卵巢子宮內(nèi)膜異位癥惡變AXIN和β-catenin表達(dá)及意義

宋冰冰 趙飛 王黎明

［摘要］ 目的 探討軸蛋白（AXIN）與β－連環(huán)蛋白（β－catenin）在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥（OE）惡變過程中的表達(dá)及臨床意義。

方法 采用定量酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）及免疫組化方法，檢測30例OE組織、17例非典型子宮內(nèi)膜異位癥（aEM）組織及30例子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)性卵巢癌（EAOC）組織中AXIN與β－catenin的表達(dá)情況，并分析β－catenin及AXIN與EAOC病人的年齡、FIGO分期、病理組織類型、腫瘤側(cè)別等臨床特征的關(guān)系。

結(jié)果 免疫組化檢測顯示，AXIN在OE組、aEM組、EAOC組的陽性表達(dá)率分別為76.7%（23/30）、41.2%（7/17）、30.0%（9/30），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.852，P<0.05）；β－catenin在OE組、aEM組、EAOC組的陽性表達(dá)率分別為13.3%（4/30）、29.4%（5/17）、63.3%（19/30），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=16.661，P<0.05）。ELISA檢測顯示，AXIN在OE組、aEM組、EAOC組的表達(dá)水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1 986.939，P<0.001）；β－catenin在OE組、aEM組、EAOC組的表達(dá)水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7 361.889，P<0.001）。EAOC病變組織中AXIN與β－catenin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=－0.86，P<0.05）；AXIN及β－catenin的表達(dá)與腫瘤FIGO分期、組織學(xué)分級有顯著相關(guān)性（P=0.000～0.013）。

結(jié)論 AXIN低表達(dá)與β－catenin高表達(dá)可能參與了OE的惡變過程，且可能促進(jìn)了EAOC的浸潤轉(zhuǎn)移。

［關(guān)鍵詞］ β－連環(huán)蛋白；軸蛋白質(zhì)；卵巢疾??；子宮內(nèi)膜異位癥；卵巢腫瘤

［中圖分類號］ R588.6;R737.31

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號］ 2096－5532（2023）02－0282－05

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.044

［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）］

科惡性腫瘤死亡率的首位，嚴(yán)重威脅著全球女性的健康。因此，探索卵巢癌可能的發(fā)病機(jī)制并探求其有效的臨床治療方法尤為重要。目前，卵巢子宮內(nèi)膜異位癥（OE）發(fā)生惡變的機(jī)制尚不明確，可能與某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路因子的異常表達(dá)有關(guān)。軸蛋白（AXIN）與β－連環(huán)蛋白（β－catenin）分別為Wnt經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的抑癌因子與致癌因子，二者在胃癌、肺癌、肝癌等多種人體癌癥的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中起重要作用，但二者在OE惡變過程中的作用尚不清楚。本研究檢測AXIN、β－catenin在OE、卵巢非典型子宮內(nèi)膜異位癥（aEM）和子宮內(nèi)膜異位癥（EM）相關(guān)性卵巢癌（EAOC）組織的表達(dá)情況，旨在探討二者在OE惡變過程中發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本及其來源

收集2014年4月1日—2017年4月1日青島大學(xué)附屬醫(yī)院診治的EAOC病人的術(shù)后標(biāo)本共30例，其中22例為卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌、8例為卵巢透明細(xì)胞癌，病人年齡為30～68歲，平均（50.53±7.78）歲；aEM病人術(shù)后組織17例，病人年齡30～54歲，平均（47.06±6.52）歲；OE病人術(shù)后組織30例，病人年齡為30～62歲，平均（48.03±7.29）歲。所有病人術(shù)前均未接受化療、激素類藥物治療、放療、中醫(yī)治療，所有組織標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確診。新鮮標(biāo)本獲取后，一部分立刻應(yīng)用40 g/L甲醛固定24 h，濃度梯度乙醇脫水后行完整石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度為4 μm）；另一部分組織用已預(yù)冷的1×PBS溶液充分沖洗，去除其中殘留血液，稱質(zhì)量后剪碎，放入燒杯中，加入含蛋白酶抑制劑的PBS溶液（體積比1∶9），充分混勻，在冰上充分研磨，應(yīng)用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)一步處理。將得到的勻漿以7 254 r/mim離心10 min后，用無菌EP管分裝，放置－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器

兔抗人AXIN多克隆抗體、兔抗人β－catenin多克隆抗體均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，根據(jù)使用說明配制試劑，抗體稀釋度為1∶100；DAB顯色試劑盒、PBS緩沖液等均購于北京中杉金橋生物有限公司；人AXIN酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定試劑盒、人β－catenin ELISA測定試劑盒均購于上海茁彩生物科技有限公司；離心機(jī)（北京白洋器械有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國 BIO－RAD公司產(chǎn)品）；包埋機(jī)（德國 Leica EG1150H）；電子天平（上海良平儀器儀表有限公司，F(xiàn)A1004）等。

1.3 AXIN、β－catenin蛋白表達(dá)檢測

采用免疫組化方法檢測AXIN和β－catenin蛋白的表達(dá)，按照常規(guī)實驗流程進(jìn)行操作，抗體嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行稀釋。陰性對照采用PBS替代一抗，陽性對照采用已知食管癌陽性標(biāo)本。采用ELISA方法檢測樣本組織中AXIN、β－catenin的濃度，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀檢測標(biāo)本光密度（OD）值，按照所配置的標(biāo)準(zhǔn)品濃度以及所測得的標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算AXIN、β－catenin的濃度。

1.4 免疫組化結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

AXIN蛋白陽性主要定位在細(xì)胞核和（或）細(xì)胞膜，陽性表達(dá)為出現(xiàn)褐黃色染色顆粒；β－catenin蛋白陽性主要定位在細(xì)胞漿和（或）細(xì)胞核，陽性表達(dá)為出現(xiàn)褐黃色染色。按照SHIMIZU等的方法，綜合所選視野中陽性細(xì)胞百分比以及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度確定樣本蛋白的表達(dá)水平。①染色強(qiáng)度評分：無（或不清楚）染色為0分，染色淡黃褐色為1分，染色棕黃色為2分，染色深褐色為3分。②陽性細(xì)胞百分比評分：陽性細(xì)胞數(shù)<10%為0分，陽性細(xì)胞數(shù)10%～25%為1分，陽性細(xì)胞數(shù)26%～50%為2分，陽性細(xì)胞數(shù)＞50%為3分。根據(jù)染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比得分乘積判定結(jié)果：0～1分為陰性（－），≥2分為陽性（+）。所有樣本的染色結(jié)果均由兩名經(jīng)驗豐富的病理科主任醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行診斷。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料先用Shapiro－Wilk檢驗進(jìn)行正態(tài)性分布分析，符合正態(tài)分布計量資料用±s表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法，α（α/3）<0.016 7表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。多組計數(shù)資料比較采用R×C表卡方檢驗，兩個獨(dú)立樣本比較采用Pearson卡方、連續(xù)性校正卡方或Fisher檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)或Spearman相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中AXIN、β－catenin表達(dá)比較

免疫組化檢測結(jié)果顯示，AXIN表達(dá)于細(xì)胞核和（或）細(xì)胞膜，且所有檢測樣本組織中均有不同程度的表達(dá)（圖1），AXIN在OE組、aEM組、EAOC組中的陽性表達(dá)率逐漸下降，除aEM組與EAOC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，余各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.852，P<0.05）；β－catenin表達(dá)于細(xì)胞核和（或）細(xì)胞漿，且在所有檢測樣本組織中均有不同程度的表達(dá)（圖2），β－catenin在OE組、aEM組、EAOC組中的陽性表達(dá)率呈逐漸升高的趨勢，除aEM組與OE組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余各組間比較差異均有顯著意義（χ2=16.661，P<0.05）。見表1。

2.2 各組AXIN、β－catenin濃度比較

各組AXIN、β－catenin濃度差異有顯著性（F=1 986.939、7 361.889，P<0.01），OE組、aEM組、EAOC組AXIN的濃度逐漸降低，各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.016 7）； OE組、aEM組、EAOC組中β－catenin濃度依次升高，各組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.016 7）。見表2。

2.3 AXIN、β－catenin表達(dá)與EAOC臨床病理特征的關(guān)系

EAOC組織中AXIN、β－catenin的表達(dá)與病人年齡、腫瘤側(cè)別及組織學(xué)類型無明顯相關(guān)性（P>0.05），但與臨床FIGO分期和組織學(xué)分級有顯著相關(guān)性（P=0.000～0.013）。見表3。

2.4 EAOC組織AXIN與β－catenin表達(dá)的相關(guān)性

EAOC組織AXIN與β－catenin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=－0.86，P<0.05）。見表4。

3 討論

EM為臨床最常見的婦科良性疾病之一，育齡期女性中其發(fā)病率可達(dá)10%～15%，全世界范圍內(nèi)約有1.76億婦女受到影響，其臨床特點(diǎn)包括不孕、盆腔疼痛、多次手術(shù)以及對病人社會心理健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面效應(yīng)。EAOC病人的發(fā)病年齡較低，臨床分期較早，預(yù)后好，早發(fā)現(xiàn)、早治療尤為重要。

EM惡變率為0.7%～1.0%，其中80%發(fā)生于卵巢，為卵巢癌已知的高危因素之一。

早在1952年就有研究論述了EM與卵巢癌之間的關(guān)系，提出并制定了EAOC的診斷標(biāo)準(zhǔn)；隨后，有研究于1953年對其診斷標(biāo)準(zhǔn)給予了進(jìn)一步補(bǔ)充，并一直沿用至今。OE的存在使卵巢癌發(fā)生的風(fēng)險增加了4倍。目前，部分國外學(xué)者認(rèn)為，組織病理學(xué)上的“aEM”是EM惡變的中間過渡階段，也是EM惡變的關(guān)鍵性證據(jù)之一。本研究通過對OE惡變過程中Wnt信號通路中相關(guān)生物因子變化的分析，為OE惡變的早期診治提供依據(jù)。

Wnt家族是一個與諸多細(xì)胞功能相關(guān)的蛋白家族，參與調(diào)控器官形成、干細(xì)胞自我更新、細(xì)胞增殖和凋亡等生物過程。目前研究表明，Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在人類機(jī)體發(fā)育過程中起重要作用，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化以及黏附等過程，Wnt/β－catenin經(jīng)典信號通路具有促進(jìn)卵巢上皮癌發(fā)展的作用。該途徑也可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞抵抗治療藥物，并可能參與腫瘤組織的血管生成和免疫抑制。Wnt/β－catenin信號通路失調(diào)可能導(dǎo)致腫瘤的形成及腫瘤的復(fù)發(fā)。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路的相關(guān)因子參與了OE的發(fā)生。但該通路是否參與OE的惡變過程尚不清楚。通過檢測Wnt信號通路的關(guān)鍵因子在OE惡變過程中的表達(dá)，進(jìn)而了解該通路是否參與OE惡變的發(fā)生，并在臨床上結(jié)合OE病理切片圖像中aEM病變組織的出現(xiàn)，可以為EAOC的早期診治提供新思路。

β－catenin是經(jīng)典Wnt通路的重要遞質(zhì)，它能夠有效促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移、侵襲及增殖等，并能夠明顯阻斷癌細(xì)胞的凋亡。在缺乏Wnt配體的情況下，β－catenin可以被酪蛋白激酶1（CK1）、AXIN、糖原合成酶激酶3β（GSK3β）等組成的復(fù)合物所降解。

NGUYEN等研究發(fā)現(xiàn)，16%～54%的OE病人發(fā)生了β－catenin蛋白基因CTNNB1突變，進(jìn)而導(dǎo)致β－catenin表達(dá)上調(diào)。而GOLDSBERRY等對DC小鼠生物模型的研究結(jié)果也顯示，因體內(nèi)缺乏β－catenin，小鼠卵巢腫瘤的生長速度較慢。

本研究發(fā)現(xiàn)，β－catenin在OE惡變過程中的表達(dá)明顯增加，其濃度在OE組、aEM組、EAOC組依次升高。說明Wnt信號通路可能參與了OE惡變的過程，提示β－catenin可能為OE惡變潛在的生物指標(biāo)之一。本研究對EAOC病人相關(guān)臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，β－catenin蛋白高表達(dá)與病人的FIGO分期、組織學(xué)分級顯著相關(guān)，β－catenin高表達(dá)促進(jìn)了EAOC的侵襲與轉(zhuǎn)移。因此，未來在EAOC的臨床診治過程中，可對β－catenin高表達(dá)者予以更為積極的手術(shù)及化療方案。

AXIN是一種支架蛋白，它與多種蛋白質(zhì)（包括GSK3β、CK1等）具有相互作用的位點(diǎn)。AXIN在Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中對β－cantenin的降解起到至關(guān)重要的作用。既往研究顯示，AXIN2基因沉默可通過調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)凋亡信號通路從而減少細(xì)胞的凋亡，并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中Wnt/β－catenin信號通路的分子來增強(qiáng)細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示，AXIN在OE惡變過程中的表達(dá)呈明顯降低的趨勢，提示W(wǎng)nt信號通路可能參與了OE惡變的發(fā)生，并且與aEM發(fā)展為EAOC的過程有關(guān)，AXIN可作為監(jiān)測OE惡變的潛在的參考指標(biāo)。本文研究結(jié)果還顯示，AXIN表達(dá)與EAOC病人的FIGO分期、組織學(xué)分級顯著相關(guān)；EAOC組織中β－catenin、AXIN表達(dá)高度負(fù)相關(guān)，提示β－catenin、AXIN可能在EAOC的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起互相拮抗的作用。

近年來，隨著對Wnt信號通路研究的深入，國內(nèi)外學(xué)者也在其他惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了AXIN與β－catenin的異常表達(dá)。YU等研究顯示，乳癌細(xì)胞中AXIN2低水平表達(dá)導(dǎo)致Wnt/β－catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常，從而致乳癌的發(fā)生。YAMAMOTO等通過對174例直腸癌根治術(shù)后病人研究顯示，在Wnt信號通路中，AXIN可通過將β－catenin磷酸

化而下調(diào)其表達(dá)水平，抑制Wnt信號通路的激活，從而降低結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。梁仁杰等研究表明，胃癌中AXIN可與突變型p53相互作用，降低β－catenin的表達(dá)，從而協(xié)同發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致。

綜上所述，在OE、aEM、EAOC組織中β－catenin陽性表達(dá)率依次升高，而AXIN陽性表達(dá)率依次下降，提示W(wǎng)nt信號通路可能參與了OE惡變的過程，且AXIN與β－catenin可能為OE癌變過程的重要因子，發(fā)揮著關(guān)鍵性的生物學(xué)作用。AXIN和β－catenin可能成為OE惡變早期診斷的潛在生物學(xué)指標(biāo)，在臨床上結(jié)合病理組織學(xué)檢測結(jié)果，可以為EAOC病人的早期診療提供指導(dǎo)。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）