多尺度蛋白質(zhì)-多糖基益生菌遞送體系研究進(jìn)展

余帥朋，崔 玥，王 琳,2，李 達(dá)，蒲曉璐,

（1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北石家莊 050018；2.君樂寶乳業(yè)集團(tuán)，河北石家莊 050221）

益生菌（probiotics）是一類對宿主有益的活性微生物。當(dāng)達(dá)到足夠數(shù)量時(shí)，益生菌可以通過調(diào)節(jié)宿主黏膜與系統(tǒng)免疫功能或調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群平衡，對宿主發(fā)揮健康作用[1]。常用于食品中的益生菌主要從發(fā)酵食品或糞便微生物菌群中分離篩選而來[2]，包括了雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、酵母菌屬（Saccharomyces）等（圖1）。益生菌必須能夠順利到達(dá)腸道內(nèi)且有足夠活菌量（通常應(yīng)達(dá)到至少106CFU/g 以上）才能達(dá)到有效遞送效果，發(fā)揮其益生作用[3]。然而，大多數(shù)益生菌對加工和儲存過程中酸、氧氣、熱、光照、水分活度等外部環(huán)境條件[4-5]，以及對人體消化道環(huán)境中的胃酸、消化酶和膽鹽[6]抵抗力差，致使活菌量大幅度降低，益生作用失效[7]。

圖1 食品中常用的益生菌種類及其益生作用[8-9]Fig.1 Probiotics species widely used in food and their health benefits[8-9]

為了提高益生菌對不良環(huán)境的抵抗力和存活率，建立有效的活性益生菌遞送體系是最為有效的方法之一。蛋白質(zhì)和多糖是具有健康、安全、生物兼容性、生物可降解性等特性，常用于制備食品遞送體系的天然生物聚合物。在特定的加工技術(shù)條件下，利用蛋白質(zhì)和多糖之間的相互作用可以組裝形成多尺度結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)-多糖基益生菌遞送體系，并設(shè)計(jì)出實(shí)現(xiàn)靶向傳輸目的的功能性食品，其原因主要有三：第一，蛋白質(zhì)-多糖的結(jié)合使用可以協(xié)同形成更穩(wěn)定、更致密、更高機(jī)械強(qiáng)度的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[10]，并互補(bǔ)單一生物聚合物的缺點(diǎn)，比如蛋白質(zhì)顆粒易聚集、多糖通常乳化性較差等[11]，從而提高遞送體系對酸、離子強(qiáng)度、熱等加工過程和貯存環(huán)境因素的穩(wěn)定性，避免其失穩(wěn)分解并釋放出被包埋的益生菌；第二，復(fù)合材料的雙重消化優(yōu)勢得以發(fā)揮，例如，蛋白質(zhì)在消化過程中起到緩沖作用，阻隔了酶對益生菌的損害，而多糖為益生菌提供了物理屏障，保護(hù)它們免受酸和膽汁的侵害[12]，且蛋白酶對蛋白質(zhì)的水解位點(diǎn)可因蛋白質(zhì)-多糖相互作用而大量降低[13]，保證了益生菌能抵抗胃腸消化環(huán)境；第三，復(fù)合運(yùn)載體系可被設(shè)計(jì)成在胃和小腸的強(qiáng)酸性或弱酸性條件下釋放受到抑制、在結(jié)腸的弱堿性條件下釋放受到促進(jìn)的pH 敏感性運(yùn)載體系，或通過結(jié)腸內(nèi)微生物分泌出的酶（還原酶、糖苷酶等）使其降解[14]，從而實(shí)現(xiàn)在結(jié)腸中控制和持續(xù)釋放益生菌的目的。本文主要對蛋白質(zhì)-多糖基活性益生菌遞送體系的形成機(jī)制、常見多尺度結(jié)構(gòu)及在食品中的最新研究應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行論述。

1 蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合體系的形成機(jī)制

蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合體系的構(gòu)建是基于這兩種生物聚合物的相互作用形成的。不同來源的蛋白質(zhì)和多糖可以通過靜電相互作用、疏水作用、氫鍵、范德華力等物理方式形成非共價(jià)結(jié)合，也可以通過美拉德反應(yīng)、酶促交聯(lián)、化學(xué)交聯(lián)等化學(xué)方式形成共價(jià)結(jié)合（圖2）[15]。

圖2 蛋白質(zhì)-多糖相互作用示意圖[15]Fig.2 Schematical illustration of protein-polysaccharide interaction[15]

1.1 非共價(jià)結(jié)合

由于蛋白質(zhì)和帶負(fù)電荷的多糖溶液主要以帶電形式存在，蛋白-多糖非共價(jià)的結(jié)合作用主要由靜電相互作用引起[11-16]：a. 反應(yīng)體系pH 小于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，帶正電的蛋白質(zhì)分子會與帶負(fù)電的多糖分子發(fā)生強(qiáng)烈的靜電吸附作用，從而產(chǎn)生強(qiáng)靜電復(fù)合物并形成均相；但隨著體系自由能的降低，靜電復(fù)合物可進(jìn)一步聚集，導(dǎo)致出現(xiàn)相分離、凝聚、或沉淀；b. 當(dāng)反應(yīng)體系pH 大于等電點(diǎn)時(shí)，帶負(fù)電的蛋白質(zhì)分子會與帶負(fù)電的多糖分子發(fā)生弱相互作用，產(chǎn)生弱可逆復(fù)合物，導(dǎo)致形成兩相溶液，或在足夠低的濃度下，蛋白質(zhì)和多糖以單個(gè)分子存在形成單相溶液，最終表現(xiàn)為共溶狀態(tài)（圖2）。其他非共價(jià)相互作用，包括氫鍵、范德華力、疏水相互作用等物理方式，在一定條件下有助于蛋白質(zhì)與多糖形成更強(qiáng)的絡(luò)合[17]：比如當(dāng)反應(yīng)體系pH 大于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)和多糖具有相似的電荷，可能會發(fā)生氫鍵結(jié)合；而范德華力可能發(fā)生在相近粒子彼此適當(dāng)靠近，出現(xiàn)引力增大；加熱可以使蛋白質(zhì)和多糖的構(gòu)象發(fā)生改變，疏水結(jié)構(gòu)暴露并接觸形成相互作用[18]。

1.2 共價(jià)結(jié)合

美拉德反應(yīng)是制備蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)結(jié)合物的常用化學(xué)反應(yīng)[19]，是蛋白質(zhì)分子中氨基酸側(cè)鏈的氨基與多糖還原性末端的羰基之間縮合形成Schiff 堿化合物、共價(jià)鍵交聯(lián)的過程[20]（圖2）。該反應(yīng)能實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)和帶中性電荷多糖（比如葡聚糖和淀粉）的共價(jià)交聯(lián)[21-22]。相對于單一天然生物聚合物和蛋白質(zhì)-多糖靜電復(fù)合物，通過美拉德反應(yīng)形成的蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物的多種功能性均得到提高，包括乳化性、起泡性、溶解性和熱穩(wěn)定性等[23-25]，同時(shí)蛋白質(zhì)-多糖基乳液的功能性質(zhì)也得到改善，比如形成更小的分散液滴粒徑、更大的凈ζ 電位、更好的穩(wěn)定性[26]及在較低pH 和熱處理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性[27]。但在反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等條件控制不好的情況下，美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的具有誘變性、致癌性和細(xì)胞毒性的化合物會導(dǎo)致潛在的安全問題[28]。通過控制相對溫和的反應(yīng)條件、添加抗氧化劑等方式可為形成安全、健康的美拉德反應(yīng)蛋白質(zhì)-多糖產(chǎn)物提供更好的途徑[29]。

蛋白質(zhì)-多糖酶促交聯(lián)反應(yīng)主要通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、過氧化物酶（比如辣根過氧化物酶）、多酚氧化酶（比如漆酶）等實(shí)現(xiàn)[30]。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶通過催化蛋白質(zhì)多肽鏈中的酰基供體和氨基糖上的伯氨基發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，從而將具有伯胺基的糖分子導(dǎo)入到蛋白質(zhì)分子中形成糖基化蛋白，而過氧化物酶和多酚氧化酶可以催化多糖中的阿魏酰殘基與蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基交聯(lián)[17]（圖2）。酶促交聯(lián)蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物不僅比單一天然生物聚合物具有更高的乳化性和對鹽、低pH、加熱和凍融處理等環(huán)境應(yīng)力的抵抗力[31]，而且相比美拉德反應(yīng)或靜電結(jié)合物，其制備的乳液對酸性條件具有更高的抵抗力[32]。

蛋白質(zhì)-多糖的化學(xué)交聯(lián)主要通過戊二醛、京尼平、1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亞胺（EDC）、4-（4,6-二甲氧基三嗪-2-基）-4-甲基嗎啉鹽酸鹽（DMTMM）等交聯(lián)劑形成[33]。其中植物基天然來源、無毒、易溶于水的京尼平是對蛋白質(zhì)氨基和多糖氨基進(jìn)行交聯(lián)[34]，而EDC 和DMTMM 可促進(jìn)蛋白質(zhì)氨基和多糖羧基結(jié)合形成酰胺鍵，且自身不會成為交聯(lián)物的一部分，轉(zhuǎn)化為小分子副產(chǎn)物后能通過滲析等方法去除[35]（圖2）。但經(jīng)研究表明，交聯(lián)位點(diǎn)對蛋白-多糖共價(jià)結(jié)合物的界面性能有較大影響，基于蛋白質(zhì)氨基與多糖羰基結(jié)合的美拉德交聯(lián)結(jié)合物的乳化性優(yōu)于蛋白質(zhì)氨基與多糖氨基結(jié)合的京尼平化學(xué)交聯(lián)結(jié)合物[36]。

2 用于益生菌遞送的多尺度蛋白質(zhì)-多糖基體系

蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合體系的常用制備方法主要包括自上而下和自下而上兩種策略[37-38]：自上而下策略的本質(zhì)是利用外部機(jī)械破壞力將大結(jié)構(gòu)材料的尺寸減小為小顆粒，包括研磨、噴霧/冷凍干燥、擠出、乳化（高壓均質(zhì)、高速剪切、超聲、微流控、膜乳化）等技術(shù)，適用于生產(chǎn)微米級或毫米級的蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合體系；自下而上策略主要是通過控制環(huán)境條件，比如生物聚合物的類型和濃度、pH、溫度、離子強(qiáng)度等，通過分子自組裝或自組織來實(shí)現(xiàn)較大顆粒的形成，比如包體絡(luò)合、復(fù)合凝聚、液體抗溶劑沉淀、逐層沉積、靜電紡絲或靜電噴涂等方法，可用于制造納米級或微米級的蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合體系。用于遞送益生菌的蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合體系尺度主要包括宏觀級（＞1000 μm）、微米級（1～1000 μm）和納米級（＜1 μm）（表1）。

表1 蛋白質(zhì)-多糖基活性益生菌遞送體系結(jié)構(gòu)及性能特征Table 1 Structure and property characteristics of protein-polysaccharide based viable probiotics delivery system

2.1 宏觀級

2.1.1 大粒凝膠/大粒凝膠珠 水凝膠（hydrogel）是通過pH、加熱、冷卻、鹽離子、酶促交聯(lián)、高壓、3D 打印等方式誘導(dǎo)形成、可保持大量水不溶解的生物聚合物分子三維交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)體系[18,38,54]。其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特征限制了外部環(huán)境因子（比如酶、氧氣、鹽等）與益生菌的接觸，進(jìn)而降低不良環(huán)境對益生菌的損耗。根據(jù)其粒徑大小，水凝膠又可以分為大粒凝膠（macrogels）、微凝膠（microgels）、納米凝膠（nanogels）。其中大粒凝膠已被廣泛用于包埋遞送益生菌[55]（表1）。Yan 等[56]發(fā)現(xiàn)經(jīng)模擬胃腸消化后，副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）在所有大豆分離蛋白-甜菜果膠酶促交聯(lián)大粒凝膠中的損失僅約為1 lg CFU/mL，而未被包埋的副干酪乳桿菌全部死亡，展現(xiàn)出結(jié)腸靶向遞送副干酪乳桿菌的效果；但副干酪乳桿菌的加入降低了水凝膠的硬度、提高了膨脹率并輕微擾亂了水凝膠的有序微觀結(jié)構(gòu)。

凝膠珠（hydrogel beads）是一種外觀尺寸在微米級或毫米級的球形體系[57]，根據(jù)尺寸又可分為大粒凝膠珠和微凝膠珠。凝膠珠可通過簡單的注射法制得，比如將藻朊酸鹽注入含二價(jià)陽離子（如Ca2+、Cu2+、Ba2+、Co2+）的水溶液，或?qū)傊堑谷肜渌械萚58]。而蛋白質(zhì)可通過非共價(jià)或共價(jià)作用與多糖進(jìn)一步結(jié)合，從而改善凝膠珠的總體功效[59-60]。Ni 等[61]發(fā)現(xiàn)相對于單一藻朊酸鹽凝膠珠，基于靜電和氫鍵結(jié)合的藻朊酸鹽-明膠基大粒凝膠珠對植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）的耐熱性（50 ℃ 5 min）和貯存穩(wěn)定性（4 ℃，6 d）分別提高了8%和15%，且可以提高植物乳桿菌對胃酸的抵抗力，并在小腸中因失去分子間氫鍵作用而逐漸溶解，從而達(dá)到小腸靶向釋放的目的；但植物乳桿菌的負(fù)電與藻朊酸鹽-明膠復(fù)合物形成的靜電排斥力降低了凝膠珠的強(qiáng)度和硬度（圖3）。

圖3 基于靜電和氫鍵相互作用介導(dǎo)的藻朊酸鹽-明膠凝膠珠的制備及植物乳桿菌添加和消化前后結(jié)構(gòu)變化[61]Fig.3 Production of electrostatically interacted and hydrogen bonding induced alginate-gelatin gel beads and the structure changes after the addition of Lactobacillus plantarum and gastrointestinal digestion[61]

綜上，雖然不同結(jié)構(gòu)特性的蛋白質(zhì)-多糖基大粒凝膠/大粒凝膠珠通過簡單的方法即可制得，且展現(xiàn)出優(yōu)異的益生菌包封率和對環(huán)境應(yīng)力的抵抗力，但尚存在一些實(shí)際應(yīng)用限制：一方面益生菌的添加會對其凝膠結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的破壞作用，另一方面通常需要通過冷凍干燥等方法以提高其穩(wěn)定性、延長貨架期，而益生菌在冷凍干燥過程中的存活率會下降。故更多關(guān)于蛋白質(zhì)-多糖基大粒凝膠體系穩(wěn)態(tài)化技術(shù)與材料的開發(fā)及其與益生菌活性保持的相關(guān)性仍有待進(jìn)一步研究。

2.2 微米級

常見的微米級蛋白質(zhì)-多糖基益生菌遞送體系包括微粒（microparticles）、微凝膠/微凝膠珠、微乳（microemulsions）、微膠囊（microcapsules）等[37]（表1，圖4）。除了蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合材料自身的靶向遞送特征，微粒、微乳和微膠囊殼-核結(jié)構(gòu)的物理屏障作用和微凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的限制作用（2.1）進(jìn)一步有助于實(shí)現(xiàn)益生菌的腸道定植。

2.2.1 微粒 相對于納米粒子，直徑為1～1000 μm的微粒具有足夠空間來包埋益生菌的優(yōu)勢[62]。通過調(diào)節(jié)pH、溫度等條件，蛋白質(zhì)和多糖可通過非共價(jià)或共價(jià)結(jié)合形成具有不同結(jié)構(gòu)特性的微粒。Mao 等發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)制備的大豆分離蛋白和I-卡拉膠復(fù)合物[63]比復(fù)合凝聚法制備的復(fù)合物[64]更能提高長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）對不利環(huán)境的抵抗力：經(jīng)貯存（4 ℃，30 d）、巴氏殺菌（85 ℃，30 min）和模擬胃腸消化后，前者分別損失0.4、2.05 和3.12 lg CFU/mL，而后者分別損失1.62、2.71 和4.16 lg CFU/mL。這可能是因?yàn)橐嫔谕ㄟ^復(fù)合凝聚法制備微粒的酸性條件中容易受到損耗。Ma 等[65]利用復(fù)合凝聚法和化學(xué)交聯(lián)法制備大豆蛋白-阿拉伯膠微粒能提高植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）在貯存過程（25 ℃，28 d）和模擬胃液中的存活率（分別達(dá)88%和98%以上）及模擬腸液中釋放的活菌量（4 h 后達(dá)6.52 CFU/g）。但不同共價(jià)交聯(lián)方式對蛋白質(zhì)-多糖基微粒益生菌遞送的影響及其消化特性的作用機(jī)制還需繼續(xù)深入研究。

2.2.2 微凝膠/微凝膠珠 與單一生物聚合物微凝膠相比，蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合微凝膠可形成更緊密的互穿雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而表現(xiàn)出更好的機(jī)械性能、持水能力、耐熱性[66]。通過調(diào)節(jié)混合比例、pH、離子強(qiáng)度等條件，帶相反電荷的蛋白質(zhì)和多糖可以通過靜電相互作用復(fù)合凝聚形成微凝膠/微凝膠珠。Etchepare 等[67]發(fā)現(xiàn)，相比于未包埋、藻朊酸鹽單層包埋、藻朊酸鹽-乳清濃縮蛋白-藻朊酸鹽三層包埋和藻朊酸鹽-乳清濃縮蛋白-藻朊酸鹽-乳清濃縮蛋白四層包埋（圖4），藻朊酸鹽-乳清濃縮蛋白雙層包埋的嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilu）微凝膠珠經(jīng)模擬胃腸道消化后有最高的存活率，達(dá)9.19 lg CFU/g（初始活菌量約為12 lg CFU/g）。但與大粒凝膠相似（2.1.1），微凝膠/微凝膠珠的長期穩(wěn)定性問題仍待進(jìn)一步研究。

2.2.3 微乳 蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物通常作為親水性乳化劑用于穩(wěn)定水包油（o/w）型或水包油包水（w/o/w）型微乳（圖4）[16,68-69]。微乳不僅是遞送益生菌的有效工具[70]，而且其組成成分也可能對腸道菌群產(chǎn)生積極或消極的影響[71]。Kan 等[72]采用第二種途徑制備了乳清分離蛋白-阿拉伯膠美拉德反應(yīng)共軛物穩(wěn)定的o/w 微乳，發(fā)現(xiàn)該微乳可顯著調(diào)節(jié)人體糞便中腸道菌群的組成和豐度，以及豐富碳水化合物代謝和膽汁酸生物合成的途徑。這可能歸功于美拉德偶聯(lián)物的消化率較低，使得大多數(shù)腸道菌群可發(fā)酵的碳水化合物和蛋白質(zhì)底物能進(jìn)入結(jié)腸，進(jìn)而被腸道菌群代謝、并影響宿主的健康[73]。因此，通過美拉德反應(yīng)制備的蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物具有促進(jìn)人體腸道菌群健康變化的潛力，這對設(shè)計(jì)使用蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物作為乳化劑的微乳具有重要意義。

w/o/w 雙重微乳不僅具有減脂、減糖、減鹽、共包埋親水和親油性生物活性物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)[74]，而且相比于其他微乳體系（比如o/w，油包水w/o，水包水w/w 等類型），其結(jié)構(gòu)更能有效保護(hù)益生菌[62]：不同于o/w 微乳，益生菌可以包埋在雙重微乳內(nèi)層水相中，而大多數(shù)益生菌在水中的溶解性更好；另外w/o/w雙重微乳包含一層油相和兩層水相，故雙重微乳的油相和外層水相都能保護(hù)在內(nèi)層水相包埋的益生菌（圖4）。Qin 等[75]開發(fā)了一種在酸性條件呈水凝膠狀態(tài)、在中性pH 條件呈溶液狀態(tài)的pH 響應(yīng)性w/o/w雙重微乳，能有效提高植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）經(jīng)模擬胃腸消化后的活菌數(shù)（從7.79×107CFU/mL 降至7.36×107CFU/mL，而未被包埋的益生菌從7.81×107CFU/mL 降至0.14×107CFU/mL）。雖然雙重微乳具有提高益生菌穩(wěn)定性、改善控釋效果的應(yīng)用前景，但雙重微乳的實(shí)際應(yīng)用仍存在一些問題，比如由于存在較多分散液滴及表面積，雙重微乳的長期穩(wěn)定性通常比較欠缺[76]。另外，PGPR 存在安全食用限量（ADI 25 mg/kg）、異味及消費(fèi)者對人工合成添加劑抵觸等缺點(diǎn)[77]，對雙重乳液的可食用性也存在影響，故找到替代甚至超越PGPR 乳化性的天然親油性乳化劑[78]仍是雙重微乳遞送體系急需解決的問題。

2.2.4 微膠囊 微膠囊是一種利用天然或合成的大分子聚合物作為殼/覆蓋層，包覆固體、液體或氣體等核心物質(zhì)，利用物理（噴霧干燥、冷凍干燥、擠出技術(shù)、分子微囊化技術(shù)等）或化學(xué)方法（復(fù)合凝聚、復(fù)合沉淀、原位聚合等）制成的微型膠囊或微粒。2.2.1 中介紹的僅以蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物為材料的微粒也屬于一種微膠囊，故在此介紹以乳液為基礎(chǔ)制備的蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合微膠囊。以o/w 乳液為基礎(chǔ)（圖4）是最常見制備微膠囊的方式之一[79]。若將天然或合成的固體脂質(zhì)用作o/w 乳液中的油相，再采用固化手段去除水分即可制成固體脂質(zhì)微粒（solid lipid microparticle）。Tasch Holkem 等[80]發(fā)現(xiàn)添加了5%肉桂提取物的乳球濃縮蛋白-阿拉伯膠靜電復(fù)合固體脂質(zhì)微粒具有最高的動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）包埋率（98.59%），并在7 ℃貯存120 d 后獲得最高存活率（9.3 lg CFU/g）。雖然含油微膠囊具有長期穩(wěn)定性高、不良環(huán)境抵抗力強(qiáng)等特點(diǎn)，但以o/w 乳液為基礎(chǔ)制備微膠囊的方式更適用于疏水性強(qiáng)的益生菌，而對強(qiáng)親水性益生菌的包埋難以達(dá)到理想效果[80]。而以w/o/w 乳液為基礎(chǔ)制備的w/o 微膠囊內(nèi)層水相適用于包埋大部分益生菌（圖4）[81]。但在噴霧干燥、冷凍干燥等過程中w/o/w 乳液結(jié)構(gòu)容易受到破壞、難以獲得理想的顆粒形貌[82]，進(jìn)而影響w/o 微膠囊的遞送效果。除此之外，食品工業(yè)中制備微膠囊也通常采用傳統(tǒng)干燥方法，而這些干燥脫水過程通常對益生菌有較大的損傷[83]。

2.3 納米級

近年來，納米級遞送體系的構(gòu)建與應(yīng)用前景一直是研究的熱點(diǎn)與焦點(diǎn)[37]。雖然納米顆粒（nanoparticles）、納米凝膠、納米纖維（nano-fibers）、納米乳液（nano-emulsions）、納米膠囊（nano-capsules）等納米級體系已被證實(shí)是遞送益生菌的優(yōu)勢載體[84-85]，但目前納米級益生菌遞送體系的研究開發(fā)仍面臨一定的困難與挑戰(zhàn)[62,86-87]：一方面難以找到合適的可用于制備納米顆粒的生物聚合物材料（包括蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物），另一方面益生菌的尺寸普遍較大（通常在1～10 μm）且形狀各異，常難以較好地匹配納米級遞送體系。下面主要介紹可用蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物制備的納米纖維、納米顆粒和納米乳液。

2.3.1 納米纖維 利用電流體動力學(xué)加工技術(shù)（包括靜電紡絲和靜電噴涂），在高壓靜電場下將表面帶電的生物聚合物溶液通過噴嘴噴出即可形成負(fù)載生物活性物質(zhì)的納米纖維[88]。其中制備納米 纖維的聚合物材料溶液是最關(guān)鍵的因素之一。蛋白質(zhì)因其靜電、疏水和親水本質(zhì)可用作疏水 袋保護(hù)益生菌免受不利環(huán)境的影響[89]，但溶解在水中的蛋白質(zhì)因其α-螺旋、β-片二級結(jié)構(gòu)、 三級結(jié)構(gòu)和球狀結(jié)構(gòu)等三維結(jié)構(gòu)在電場作用下難以拉伸和纏繞[90]。多糖的加入可以改善蛋 白質(zhì)在電流體動力學(xué)加工技術(shù)中的應(yīng)用限制，包括具有潛在益生元特性[91]的普魯蘭多糖[92]、藻朊酸鹽[93]等。Akkurt 等[94]發(fā)現(xiàn)在靜電紡絲加工后，酪蛋白酸鈣-普魯蘭多糖納米纖維和酪 蛋白酸鈉-普魯蘭多糖納米纖維中鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）活菌數(shù)分別達(dá)9.5 和9.6 lg CFU/mL（分別負(fù)載9.3 和9 lg CFU/mL）；經(jīng)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌分布 在納米纖維內(nèi)（圖5）。但更多適應(yīng)于電流體動力學(xué)加工技術(shù)的蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合材料及其在 益生菌靶向遞送的實(shí)際應(yīng)用還有待進(jìn)一步探索。

圖5 鼠李糖乳桿菌電紡纖維墊掃描電鏡圖[94]Fig.5 Scanning electron microscopy images of electrospun Lactobacillus rhamnosus GG （LGG） incorporated in fibrous mats[94]

2.3.2 納米顆粒 利用蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合材料制備益生菌包封納米顆粒的途徑主要有兩種：第一種是用抗溶劑共沉淀法[95]、納米沉淀法[96]等方式制備天然生物聚合物納米顆粒，但由于起步較晚，蛋白質(zhì)-多糖基納米顆粒包封益生菌的研究報(bào)道較少[85]；第二種是以磷脂或膽固醇制備包封益生菌的脂質(zhì)納米顆粒，再將蛋白質(zhì)和多糖進(jìn)一步吸附在脂質(zhì)納米顆粒表面。Hosseini 等[97]發(fā)現(xiàn)經(jīng)模擬胃液和腸液消化后，明膠-殼聚糖-卵磷脂基脂質(zhì)納米顆粒中的鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）分別損失了1.2 和1.6 lg CFU/mL，而卵磷脂基脂質(zhì)納米顆粒分別損失了1.7 和3.28 lg CFU/mL，未被包埋的益生菌分別損失了4.5 和5.5 lg CFU/mL。故利用蛋白質(zhì)和多糖復(fù)合材料制備納米顆粒對于提高益生菌結(jié)腸靶向遞送具有重要意義。

2.3.3 納米乳液 納米乳液是一種熱力學(xué)穩(wěn)定、能有效包埋生物活性物質(zhì)并提高其生物利用率的遞送體系，通常在粒徑50～200 nm 時(shí)呈現(xiàn)透明，在粒徑大于500 nm 時(shí)呈現(xiàn)乳白色外觀[98-99]。納米乳液可以更容易地穿過細(xì)胞壁、進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞，具有較強(qiáng)的腸黏膜黏附能力和與其他代謝因子相互作用的能力，且納米乳液液滴可以保護(hù)被包埋益生菌免受不良環(huán)境的影響，提高益生菌活性[86]。Vaishanavi 等[100]發(fā)現(xiàn)在27 ℃貯存40 d 后，大豆分離蛋白-阿拉伯膠基o/w納米乳液中的德爾布魯氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus）活菌數(shù)達(dá)9.8×107CFU/mL和8.8×108CFU/mL（初始活菌數(shù)分別為5.4×107CFU/mL 和4.3×108CFU/mL）。

3 蛋白質(zhì)-多糖基益生菌遞送體系在食品中的應(yīng)用

3.1 酸奶

酸奶是益生菌的理想載體。酸奶為益生菌的生存提供了良好的介質(zhì)，且口感好，營養(yǎng)價(jià)值高，可以常規(guī)地納入日常飲食中。然而，在酸奶的儲存、運(yùn)輸和配送過程中，益生菌仍能在較低環(huán)境溫度下利用殘留的乳糖緩慢發(fā)酵、產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致酸奶酸度繼續(xù)上升，并對其感官屬性產(chǎn)生不利影響[8]。此外，如果酸奶在儲存過程中pH 下降過多，益生菌的活性也會降低。益生菌酸奶在儲存期間的過度酸化問題可以通過不同尺度結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)-多糖基益生菌遞送體系得以改善，比如微凝膠珠[101]和微膠囊[102]均能降低酸奶的過酸化程度，且能提高益生菌在貯存過程中的存活率，并改善酸奶品質(zhì)；w/o/w 雙重乳液具有分離發(fā)酵益生菌的作用，以避免對發(fā)酵過程干擾，同時(shí)不會對酸奶的理化性質(zhì)產(chǎn)生影響，并提高益生菌經(jīng)貯存和胃腸消化后的存活率[103]。

3.2 奶酪

因其具有相對較高的pH、脂肪含量、固體稠度和高緩沖能力，奶酪亦被認(rèn)為是一種優(yōu)秀的益生菌輸送工具[104]。另外，益生菌也可以在奶酪成熟過程中產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、乳糖酶、胞外多糖和/或抗菌物質(zhì)，幫助產(chǎn)品質(zhì)量屬性、安全性和保質(zhì)期的提高。但奶酪加工環(huán)境、長期貯存及食用消化過程都會極大影響益生菌的活菌量，而通過蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合材料進(jìn)行包埋，并在奶酪中應(yīng)用能提高益生菌在不良環(huán)境中的生存能力。例如，水凝膠能提高益生菌在奶酪貯存過程中的穩(wěn)定性，還能限制蛋白質(zhì)水解和可滴定酸度變化[105]；微粒能提高益生菌在奶酪貯存和模擬胃腸消化環(huán)境中的存活率[106]；微膠囊能提高益生菌在低pH、高鹽離子濃度等奶酪加工環(huán)境因素和數(shù)月貯存過程中的存活率[79]。

3.3 飲料

因?yàn)榱钊藵M意的風(fēng)味和營養(yǎng)特性，眾多乳、茶、果蔬、植物蛋白等飲料都是提供益生菌的理想食品。此外，飲料中的許多營養(yǎng)物質(zhì)均對益生菌生長起著積極作用，包括維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維和抗氧化劑等[107]。利用蛋白質(zhì)-多糖基體系包埋益生菌能改善益生菌在殺菌、干燥等飲料加工工藝、數(shù)周或數(shù)月的貯存及食用消化過程中大量失活的問題，但蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合材料的篩選及益生菌遞送體系尺度結(jié)構(gòu)的構(gòu)建十分關(guān)鍵，不僅決定了益生菌是否能實(shí)現(xiàn)結(jié)腸靶向傳遞，而且決定了益生菌是否發(fā)酵并對飲料的品質(zhì)性能產(chǎn)生影響[108]：相對于多糖基水凝膠[109]，蛋白質(zhì)-多糖基水凝膠不僅能進(jìn)一步提高益生菌在發(fā)酵、貯存及胃腸消化后的存活率[47,61]，而且因蛋白質(zhì)載體具有較高的孔隙率，益生菌可從蛋白質(zhì)-多糖基水凝膠中持續(xù)釋放到飲料主體中并繁殖增長，進(jìn)而產(chǎn)生更高的益生菌代謝活性而獲得更高滴定酸度的飲料，同時(shí)因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的緩沖作用，加入蛋白質(zhì)-多糖基水凝膠的飲料pH 更高[110]；蛋白質(zhì)-多糖基微粒可以分離益生菌以避免后酸化過程，進(jìn)而避免對飲料pH、可滴定酸度和還原糖含量等性能的影響[111]；在蛋白質(zhì)-多糖基微膠囊中，由于噴霧干燥過程中蛋白質(zhì)變性而導(dǎo)致微膠囊孔隙度和表面活性變化，飲料中營養(yǎng)物質(zhì)在微膠囊中擴(kuò)散減慢，進(jìn)而減緩了益生菌的生長及飲料pH 的降低，同時(shí)能提高飲料在貯存和模擬胃腸消化后的存活率[112]。

除以上食品外，蛋白質(zhì)-多糖基益生菌遞送體系還能在肉制品[113]、可食用膜[114]等領(lǐng)域中應(yīng)用，并在益生菌活性保持和產(chǎn)品品質(zhì)改善等方面發(fā)揮了重要作用。

4 結(jié)論

綜上所述，利用蛋白質(zhì)和多糖之間的非共價(jià)或共價(jià)作用可以組裝形成多尺度結(jié)構(gòu)的蛋白-多糖基遞送體系，其中水凝膠、微粒、納米顆粒等體系均已展現(xiàn)出優(yōu)異的靶向傳輸功效。但目前不同尺度結(jié)構(gòu)的遞送體系仍存在不同的缺陷，比如水凝膠的長期穩(wěn)定性差、貨架期短，益生菌在o/w 型微乳的油相里溶解性差，w/o/w 型雙重微乳長期穩(wěn)定性和親油性乳化劑方面仍存在待改善的問題，微膠囊利用傳統(tǒng)干燥方法制備的過程中對益生菌有很大的損耗，納米纖維、納米顆粒、納米乳液等體系的材料開發(fā)和在食品中的實(shí)際應(yīng)用還有待繼續(xù)深入探究。蛋白質(zhì)-多糖基益生菌遞送體系已在酸奶、奶酪、飲料等食品中展現(xiàn)出優(yōu)異的功能性，其尺度結(jié)構(gòu)決定了益生菌的靶向傳遞效果及發(fā)酵程度對產(chǎn)品品質(zhì)的影響。未來，蛋白質(zhì)-多糖基益生菌遞送系統(tǒng)的研究工作可在如下方面進(jìn)一步探索：a. 結(jié)合納米纖維、納米顆粒、納米乳液等納米體系的結(jié)構(gòu)特征，開發(fā)高效傳輸益生菌的納米級遞送體系；b. 開展益生菌與其他生物活性物質(zhì)共包埋的蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合遞送體系的構(gòu)建機(jī)制及性能研究，開發(fā)多功能的新型食品；c. 利用蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合體系的天然性、生物相容性、生物可降解性、食用安全性及特有的營養(yǎng)和功能特性等優(yōu)點(diǎn)，設(shè)計(jì)含活性益生菌的食品包裝材料和低脂食物、肉類替代物等對人體健康的新型食品。