鹽濃度對(duì)歐洲鰻肌原纖維蛋白理化性質(zhì)和凝膠形成性能的影響

楊 玉，李婕妤，石林凡，任中陽(yáng)，翁武銀,

（1.福清市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，福建福清 350300；2.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建廈門(mén) 361021）

鰻魚(yú)是一種江河性洄游魚(yú)類，全世界常見(jiàn)的鰻魚(yú)種類有19 種，其中歐洲鰻、日本鰻和美洲鰻屬于重要的養(yǎng)殖品種[1]。我國(guó)是鰻魚(yú)養(yǎng)殖、生產(chǎn)和出口大國(guó)，2021 年全國(guó)鰻鱺養(yǎng)殖總產(chǎn)量已經(jīng)超過(guò)25 萬(wàn)噸[2]。目前，鰻魚(yú)大多被加工成白燒鰻和蒲燒鰻，產(chǎn)品單一。熱處理是烤鰻加工的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，加熱會(huì)導(dǎo)致蛋白分子變性和聚集，進(jìn)而影響蛋白凝膠特性。作為魚(yú)肉主要蛋白的肌原纖維蛋白在加工過(guò)程中的變化是影響魚(yú)肉品質(zhì)的主要因素[3]。有研究報(bào)道，肌原纖維蛋白的性質(zhì)會(huì)影響加工魚(yú)肉的質(zhì)地及感官特性[4]。近年來(lái)，熱處理對(duì)鱸魚(yú)肌原纖維蛋白和泥鰍肌原纖維蛋白的性質(zhì)影響受到關(guān)注[5-6]，然而有關(guān)熱處理對(duì)鰻魚(yú)肌原纖維蛋白性質(zhì)的影響卻未見(jiàn)報(bào)道。

添加氯化鈉（NaCl）可以促進(jìn)肌球蛋白等鹽溶性蛋白溶解，在熱誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)生聚集[7]。溶解的肌原纖維蛋白經(jīng)過(guò)加熱后，包埋在蛋白內(nèi)部的疏水基團(tuán)會(huì)逐漸暴露，促進(jìn)蛋白發(fā)生相互作用并形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[8-10]。有研究報(bào)道，添加鹽會(huì)促使阿拉斯加鱈魚(yú)魚(yú)糜肌球蛋白重鏈在加熱中發(fā)生聚合，形成良好凝膠強(qiáng)度的魚(yú)糜制品[11]。Gao 等[12]在研究超聲功率、時(shí)間和鹽添加量對(duì)鰱魚(yú)魚(yú)糜凝膠性質(zhì)影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)鹽含量是影響魚(yú)糜凝膠品質(zhì)的主要因素?？妆ＨA等[13]研究發(fā)現(xiàn)，不同鹽對(duì)鯉魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠特性影響程度不同。這些研究結(jié)果表明鹽對(duì)鰻魚(yú)熱加工食品品質(zhì)存在一定的影響，但關(guān)于鹽濃度對(duì)鰻魚(yú)肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠性質(zhì)的影響卻未見(jiàn)報(bào)道。

本研究從歐洲鰻肌肉中提取肌原纖維蛋白，考察了加熱溫度對(duì)肌原纖維蛋白的濁度、表面疏水性、活性巰基的影響，探究了鹽濃度對(duì)肌原纖維蛋白熱變性溫度和流變行為等理化性質(zhì)的影響，最后對(duì)肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠進(jìn)行了表征，結(jié)果將為鰻魚(yú)肌肉蛋白的熱變性規(guī)律研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活淡水養(yǎng)殖歐洲鰻（體重約600 g/尾） 由廈門(mén)同泉水產(chǎn)食品有限公司提供；MgCl2、NaCl 西隴科學(xué)股份有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS） 東京化成工業(yè)株式會(huì)社；乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）、2-硝基苯甲酸（DTNB） 上海麥克林生化科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白（PageRulerTM Protein Ladder） 美國(guó)Thermo Fisher公司。

Aglient 1200 高效液相色譜儀、Zorbax Eclipse AAA 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm） 美國(guó)Agilent公司；UV-8000 A 紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；FP-8200 熒光分光光度計(jì) 日本Jasco 公司；Q2000 差示掃描量熱儀、DHR-2 流變儀 美國(guó)TA 儀器有限公司；TA-XT Plus 質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro System 公司；Nicolet iS50 傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Nicolet 公司；S-4800 電子掃描顯微鏡 日本東京日立制造所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肌原纖維蛋白的提取 參考Brewer 等[14]的方法，鮮活的鰻魚(yú)經(jīng)冰暈、去頭、去皮、去骨、去內(nèi)臟后得到白色魚(yú)肉，整個(gè)蛋白提取步驟在4 ℃條件下進(jìn)行。獲得的白色魚(yú)肉用冷水洗滌、切碎并加入20 倍體積的提取緩沖液（1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA、40 mmol/L NaCl 和20 mmol/L 磷酸鈉緩沖液，pH7.0）后進(jìn)行均質(zhì)。得到的勻漿液經(jīng)過(guò)離心（10000×g，10 min，4 ℃）后取沉淀物，用提取緩沖液再次溶解沉淀物并進(jìn)行均質(zhì)，之后利用紗布過(guò)濾除去不溶物并將濾液離心（10000×g，10 min，4 ℃），取沉淀物并用10 倍體積的冰蒸餾水洗滌，通過(guò)離心獲得肌原纖維蛋白。獲得的肌原纖維蛋白保存在4 ℃，備用；冷凍干燥的樣品供氨基酸分析使用。

1.2.2 肌原纖維蛋白性質(zhì)的測(cè)定

1.2.2.1 氨基酸測(cè)定 將10 mg 凍干的鰻魚(yú)肌肉或肌原纖維蛋白樣品放在氨基酸水解管中，加入1 mL的HCl（6 mol/L）和20 μL 苯酚，利用氮?dú)廒s走空氣并密封，在110 ℃下水解22 h。得到的水解液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除酸后用20 mmol/L HCl 溶解，并0.22 μm膜過(guò)濾，獲得的樣品的氨基酸組成利用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定[15]。

1.2.2.2 濁度測(cè)定 濁度測(cè)定參考Sano 等[16]報(bào)道的方法。將1.2.1 得到的肌原纖維蛋白溶解在含有0.6 mol/L NaCl 的10 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（PBS，pH7.0）中，調(diào)節(jié)蛋白濃度至1 mg/mL 后，將樣品利用水浴加熱，以1 ℃/min 的升溫速率從20 ℃升溫至80 ℃，期間每5 min 取樣一次，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣品在波長(zhǎng)350 nm 處的吸光度值A(chǔ)350。

1.2.2.3 表面疏水性（S0）測(cè)定 表面疏水性的測(cè)定參考Yongsawatdigul 等[17]報(bào)道的方法。將1.2.2.2熱處理得到的肌原纖維蛋白溶液用0.6 mol/L NaCl-20 mmol/L PBS（pH7.0）將蛋白含量稀釋至0.025、0.05 和0.1 mg/mL。稀釋后的樣品溶液（4 mL）與20 μL 10 mmol/L ANS-50 mmol/L PBS（pH7.0）混合，避光反應(yīng)20 min，再利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)為374 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為485 nm 的熒光強(qiáng)度值。通過(guò)計(jì)算熒光強(qiáng)度值對(duì)蛋白質(zhì)濃度的初始斜率，獲得樣品的S0。

1.2.2.4 活性巰基（R-SH）含量測(cè)定 將1.2.2.2 熱處理得到的肌原纖維蛋白溶液（1 mL）與3 mL 含有10 mmol/L EDTA 的0.2 mol/L PBS（pH6.8）混勻，再加入0.4 mL 含有0.1% DTNB 的0.2 mol/L PBS（pH6.8），放在4 ℃下反應(yīng)1 h 后，測(cè)定在412 nm 處的吸光度值，R-SH 含量根據(jù)方海硯等[18]報(bào)道的公式進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 肌原纖維蛋白凝膠性質(zhì)的測(cè)定

1.2.3.1 肌原纖維蛋白溶膠和凝膠的制備 將肌原纖維蛋白加入含有0.1、0.3 和0.5 mol/L NaCl 的PBS（10 mmol/L，pH7.5）中，將蛋白濃度調(diào)整至40 mg/mL，混合并研磨制備成溶膠，研磨過(guò)程保持溫度低于10 ℃。將研磨好的糊狀物裝入內(nèi)徑為20 mm，高度30 mm的玻璃燒杯中，先在40 ℃水浴條件下保溫1 h，再在90 ℃下加熱15 min[19]，加熱結(jié)束后立即用冰水冷卻制備成熱誘導(dǎo)凝膠。溶膠和凝膠保存在4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 變性溫度測(cè)定 利用差示掃描量熱儀（DSC）測(cè)定鰻魚(yú)肌原纖維蛋白的變性溫度。取1.2.3.1 制備的溶膠（10 mg）放入鋁盤(pán)中并密封，以5 ℃/min 的速度從30 ℃升溫至80 ℃，以密封的空盤(pán)作為參考，利用Q2000 配套軟件分析肌原纖維蛋白的變性溫度。

1.2.3.3 流變行為測(cè)定 利用流變儀對(duì)1.2.3.1 制備的溶膠流變行為進(jìn)行測(cè)定。設(shè)置1 mm 間隙，0.1 Hz頻率，1%應(yīng)變，2 ℃/min 升溫速率，采用溫度斜坡掃描的方式測(cè)定溶解在NaCl 溶液中肌原纖維蛋白的儲(chǔ)能模量和損耗模量。

1.2.3.4 凝膠強(qiáng)度測(cè)定 參考Weng 等[20]報(bào)道的方法，利用質(zhì)構(gòu)儀在室溫條件下對(duì)1.2.3.1 制備的熱誘導(dǎo)凝膠強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定。使用的P/5S 球形探頭直徑為5 mm，測(cè)試速度為0.5 mm/s。

1.2.3.5 SDS-PAGE 肌原纖維蛋白和熱誘導(dǎo)凝膠利用含有8 mol/L 尿素和2% SDS 的 20 mmol/L Tris-HCl（pH8.8）溶液進(jìn)行溶解。利用SDS-PAGE 分析時(shí)使用的分離膠濃度為8%，濃縮膠濃度為4%。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色液染色，利用脫色液（甲醇:乙酸:水=3:1:6，v/v/v）脫色后再拍照。

1.2.3.6 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析 將冷凍干燥后的熱誘導(dǎo)凝膠樣品與干燥的KBr 以1:100 的比例混合，充分研磨后壓成薄片。以KBr 為空白，利用Nicolet iS50 FT-IR 光譜儀進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3.7 掃描電鏡（SEM）分析 利用SEM 對(duì)1.2.3.1制備的熱誘導(dǎo)凝膠微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。凝膠樣品的制備和分析按照Weng 等[21]報(bào)道的方法進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖和方差分析（ANOVA），通過(guò)Duncan 多重比較對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐洲鰻肌原纖維蛋白性質(zhì)分析

2.1.1 歐洲鰻肌肉及其肌原纖維蛋白氨基酸組成 歐洲鰻肌肉及其肌原纖維蛋白的氨基酸組成如表1 所示。在鰻魚(yú)肌肉中，含量最高的氨基酸是Glu，其次是Asp 和Arg。作為鮮味特征氨基酸的Glu 和Asp 占總氨基酸的比例達(dá)到27.0%，類似尼羅羅非魚(yú)（26.9%），但高于胡子鯰（19.6%）[22-23]。而且，鰻魚(yú)肌肉中必需氨基酸占總氨基酸的比例為42.0%，高于牛肉（33.2%）、雞肉（35.4%）和豬肉（33.4%）[19]。表1 的氨基酸結(jié)果表明歐洲鰻肌肉中含有優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)。另一方面，肌原纖維蛋白中含量最多的氨基酸也是Glu，其次是Asp、Lys、Leu、Arg 和Ala。鰻魚(yú)肌原纖維蛋白中Gly、Arg、Ala 和Val 的比例略低于鰻魚(yú)肌肉，表明這些氨基酸可能主要分布在鰻魚(yú)水溶性蛋白中。有研究報(bào)道，蛋白凝膠的形成與疏水性氨基酸占比有密切關(guān)系，疏水氨基酸含量越高形成的凝膠微觀結(jié)構(gòu)越均勻致密，當(dāng)疏水性氨基酸含量高于31.5%時(shí)容易形成具有良好質(zhì)構(gòu)的凝膠[23-24]。因此，鰻魚(yú)肌原纖維蛋白中疏水氨基酸（Ala、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Pro）占總氨基酸的比例達(dá)到34.6%（表1），表明鰻魚(yú)肌原纖維蛋白理論上在一定條件下可形成具有良好質(zhì)構(gòu)的凝膠。

表1 鰻魚(yú)肌肉和肌原纖維蛋白的氨基酸組成Table 1 Amino acid compositions of eel muscle and myofibrillar protein

2.1.2 加熱溫度對(duì)肌原纖維蛋白濁度、表面疏水性和活性巰基的影響 圖1（a）顯示了鰻魚(yú)肌原纖維蛋白溶液的濁度隨溫度的變化。當(dāng)肌原纖維蛋白溶液從35 ℃上升到55 ℃時(shí)，濁度值出現(xiàn)顯著增加（P＜0.05）。在熱處理過(guò)程中，蛋白質(zhì)分子的變性和聚集均會(huì)導(dǎo)致濁度增加[25]。類似的現(xiàn)象也出現(xiàn)在鰱魚(yú)肌原纖維蛋白[25]和雞胸肌動(dòng)球蛋白[10]的報(bào)道中。圖1（b）顯示了歐洲鰻肌原纖維蛋白表面疏水性隨溫度的變化情況。當(dāng)溫度35 ℃上升至40 ℃時(shí)，S0增加了約2.5 倍，并在75 ℃處達(dá)到最高值。這個(gè)結(jié)果表明，在35～40 ℃范圍內(nèi)鰻魚(yú)肌原纖維蛋白開(kāi)始變性伸展，包藏在蛋白內(nèi)部的疏水基團(tuán)大部分暴露出來(lái)，在75 ℃左右部分疏水殘基參與了蛋白分子的聚集。這與Yongsawatdigul 等[17]研究報(bào)道的鯛魚(yú)肌動(dòng)球蛋白熱變性和聚集行為一致。Tornberg[26]在研究加熱對(duì)蛋白質(zhì)的影響時(shí)也得到類似的結(jié)論，一些暴露的疏水殘基在65 ℃以上時(shí)通過(guò)蛋白-蛋白相互作用發(fā)生聚集。鰻魚(yú)肌原纖維蛋白的R-SH 含量在30 ℃時(shí)開(kāi)始增加，在40～55 ℃之間出現(xiàn)劇烈增加（圖1c）。這表明鰻魚(yú)肌原纖維蛋白在40～55 ℃下包埋在蛋白內(nèi)部的巰基容易暴露出來(lái)，類似于豬肉的天然肌動(dòng)球蛋白[27]。圖1 的結(jié)果表明，鰻魚(yú)肌原纖維蛋白的性質(zhì)更接近高脂肪動(dòng)物肌肉中的肌原纖維蛋白。這是因?yàn)榧∪饫w維的大小不僅與物種相關(guān)，還會(huì)受到肌內(nèi)脂肪含量的影響[28]。

圖1 溫度對(duì)歐洲鰻肌原纖維蛋白濁度（a）、表面疏水性（b）和活性巰基（c）的影響Fig.1 Effect of temperature on turbidity (a), surface hydrophobicity (b) and reactive sulfhydryl groups (c) of European eel myofibrillar protein

2.1.3 NaCl 濃度對(duì)肌原纖維蛋白熱穩(wěn)定性的影響NaCl 濃度對(duì)歐洲鰻肌原纖維蛋白熱穩(wěn)定性的影響如圖2 所示。在任一NaCl 濃度溶解的肌原纖維蛋白DSC 曲線上，均出現(xiàn)2 個(gè)明顯的吸熱峰。第一個(gè)吸熱峰反映的是肌球蛋白的熱變性溫度，而第二個(gè)吸熱峰反映的是肌動(dòng)蛋白的熱變性溫度[29]。當(dāng)NaCl 濃度從0.1 mol/L 提高至0.3 mol/L 時(shí)，肌球蛋白的熱變性溫度隨之降低，但進(jìn)一步提高NaCl 濃度卻沒(méi)有產(chǎn)生明顯變化（圖2）。相對(duì)于肌球蛋白，肌動(dòng)蛋白的變性溫度伴隨NaCl 濃度的增加持續(xù)下降，這與NaCl濃度對(duì)雞胸肉中肌原纖維蛋白熱穩(wěn)定性的影響一致[30]，表明肌動(dòng)蛋白的展開(kāi)比肌球蛋白更容易受到NaCl濃度的影響。因此，添加NaCl 有利于肌動(dòng)蛋白展開(kāi)，促進(jìn)與肌球蛋白交聯(lián)形成高強(qiáng)度的蛋白凝膠。

圖2 NaCl 濃度對(duì)歐洲鰻肌原纖維蛋白熱變性溫度的影響Fig.2 Effect of NaCl concentration on thermal denaturation temperature of European eel myofibrillar protein

2.1.4 NaCl 濃度對(duì)肌原纖維蛋白流變特性的影響通過(guò)測(cè)定流變性質(zhì)中的儲(chǔ)能模量（G'）和損耗模量（G＂），可以深入了解蛋白凝膠形成性能的特征，因此測(cè)定了NaCl 濃度對(duì)鰻魚(yú)肌原纖維蛋白流變性質(zhì)的影響（圖3）。由0.1 mol/L NaCl 溶解的肌原纖維蛋白的G'在45 ℃時(shí)開(kāi)始上升，在64 ℃時(shí)達(dá)到峰值，但進(jìn)一步升溫會(huì)導(dǎo)致G'下降。由0.3 mol/L NaCl 溶解肌原纖維蛋白的G'峰值出現(xiàn)在48 ℃，在48 ℃至53 ℃之間出現(xiàn)一定下降后，從53 ℃再次上升直至72 ℃后不再發(fā)生明顯變化。0.5 mol/L NaCl 溶解的鰻魚(yú)肌原纖維蛋白的G'變化趨勢(shì)類似于0.3 mol/L NaCl 溶解的蛋白，但G'隨溫度的變化更明顯，且達(dá)到峰值所需的溫度更低（圖3a）。據(jù)報(bào)道，G'下降是由于形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)被破壞導(dǎo)致蛋白構(gòu)象變化引起的結(jié)果[31]，而G'增加歸因于展開(kāi)的蛋白再次形成三維網(wǎng)狀凝膠結(jié)構(gòu)[32]。因此，G'隨鹽濃度變化的原因可能是肌原纖維蛋白在高濃度NaCl 條件下更容易溶解，從而在較低加熱溫度下就可以展開(kāi)、聚集并形成三維網(wǎng)狀凝膠結(jié)構(gòu)。作為儲(chǔ)能模量的G'其大小與凝膠特性有關(guān)[33]，G'的上升代表凝膠剛性增強(qiáng)，表明形成了彈性凝膠結(jié)構(gòu)[34]。這說(shuō)明高的鹽濃度有利于促進(jìn)蛋白凝膠化過(guò)程，可以提高鰻魚(yú)肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度。另一方面，鰻魚(yú)肌原纖維蛋白的G＂也隨著NaCl 濃度的增加而增加，且峰值對(duì)應(yīng)的溫度都隨著NaCl 濃度的升高而降低（圖3b）。溶解在0.5 mol/L NaCl 中的鰻魚(yú)肌原纖維蛋白的G'和G＂的峰值遠(yuǎn)高于其他樣品，表明0.5 mol/L NaCl溶解的鰻魚(yú)肌原纖維蛋白可以形成熱不可逆凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。因此，提高NaCl 濃度可以降低鰻魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠形成溫度，有利于形成良好強(qiáng)度的凝膠，這可能是由于鰻魚(yú)肌原纖維蛋白中富含疏水性氨基酸（表1）。

圖3 NaCl 濃度對(duì)歐洲鰻肌原纖維蛋白儲(chǔ)能模量（a）和損耗模量（b）的影響Fig.3 Effect of NaCl concentration on storage modulus (a) and loss modulus (b) of European eel myofibrillar protein

2.2 歐洲鰻肌原纖維蛋白凝膠性質(zhì)分析

2.2.1 鹽濃度對(duì)蛋白凝膠強(qiáng)度的影響 NaCl 濃度對(duì)歐洲鰻肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠破斷力和破斷距離的影響如圖4 所示。0.1 mol/L NaCl 溶解的肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠其破斷力最低，伴隨NaCl 濃度增加出現(xiàn)顯著上升（P＜0.05）。類似的變化趨勢(shì)也出現(xiàn)在NaCl 濃度對(duì)熱誘導(dǎo)凝膠破斷距離的影響中（圖4b）。與豬肉肌原纖維蛋白相比[4]，0.5 mol/L NaCl 溶解的鰻魚(yú)肌原纖維蛋白具有更高的凝膠形成性能。這可能是提高NaCl 濃度可以降低鰻魚(yú)肌原纖維蛋白的肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的變性溫度（圖2），結(jié)果使溶解在0.5 mol/L NaCl 鰻魚(yú)肌原纖維蛋白在較低的溫度下容易變性伸展，逐漸形成高粘彈性的溶膠和高強(qiáng)度的凝膠（圖3 和圖4）。

圖4 NaCl 濃度對(duì)歐洲鰻肌原纖維蛋白凝膠破斷力（a）和破斷距離（b）的影響Fig.4 Effect of NaCl concentration on breaking strength (a)and breaking distance (b) of European eel myofibrillar protein gels

2.2.2 鹽濃度對(duì)鰻魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠組分的影響

歐洲鰻肌原纖維蛋白和不同NaCl 濃度制備的熱誘導(dǎo)蛋白凝膠的電泳圖譜如圖5 所示。從圖中可以看出，肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白是鰻魚(yú)肌原纖維蛋白的主要成分。隨著NaCl 濃度的增加，肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白的條帶逐漸變淺，而不能進(jìn)入SDS-PAGE分離膠的高分子量組分條帶強(qiáng)度略有增加。有研究報(bào)道，高濃度NaCl 溶液可以改變肌原纖維蛋白的狀態(tài)，導(dǎo)致溶解的肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白相互交聯(lián)聚集形成肌動(dòng)球蛋白[35-36]。因此，本研究獲得的高強(qiáng)度鰻魚(yú)肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠可歸因于溶解的肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白相互作用的結(jié)果（圖4 和圖5）。

圖5 肌原纖維蛋白和熱誘導(dǎo)蛋白凝膠的SDS-PAGE 圖譜Fig.5 SDS-PAGE patterns of myofibrillar protein and heatinduced protein gels

2.2.3 鹽濃度對(duì)鰻魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠相互作用的影響 不同NaCl 濃度制備的熱誘導(dǎo)鰻魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠的FTIR 光譜如圖6 所示。凝膠樣品在波數(shù)3293～3273 cm-1（酰胺A）處顯示出強(qiáng)而寬的吸收帶，這歸因于N-H 和O-H 的伸縮振動(dòng)。酰胺A 通常用于證明蛋白質(zhì)和水分子之間的相互作用[37]。波數(shù)1700～1600 cm-1（酰胺I）處的條帶歸因于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的C=O 伸縮振動(dòng)[38]。波數(shù)在1539～1536 cm-1處和1401～1398 cm-1處的條帶分別表示酰胺II 和酰胺III，與N-H 彎曲和C-N 伸縮振動(dòng)有關(guān)[38]。這些區(qū)域內(nèi)波數(shù)和吸光度的變化均可以解釋為蛋白質(zhì)水合作用所導(dǎo)致的凝膠中氫鍵的變化[39]。隨著NaCl 濃度從0.1 mol/L 增加到0.5 mol/L，酰胺A 從波數(shù)3285 cm-1處移動(dòng)到波數(shù)3273 cm-1處，表明增加NaCl 濃度可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的水合，從而引起凝膠樣品中分子內(nèi)氫鍵的增加[37]。凝膠樣品中酰胺I不受NaCl 濃度的影響，而酰胺II 的峰強(qiáng)度隨NaCl濃度的增加而增加。據(jù)報(bào)道，酰胺II/酰胺I 的強(qiáng)度比增加可以解釋為蛋白結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量的減少[40]。因此，NaCl 濃度的增加會(huì)引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中α-螺旋的減少，同時(shí)引起蛋白質(zhì)凝膠化過(guò)程中氫鍵數(shù)量的增加。另一方面，NaCl 還被發(fā)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的溶解有積極的影響[11]。因此，在熱誘導(dǎo)鰻魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠化過(guò)程中，隨著NaCl 濃度的增加，變性伸展的蛋白質(zhì)分子之間的水合作用增強(qiáng)，從而提高蛋白凝膠的強(qiáng)度。

圖6 熱誘導(dǎo)肌原纖維蛋白凝膠的FTIR 圖譜Fig.6 FTIR spectra of heat-induced myofibrillar protein gels

2.2.4 鹽濃度對(duì)鰻魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響 不同NaCl 濃度制備的熱誘導(dǎo)鰻魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)如圖7 所示。在0.1 mol/L NaCl 制備的熱誘導(dǎo)凝膠的微觀結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)大量的團(tuán)塊和棒狀纖維（圖7a）。在0.3 mol/L NaCl 制備的肌原纖維蛋白凝膠中，盡管也存在一些棒狀纖維，但出現(xiàn)了明顯可見(jiàn)的細(xì)絲纖維結(jié)構(gòu)（圖7b）。當(dāng)NaCl 濃度進(jìn)一步增加至0.5 mol/L 時(shí)，凝膠中的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得均勻、致密、有序（圖7c）。這與Iwasaki 等[41]報(bào)道的熱誘導(dǎo)雞胸肌肌動(dòng)球蛋白凝膠化的結(jié)果一致，在0.4 mol/L NaCl 或更高濃度下可以形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。圖7 的結(jié)果再次表明，鰻魚(yú)肌原纖維蛋白需要在一定NaCl 濃度下才能變性伸展形成具有良好強(qiáng)度的凝膠。

圖7 NaCl 濃度對(duì)熱誘導(dǎo)肌原纖維蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 Effect of NaCl concentration on the microstructure of heat-induced myofibrillar protein gels

3 結(jié)論

歐洲鰻肌原纖維蛋白富含疏水性氨基酸，在加熱過(guò)程中包埋在蛋白內(nèi)部的疏水基團(tuán)在35 ℃時(shí)開(kāi)始暴露，活性巰基在40 ℃時(shí)開(kāi)始暴露。隨著NaCl濃度的增加，溶解的肌原纖維蛋白尤其是肌動(dòng)蛋白的變性溫度逐漸下降，而肌原纖維蛋白的G'和G＂均逐漸增加。本研究的結(jié)果還表明，提高NaCl 濃度能夠促進(jìn)蛋白的展開(kāi)以及在熱誘導(dǎo)凝膠化過(guò)程中蛋白質(zhì)分子間的氫鍵作用，從而形成具有致密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和高強(qiáng)度的鰻魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠。研究結(jié)果將為熱加工中利用NaCl 濃度調(diào)控鰻魚(yú)肌肉蛋白變性和產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)品質(zhì)提供數(shù)據(jù)支撐，為利用鰻魚(yú)生產(chǎn)加熱預(yù)制調(diào)理食品提供理論指導(dǎo)。