酶法制備低聚異麥芽糖的研究現(xiàn)狀

阮圣慧，姜彩霞，劉曉蘭 ，鄭喜群,,

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)國家雜糧工程技術(shù)中心，黑龍江大慶 163319；3.糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江大慶 163319；4.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

在全球范圍內(nèi)，與飲食有關(guān)的非傳染性疾病已成為增加死亡率和發(fā)病率的主要原因，包括高血壓、糖尿病、肥胖和心血管疾病等，因此消費者越來越注重健康，并不斷尋求對健康有益的食品[1]。目前非消化性低聚糖如低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、異麥芽低聚糖、低聚木糖等可作為益生元，能有效促進體內(nèi)有益菌的代謝和增殖，改善宿主健康[2-3]。其中低聚異麥芽糖（Isomaltooligosaccharides, IMOs）作為具有益生元活性的碳水化合物更加受到人們高度關(guān)注。

IMOs 是一種不易被人體消化的葡萄糖基通過不規(guī)則連接構(gòu)成的短鏈低聚糖[4]。在食品體系中具有穩(wěn)定性高，價格低，容易獲得等優(yōu)點[5]。同時，IMOs 具有雙歧因子特性，有助于激活免疫系統(tǒng)，刺激腸道蠕動，改善排便，降低總膽固醇水平，改善脂質(zhì)代謝[6-8]，且其具有相對較高的安全性。OKU 和NAKAMURA 團隊[9-10]證實人體對IMOs 具有良好的耐受性，無任何短暫的滲透性腹瀉或胃腸不適等不良癥狀出現(xiàn)。GRUBIC 等[11]研究結(jié)果表明服用IMOs 與等效劑量的葡萄糖安慰劑的受試者相比，在頭痛、頭暈、低血糖、疲勞或腹瀉方面的結(jié)果無明顯差異。

酶是一種可以高效控制特定化學(xué)反應(yīng)的一種通用的生物催化劑[12]。目前商品化的IMOs，是先利用耐高溫α-淀粉酶將淀粉液化制備糊精，然后經(jīng)β-淀粉酶和普魯蘭酶糖化得到麥芽糖，最后用α-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基化作用將麥芽糖轉(zhuǎn)化為IMOs[13]。然而單酶催化因存在成本高、操作穩(wěn)定性差、酶的再利用困難[14]等缺點而限制其在工業(yè)生產(chǎn)IMOs 中的應(yīng)用，而生物技術(shù)的應(yīng)用是克服其限制因素的有效手段。本文對近年國內(nèi)外IMOs 工業(yè)化生產(chǎn)相關(guān)酶修飾技術(shù)的研究進行了梳理，重點對酶法轉(zhuǎn)化、酶膜生物反應(yīng)器、酶固定化，生物催化技術(shù)的應(yīng)用研究進行了總結(jié)，通過整合和比較分析，剖析現(xiàn)有技術(shù)的不足，利用現(xiàn)代酶技術(shù)的相關(guān)理論知識，結(jié)合IMOs 特點對酶技術(shù)在該領(lǐng)域今后的研究趨勢進行了展望，以期最大限度地使酶能夠高效、循環(huán)多次地利用于IMOs的生產(chǎn)過程，從而降低食品工業(yè)制備IMOs 成本，降低能耗，同時提高功能性結(jié)構(gòu)的低聚糖的占比，增加產(chǎn)品的附加值，為其在工業(yè)生產(chǎn)IMOs 的進一步應(yīng)用研究提供參考。

1 低聚異麥芽糖的結(jié)構(gòu)及類型

IMOs 是由α-D-（1,6）糖苷鍵、α-（1,4）糖苷鍵、少量的α-（1,3）鍵或α-（1,2）鍵連接的同源低聚糖[15]。聚合度（Degree of polymerization, DP）為2～10，其中DP≤2 為異麥芽糖，DP≥3 為潘糖、異潘糖、異麥芽三糖、黑曲霉糖、曲二糖、長鏈IMOs 和環(huán)狀I(lǐng)MOs[16-17]（如圖1）。天然的IMOs 存在于醬油、清酒、味噌、蜂蜜和發(fā)酵食品中，如泡菜和酵母面包[10]，商業(yè)化的IMOs 主要利用淀粉制備而得。IMOs 具有低熱值，促進腸道蠕動，改善便秘和脂質(zhì)代謝等優(yōu)點，多作為益生元、食品添加劑、飼料成分等被廣泛應(yīng)用[18]。

圖1 IMOs 的通用名稱和化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 IMOs common names and chemical structures

IMOs 有3 種類型，類型Ⅰ是由α-1,6 寡聚葡聚糖，通過α-1,4 糖苷鍵連接到葡萄糖基上的線性鏈，被稱為“6-O-α-異麥芽寡糖基-D-麥芽糖（IMOMs）”，即麥芽糖基-低聚異麥芽糖（MIMOs），主要包括異麥芽糖和潘糖，其中潘糖可作為三糖的代表，其同源物又被稱為PAN-型低聚糖；類型Ⅱ則由線性α-1,6 低聚糖組成，如異麥芽三糖（Isomaltotriose，IMT），通常被稱為IMT-型低聚糖；另外，還有以前兩種類型為主鏈，葡萄糖的支鏈有α-1,2、α-1,3 或α-1,4 連接的線性結(jié)構(gòu)[19]，如曲二糖、黑曲霉糖。

2 低聚異麥芽糖的生產(chǎn)工藝

不同結(jié)構(gòu)的IMOs 對其在功能性食品工業(yè)中的應(yīng)用至關(guān)重要。需要選擇合適的生物催化劑，糖基受體與供體的比例，調(diào)節(jié)聚合程度和產(chǎn)品中α-（1,4）和α-（1,6）糖苷鍵的比例[20]。目前多以淀粉為原料，經(jīng)酶法生產(chǎn)IMOs[21]。原料主要包括谷物淀粉（如玉米、大米、小麥等）和植物根部或塊莖（如紅薯、木薯、馬鈴薯等），以及從麥芽糖和葡聚糖中提取的淀粉水解物，因此生產(chǎn)IMOs 的原料大多具有來源廣泛且價格低廉的特點。

目前工業(yè)生產(chǎn)IMOs 的研究主要集中在酶法轉(zhuǎn)化和利用酶膜生物反應(yīng)器、酶的固定化和生物催化[22]等生物技術(shù)手段來提高IMOs 的生產(chǎn)效率（如圖2）。

圖2 酶法生產(chǎn)低聚異麥芽糖的工藝流程[22]Fig.2 Enzymatic production scheme of isomaltooligosaccharides[22]

2.1 酶法轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)移酶和水解酶家族的各種酶均可作用于不同底物生產(chǎn)IMOs。水解酶家族中的α-葡萄糖苷酶是工業(yè)生產(chǎn)IMOs 的關(guān)鍵酶之一，其可通過與糖基直接連接部分進行水解反應(yīng)或?qū)⑻腔鶜埢鶑幕罨w轉(zhuǎn)移到受體上進行催化糖基化反應(yīng)[23]。以淀粉為底物，通過來源于曲霉屬α-轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶（EC 2.4.1.24）的轉(zhuǎn)苷作用，可大規(guī)模生產(chǎn)聚合度范圍在2～6 的IMOs產(chǎn)品[24]。表1 詳細介紹了利用不同底物生產(chǎn)不同聚合度的IMOs 產(chǎn)品所用的酶組合。

表1 生產(chǎn)不同聚合度低聚異麥芽糖用酶Table 1 Different enzyme combinations utilized in the production of short and long-chain isomaltooligosaccharides

PAN 等[25]利用α-轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶和酵母菌生產(chǎn)出高純度IMOs，結(jié)果表明酵母發(fā)酵可消耗反應(yīng)體系中生成的葡萄糖，提高IMOs 的含量。LEE 等[26]用來自嗜熱脂肪芽孢桿菌（BSMA）的淀粉酶和來自海棲熱袍菌的α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶（α-Gtase）同時使用較單酶能有效提高IMOs 的產(chǎn)量。但傳統(tǒng)酶法生產(chǎn)IMOs 的主要缺點是需要進行多步驟處理，例如糊化、液化和糖基化[15]。為進一步簡化工藝流程，目前已有同時進行糖化和轉(zhuǎn)糖基化或使用多種酶液生產(chǎn)IMOs[24-27]的相關(guān)研究。同時，工程融合酶（重組酶）的應(yīng)用也能夠提升IMOs 的產(chǎn)量[28-29]。相關(guān)文獻報道表明，長鏈IMOs（DP≥10）才具有益生元活性，可由淀粉麥芽糖酶和α-轉(zhuǎn)葡糖苷酶復(fù)配獲得[17,30]。多酶復(fù)配的優(yōu)點是其具有高效性，可減少酶負荷，生產(chǎn)出不同聚合度的IMOs 產(chǎn)品，并能夠運用在一步液化或糖化工藝中。此外，還需對酶促反應(yīng)動力學(xué)進行研究，這樣不僅能夠科學(xué)利用酶法轉(zhuǎn)化技術(shù)，還利于深入剖析酶的調(diào)控機制。

2.2 酶膜生物反應(yīng)器

酶膜反應(yīng)器耦合了生物酶催化反應(yīng)過程和膜分離過程，溶質(zhì)可通過膜上外加電場、化學(xué)勢或壓力從反應(yīng)混合物中進行滲透分離[37]。還可將生物催化，產(chǎn)物的分離、濃縮和酶的回收等操作同時進行。近年來，商品化的生物催化酶已經(jīng)被廣泛地投入到低聚糖制備的工業(yè)生產(chǎn)中，而膜分離技術(shù)也在低聚糖的分離純化階段發(fā)揮著重要的作用。酶膜反應(yīng)器在糖類制備中主要是用于制備淀粉糖，右旋糖酐酶膜反應(yīng)器的出現(xiàn)實現(xiàn)了長鏈IMOs 的連續(xù)合成[38]。這項技術(shù)可通過10000 分子量截留單位的膜和改變酶與底物的比例對產(chǎn)品的分子量加以限制。GOULAS 等[29]使用可回收的超濾膜反應(yīng)器，實現(xiàn)了IMOs 的連續(xù)生產(chǎn)，而ZHANG 等[6]則將α-葡萄糖苷酶添加在超濾膜之間，增加了IMOs 透膜速率，使IMOs 的產(chǎn)量提高到58.1%。

當(dāng)前制備IMOs 的酶膜反應(yīng)器中，所用酶主要以游離態(tài)形式存在。酶以游離態(tài)形式存在，其反應(yīng)條件會受到很大的限制，雖然活性較高，但穩(wěn)定性差，使酶膜體系不能夠長期穩(wěn)定地運行[39]。相比于游離態(tài)的酶，固定化酶的活性雖有所降低，但其穩(wěn)定性更有利于連續(xù)性操作，也更利于放大化生產(chǎn)IMOs。此外，酶膜反應(yīng)體系中，膜僅靠孔徑篩分分離分子尺寸差異較大的分子。但在IMOs 的酶促反應(yīng)中，異構(gòu)糖之間并不能通過簡單的孔徑篩分進行有效分離[40]。為此可以利用手性分離膜原理將膜功能化，使其具備分離異構(gòu)體的功能，同時作為固定化酶的載體，這不僅能夠緩解由產(chǎn)物抑制所導(dǎo)致的反應(yīng)平衡，還可以直接得到產(chǎn)物。

2.3 酶的固定化

酶催化在生產(chǎn)IMOs 領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用，然而在實際工業(yè)生產(chǎn)中因酶的成本問題以及其自身存在最適pH、最適溫度等約束條件而限制了酶的應(yīng)用。酶固定化技術(shù)的運用則可提高酶的耐用性，擴大酶的適用范圍[41]。相比游離酶，固定化酶可以循環(huán)使用，易于從反應(yīng)體系中分離[42]，另外，固定化酶的穩(wěn)定性通常高于游離酶，有利于IMOs 的連續(xù)高效生產(chǎn)[43]。ZHANG 等[44]以麥芽糖為底物，將α-轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶固定在海藻酸-殼聚糖-磷酸鈣雜化膠囊中。經(jīng)過固定化的α-轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶在循環(huán)使用15 次后，酶活仍能保留60%。BERTRAND 等[33]右旋糖苷酶固定在對流相互作用介質(zhì)中。結(jié)果表明固定化酶在高溫下顯示出良好的穩(wěn)定性，以及在使用78 d 后酶活仍能保留78%。重組酶的出現(xiàn)使IMOs 生產(chǎn)過程中葡萄糖的生成量減少，顯著提高了IMOs 的產(chǎn)量[17]。來源于海棲熱袍菌的麥芽糖轉(zhuǎn)葡糖基酶和來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶共同在大腸桿菌中表達，將IMOs 的含量提高到68%[24]，這與傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法相比IMOs 的含量高出15%。但在固定化過程中可能存在一定的問題，如酶活損失，以及某些酶經(jīng)固定化后底物特異性發(fā)生改變，這可能與底物結(jié)合口袋的變化有關(guān)[45-46]。為此，可以對不同種類酶的反應(yīng)條件選擇合適的載體和固定化方法，調(diào)控優(yōu)化固定化條件，這樣更有利于運用固定化技術(shù)來實現(xiàn)IMOs 的連續(xù)高效生產(chǎn)。

2.4 生物催化

生物催化是利用酶或者生物有機體（細胞、細胞器和組織等）作為催化劑進行化學(xué)轉(zhuǎn)化的反應(yīng)過程[47]。全細胞催化作為生物催化技術(shù)的一個重要分支是在微生物細胞的作用下，將某種底物轉(zhuǎn)化成特定產(chǎn)物的過程，其實質(zhì)是生物體系中酶的催化作用[48]。與傳統(tǒng)的提取酶催化相比細胞自身就是一個天然的酶催化系統(tǒng)，細胞內(nèi)完整的多酶體系可以實現(xiàn)酶的級聯(lián)反應(yīng)[49]，提高催化效率，減少傳統(tǒng)酶催化細胞裂解和蛋白質(zhì)濃縮等步驟。不同于化學(xué)法和傳統(tǒng)酶催化法，全細胞催化法合成IMOs 無需額外補充昂貴的輔因子，也無需進行酶的純化和分離，可大大降低成本，具有底物來源廣、反應(yīng)無污染、產(chǎn)物純度高的優(yōu)點[50]。此外，酶在其原生細胞質(zhì)中凍干處理后將酶封閉在其原始構(gòu)象中使得整個細胞可以回收重復(fù)利用，具有較高的性價比[51]。OJHA 等[33]利用該技術(shù)將細胞與來自微小桿菌的 α-葡萄糖苷酶結(jié)合，將麥芽糖轉(zhuǎn)化為IMOs，其轉(zhuǎn)化效率可達58%。PAN 等[25]利用酶轉(zhuǎn)化與發(fā)酵的方法生產(chǎn)出低純度的IMOs，而在此期間OJHA 等[33]和 RUDEEKULTHAMRONG 等[17]則利用全細胞生物催化與復(fù)合酶技術(shù)作用于麥芽糖和麥芽三糖，提高了IMOs 的產(chǎn)量和純度，但所使用的產(chǎn)酶菌體則無法再次回收利用。而黑曲霉是一種絲狀真菌具有產(chǎn)酶能力強，菌體便于回收等特點，是用于全細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)IMOs 的理想菌種[52-53]。因此，可選擇重復(fù)利用黑曲霉細胞生產(chǎn)IMOs 將有利于進一步提高商品IMOs 的純度和增加IMOs 的工業(yè)生產(chǎn)效率。

3 酶法制備低聚異麥芽糖現(xiàn)存問題

3.1 酶的特異性和底物選擇性差異

盡管現(xiàn)有的一些新型酶已經(jīng)用于IMOs 的生產(chǎn)，但仍存在一些不足之處。如底物的轉(zhuǎn)化率低，轉(zhuǎn)糖基化階段所需時間長，以及酶的不合理使用[27]。而且從不同植物、哺乳動物、昆蟲、細菌和真菌中分離純化獲得的α-葡萄糖苷酶，具有不同的底物選擇性[54]。以及無論是野生型還是由細菌或霉菌通過基因改造等方式獲得的內(nèi)切酶和外切酶作用不同底物產(chǎn)生IMOs的速率和產(chǎn)量均有不同[55]。根據(jù)對寡糖底物的水解方式可將葡萄糖苷酶分為外切（exo-）型與內(nèi)切（endo-）型，根據(jù)底物特異性分為3 類，Ⅰ型偏好水解多種異質(zhì)底物（如蔗糖和芳基-α-葡萄糖苷）；Ⅱ型在水解同質(zhì)底物上更活躍（主要底物為麥芽糖、異麥芽糖），對異質(zhì)底物的活性較低；Ⅲ型類似于Ⅱ型，但可水解長鏈底物（如多糖和淀粉）[56]。這些因素決定了所生產(chǎn)的IMOs 的特異性、聚合度、連接序列和連接類型的差異。因此，研究不同來源的酶的性質(zhì)和酶促反應(yīng)進程為工業(yè)生產(chǎn)IMOs 有著重要的意義。

3.2 酶膜反應(yīng)器性能的提升

酶膜反應(yīng)器作為一種生產(chǎn)低聚糖的新型技術(shù)[57]，其獨特的優(yōu)點是在整個過程中反應(yīng)可連續(xù)高效進行，產(chǎn)品中不含有酶，酶可回收再利用，對底物和產(chǎn)物的抑制性較小，生產(chǎn)成本低[58]。然而，在目前的應(yīng)用狀態(tài)下也有一些亟待解決的問題，例如隨著反應(yīng)時間的延長酶的活力逐漸下降，催化性能和膜的傳質(zhì)性能也都會有所降低[59]，導(dǎo)致低聚糖的產(chǎn)量減少。目前，膜材料的不斷發(fā)展使膜的功能也不斷提高[60-61]，可以更好地解決酶活力損失、傳質(zhì)速度下降等各種問題，還可運用更加精準(zhǔn)的反應(yīng)分離設(shè)計[62]、多酶協(xié)同催化[63]等技術(shù)來提高酶膜反應(yīng)器的性能。為此，研究相關(guān)酶的性質(zhì)以及提高酶膜反應(yīng)器的性能成為了IMOs 產(chǎn)業(yè)化面臨的關(guān)鍵問題。

3.3 固定化酶技術(shù)的推廣

目前，固定化酶具有理想的化學(xué)和物理性質(zhì)，也可回收再利用，在高溫下仍能保持良好的穩(wěn)定性，反應(yīng)pH 范圍廣，最終產(chǎn)品不含有酶。然而，固定化酶運用于IMOs的生產(chǎn)僅局限于實驗室層面，難以大量生產(chǎn)高純度的IMOs，也很難用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，其主要原因是生產(chǎn)成本較高。因此，研究簡便易操作和降低載體成本的固定化酶技術(shù)對工業(yè)生產(chǎn)IMOs 至關(guān)重要。

3.4 全細胞生物催化技術(shù)的應(yīng)用

當(dāng)前全細胞生物催化在IMOs 的生產(chǎn)中取得了一定的成效，但其存在的不足是轉(zhuǎn)化過程較為復(fù)雜，細胞的生長和底物的轉(zhuǎn)化是同時進行的。細胞內(nèi)的各種反應(yīng)會產(chǎn)生許多副產(chǎn)物。若酶未結(jié)合在細胞表面上，還需要用化學(xué)或物理方法對酶進行處理。還會由于細胞膜的傳質(zhì)阻礙，使全細胞催化的效率降低。因此，提高細胞催化劑的高效性及循環(huán)利用性，以及保證細胞體系較高的傳質(zhì)速率，對實現(xiàn)細胞催化從實驗室走向工業(yè)化生產(chǎn)IMOs 有著重要的意義。

4 總結(jié)與展望

隨著消費者對功能性食品的需求不斷增加，與其他具有益生元作用的低聚糖相比，IMOs 添加在不同食品中的潛在價值也更高。為了提高IMOs 的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率，運用新的生物技術(shù)手段是必不可少的，使用這些生物技術(shù)方法來改進生產(chǎn)工藝，是將IMOs 的產(chǎn)量達到人們所預(yù)期的最大值的一個重要步驟。雖然現(xiàn)有的技術(shù)已有應(yīng)用報道，但仍然存在許多因素限制了酶法制備IMOs 在食品工業(yè)中的應(yīng)用。因此，需要進行更深入的研究來應(yīng)對這些問題：a. 研究不同來源的酶的性質(zhì)和酶促反應(yīng)進程；b. 提高酶膜反應(yīng)器的性能；c. 研究簡便易操作和降低載體成本的固定化酶技術(shù)；d. 提高細胞催化的高效性及循環(huán)利用性，以實現(xiàn)細胞催化從實驗室走向工業(yè)化。為此，一方面可在生物信息學(xué)和基因測序技術(shù)的幫助下，研究在自然界中不同來源的酶的性質(zhì)。另一方面，還可對生產(chǎn)IMOs 的關(guān)鍵酶進行定向進化、合理設(shè)計以及計算機輔助對其更進一步的工程改造，以改變酶的活性、底物范圍、最適pH 等酶催化特性，從而獲得具有最佳兼容性的工程酶。此外，新型膜材料的使用，多酶協(xié)同催化有利于酶膜反應(yīng)器在工業(yè)生產(chǎn)IMOs 的發(fā)展?？偟膩碚f，隨著酶工程的發(fā)展、酶催化機制的深入研究、新酶的探索及開發(fā)，酶技術(shù)在工業(yè)的應(yīng)用潛力巨大，期望在未來的發(fā)展中，對于酶學(xué)方面做出更深入的研究，并結(jié)合生物技術(shù)、基因工程、蛋白質(zhì)工程等將新技術(shù)的優(yōu)勢運用到工業(yè)中，以此來更好地解決在規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)IMOs 過程中所遇到的產(chǎn)量、時間、成本和資源等方面的問題。使用新型酶和利用酶膜生物反應(yīng)器、酶的固定化和生物催化等生物技術(shù)手段將會在工業(yè)生產(chǎn)低聚糖領(lǐng)域取得更大的應(yīng)用并發(fā)揮越來越重要的作用。