride intervention group was given rosiglitazone（1.3 mg·kg-1，20 times human dose）.The other groups were given normal saline once a day，and after one week of continuous administration.The rats was molded and the materials were taken.The levels of serum creatinine（Scr）and urea nitrogen（BUN）in SD rats were observed.The serum superoxide dismutase（SOD），nitric oxide（NO），nitric oxide synthase（NOS）were observed in each group.The levels of hydroxyl-free radical（OH）inhibition ability，serum IL-1β，IL-10 levels in each group were detected by ELISA.The expressions of TNF-α and NF-KB in renal tissues of each group were observed by Western blot.Results：Compared with the normal group，the Scr and BUN of the model group were significantly increased（P<0.05）.The ability of inhibiting hydroxyl radicals，the levels of NOS and NO were significantly increased（P<0.05），and the level of SOD was significantly decreased（P<0.05）.Compared with the model group，the Scr and BUN levels in the Jianpi Qinghua decoction group and the rosiglitazone treatment group were significantly decreased（P<0.05），NOS（P<0.05）and NO decreased significantly，and the level of ability to inhibit hydroxyl free radicals and SOD was significantly increased（P<0.05）.The levels of IL-1β and IL-10 in the model group，the rosiglitazone hydrochloride group and the Jianpi Qinghua decoction group were significantly increased than those in the normal group（P<0.05）.Compared with the model group，the level of IL-1β in the rosiglitazone hydrochloride group and the Jianpi Qinghua decoction group was lower and the level of IL-10 was higher.The level of IL-1β in the rosiglitazone hydrochloride group was higher than that in the Jianpi Qinghua decoction group while the IL-10 level was lower.Compared with the normal group，the expression of NF-KB and TNF-α protein in the renal tissue of the model group，rosiglitazone hydrochloride group and Jianpi Qinghua decoction group were significantly increased.Compared with the model group，the expression levels of NF-KB and TNF-α protein in the rosiglitazone hydrochloride group and Jianpi Qinghua decoction group were significantly down-regulated.Compared with the rosiglitazone hydrochloride group，the expression of NF-KB and TNF-α protein in Jianpi Qinghua decoction group was lower.Conclusion：Jianpi Qinghua decoction can reduce the levels of NO and NOS，enhance SOD and inhibit OH free radicals，thereby delaying the level of oxidative stress injury in SD rats with acute renal ischemia-reperfusion and inhibiting inflammatory reaction，thereby reducing the kidney damage.

Key Words Acute renal ischemia-reperfusion injury; Oxidative stress injury; Inflammatory reaction; Jianpi Qinghua decoction; Rats; Experiment

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.008

缺血再灌注損傷（Ischemic Reperfusion Injury，IRI）是指由于各種原因引起的缺血和血液灌注恢復引起的組織或器官的損傷。腎臟是臨床缺血再灌注損傷的常見器官之一。腎缺血再灌注損傷（Renal Ischemic Reperfusion Injury，RIRI）臨床上常見于急性腎損傷（Acute Kidney Injury，AKI）和腎移植術(shù)后，是影響AKI治療預后及腎移植術(shù)后移植物的早期功能恢復和長期存活的主要因素之一[1]。

氧化應激損傷（Oxidative Stress，OS）是RIRI的主要病理因素和機制，在IRI時引起大量自由基富集，誘發(fā)機體的OS、炎性反應和細胞凋亡，對腎臟功能造成影響[2]。羅格列酮作為PPARγ激動劑，其有效對抗OS及炎性反應的功效近年來逐漸得到認知和肯定[3]。而傳統(tǒng)中醫(yī)藥在OS及炎性反應方面仍缺乏系統(tǒng)的研究，中藥方劑健脾清化方在延緩慢性腎臟病纖維化的進程的同時，具有抗炎抗氧化的功效[4]。本實驗復制急性RIRI大鼠模型，探究健脾清化方對急性RIRI大鼠OS的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD大鼠，雄性體質(zhì)量（200±20）g。購自上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心[SYCK（滬）2013-0016]，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK（滬）2013-0016。本實驗研究實驗倫理委員會批準編號：SZY201710012。大鼠飼養(yǎng)于SPF動物實驗室，溫度（26±4）℃，濕度（55±5）%。動物飼養(yǎng)及實驗操作均在上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心設施內(nèi)進行。

1.1.2 藥物 鹽酸羅格列酮片（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H20080257）購自上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院西藥房，制備藥物濃度為0.133 mg/mL。健脾清化方購自上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院制劑科，藥物組成：黨參15 g、生黃芪15 g、草果仁6 g、蒼術(shù)10 g、黃連3 g、制大黃9 g，制備藥物濃度為1.933 g/mL。

1.1.3 試劑與儀器 超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物科技有限公司，貨號：A001-1）、羥自由基測試試劑盒（南京建成生物科技有限公司，貨號：A018）、總一氧化氮合成酶（NOS）測試盒（南京建成生物科技有限公司，貨號：A014-2）、一氧化氮（NO）測定試劑盒（南京建成生物科技有限公司，貨號：A012）、IL-1β ELISA試劑盒（上海威奧生物公司，貨號：ER0128）、IL-10 ELISA測定試劑盒（上海威奧生物公司，貨號：ER0135），TNF-α抗體（生工生物工程（上海）股份有限公司，D164310）、NF-κB抗體（Cell Signaling Technology，△59674）、無創(chuàng)動脈夾（上海威奧生物公司），多功能酶標儀（BioTek Synergy2）、eppendorf離心機（5417R）、全自動生化儀（Hitachi7080，Tokyo）、戊巴比妥鈉（上海醫(yī)藥集團股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，在SPF環(huán)境下適應性飼養(yǎng)一周后根據(jù)體質(zhì)量隨機分成正常組、模型組（急性腎缺血再灌注模型）、西藥組（鹽酸羅格列酮組）和中藥組（健脾清化方組）共4組，每組10只。四組均灌胃1周，禁食不禁水1 d后，模型組、西藥組與中藥組均以3%戊巴比妥鈉按40 mg/kg體質(zhì)量劑量麻醉，大鼠呈俯臥位，經(jīng)背部兩側(cè)肋弓下距脊柱約0.5 cm處剪開約長1.5 cm的縱行切口，鈍性分離并露出兩側(cè)腎臟，從兩側(cè)腎蒂分離腎動脈，用無創(chuàng)性動脈夾夾閉雙側(cè)腎動脈，30 min后松夾恢復灌注，觀察雙側(cè)腎臟顏色由淡色逐漸轉(zhuǎn)為鮮紅色，提示腎臟恢復血供。關(guān)腹并縫合切口，術(shù)后大鼠自由攝食和飲水。

1.2.2 給藥方法 給藥期間每組予以普通飼料及水飲食，各組灌胃劑量：西藥組予1.33 mg/kg體質(zhì)量劑量灌胃，中藥組予19.33 g/kg體質(zhì)量劑量灌胃。正常組和模型組每日予以同劑量生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃1周，每次灌胃藥物體積均為100 g體質(zhì)量予1 mL藥物（生理鹽水）計算。

1.2.3 檢測指標與方法 各組大鼠均于造模24 h后以3%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血后，靜置離心，離心機3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，分離血清，置于冰箱中儲存，以測SOD、NO、NOS、抑制OH自由基能力及血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、IL-1β、IL-10。取腎組織于液氮中轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，以提取組織蛋白用于Westernblot檢測NF-κB、TNF-α蛋白表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠Scr、BUN比較 4組SD大鼠中，模型組的Scr與BUN與正常組比較均有明顯升高，說明急性腎缺血再灌注對SD大鼠腎臟造成損傷，提示造模成功（P<0.05）。鹽酸羅格列酮組與健脾清化方組與模型組比較，Scr、BUN水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而健脾清化方組BUN（P<0.05）與Scr水平均較鹽酸羅格列酮組更低，提示鹽酸羅格列酮與健脾清化方均對腎臟功能具有保護作用，而健脾清化方保護腎臟功能較鹽酸羅格列酮更強。見表1。

2.2 4組大鼠血清羥自由基抑制能力、SOD、NOS、NO的變化 模型組抑制羥自由基能力、NOS、NO均較正常組水平提高（P<0.05），模型組SOD水平較正常組有明顯下降（P<0.05），說明急性腎缺血再灌注造模成功，均存在自由基的富集現(xiàn)象及OS。健脾清化方組和鹽酸羅格列酮組與模型組比較，抑制羥自由基能力均有顯著提升（P<0.05），健脾清化方抑制羥自由基能力較鹽酸羅格列酮更強。與模型組比較，鹽酸羅格列酮組與健脾清化方組SOD含量更高（P<0.05），NOS的水平更低（P<0.05），生成的NO的水平也更低。健脾清化方組大鼠較鹽酸羅格列酮組的血清SOD含量顯著上升，而NOS、NO的水平明顯下降。提示鹽酸羅格列酮與健脾清化方均有對抗OS，清除活性氧的功效，健脾清化方對OS的對抗效果較鹽酸羅格列酮更強。見表2、表3。

2.3 4組大鼠血清IL-1β、IL-10的比較 模型組、鹽酸羅格列酮組與健脾清化方組IL-1β、IL-10水平均較正常組明顯升高（P<0.05），與模型組比較，鹽酸羅格列酮組與健脾清化方組的IL-1β水平更低，IL-10的水平更高，鹽酸羅格列酮組的IL-1β水平比健脾清化方組更高，IL-10水平更低。提示SD大鼠腎IRI時出現(xiàn)了炎性因子釋放，存在炎性反應，鹽酸羅格列酮與健脾清化方均能減少炎性因子IL-1β的釋放，上調(diào)IL-10以對抗炎性反應。健脾清化方抑制炎性反應能力可能較鹽酸羅格列酮更強。見表4。

2.4 4組大鼠腎組織的NF-κB、TNF-α表達比較 Western Blot結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組、鹽酸羅格列酮組與健脾清化方組大鼠腎組織的NF-κB、TNF-α蛋白表達量均顯著提升，與模型組比較，鹽酸羅格列酮組與健脾清化方組NF-κB、TNF-α蛋白表達量均顯著下調(diào)，與鹽酸羅格列酮組比較，健脾清化方組的NF-κB、TNF-α蛋白表達量更低。見圖1，表5。

3 討論

臨床上常見的急性RIRI除了發(fā)生于各種因素引起的AKI或腎移植之外，其主要的OS也常見于糖尿病腎病的發(fā)病機制中，貫穿糖尿病腎病的整個病程[5]。而近些年的一些研究發(fā)現(xiàn)OS是慢性腎衰，甚至是血液透析和腹膜透析階段疾病發(fā)生發(fā)展的重要一環(huán)[6]。更是動靜脈瘺維持血液透析患者瘺管生存條件的主要影響因素之一[7]。然而臨床上對于這些急慢性腎臟疾病的OS往往得不到足夠的了解和應有的重視，且尚無行之有效的治療手段和臨床用藥。

OS的病理機制主要是是初期自由基的過度富集引起的血管內(nèi)皮損傷，同時自由基的富集進一步引起炎性反應因子的釋放并引起細胞凋亡[8]。而此前的研究也驗證了健脾清化方具有抑制免疫炎性反應的發(fā)生，減少細胞凋亡，延緩腎臟病理發(fā)展進程的作用和機制[9]。

從中醫(yī)學來看，急性RIRI歸屬于“關(guān)格”“癃閉”“水腫”等范疇，主要發(fā)病病機正虛邪實，除了腎氣本虛，濕熱淤毒以外，主要以脾虛濕濁不化，淤濁積聚為主，近年來因瘀血及血虛尚不能完全明確闡釋類IRI過程中的病機變化，有學者提出“血濁”的概念[10]。其產(chǎn)生與脾胃功能失司有關(guān)，是一種由于病邪外襲或臟腑內(nèi)傷所致血液狀態(tài)異常，或血液運行障礙的現(xiàn)象，包括了血脂、血糖及血液中各種代謝毒素異常增高的表現(xiàn)。這與急性RIRI時的OS高度吻合[11]。

健脾清化方以李東垣脾胃論為法，補脾氣為基，清濕熱、瀉陰火為主，以補益中焦脾氣，強健運化功能，能固攝精微的同時，運化水液氣血，清化濕熱淤毒，能有效改善血濁狀態(tài)[12]，方中的黨參、黃芪除了固護元氣之外，尚具有抗氧化應激和減輕炎性反應及細胞凋亡現(xiàn)象的功效[13]。又以草果仁、蒼術(shù)燥濕健脾，運化濕濁，制大黃祛除停聚瘀血，更佐以黃連清化濕熱，其對抗氧化應激損傷的正向作用均在前期的一些研究中見過相關(guān)闡述[14]。

綜上所述，健脾清化方通過增加對活性氧清除，降低炎性因子IL-1β水平，提高IL-10水平以抑制炎性反應，并下調(diào)炎性因子NF-κB、TNF-α的蛋白表達，從而保護急性RIRI時腎臟功能。本研究從OS角度探討健脾清化方對急性RIRI的影響，為進一步研究健脾清化方對抗急性RIRI的機制及急性RIRI藥物的制備及研究開發(fā)提供了基礎。

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（2019-04-10收稿 責任編輯：王明）