清肺口服液黃酮類組分對呼吸道合胞病毒感染小鼠IFN-α/JAK1/STAT1信號通路的影響

趙佩佩，孫亞磊，張廈，袁斌

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是一種單鏈負(fù)極性包膜RNA病毒，屬副黏液病毒科[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，RSV是世界范圍內(nèi)引起兒童下呼吸道感染的常見病原體，其利用宿主免疫并引起強烈的炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致肺損傷和病毒傳播[2-3]。RSV肺炎可見于出生后任何階段，1～6個月嬰兒可見較重病例，是世界范圍內(nèi)3歲以內(nèi)兒童發(fā)病和死亡的主要原因[4]。研究表明，病毒感染宿主后，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生多種抗病毒反應(yīng)，包括固有免疫和適應(yīng)性免疫等，激發(fā)先天性免疫細(xì)胞（主要是吞噬細(xì)胞）內(nèi)的模式識別受體識別病毒的模式病原，開始一系列復(fù)雜的信號級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素（IFN）表達(dá)，進(jìn)一步激活下游JAK/STAT 信號通路及干擾素激活反應(yīng)元件（ISRE），誘導(dǎo)干擾素刺激基因（ISGs）轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗病毒作用[5-6]。

清肺口服液是全國名中醫(yī)汪受傳教授結(jié)合RSV證候特點，在麻杏石甘湯基礎(chǔ)上加前胡、桑白皮、葶藶子、虎杖等組方而成，具有開肺化痰、解毒活血功效，是南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，清肺口服液中占比最大的黃酮類成分可能通過調(diào)控Ⅰ型IFN信號通路發(fā)揮抗RSV作用，并通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定出26個化合物，經(jīng)過定量分析得到能激活Ⅰ型IFN信號通路的黃酮類組分[7]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，清肺口服液中黃酮類成分通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT 和NF-κB 信號通路蛋白表達(dá)，抑制RIP1/RIP3/MLKL/PGAM5/DRP1 介導(dǎo)的壞死性凋亡和TLR4/MyD88/p38 MAPK 信號通路，從而抑制炎癥因子釋放，減輕RSV 導(dǎo)致的肺部炎癥和上皮屏障損傷[8-11]。同時，RSV感染可抑制宿主細(xì)胞IFN基因轉(zhuǎn)錄，干擾機體正常的抗病毒免疫反應(yīng)，清肺口服液中黃酮類成分可上調(diào)抗病毒蛋白表達(dá)，改善RSV 導(dǎo)致的代謝紊亂[8]?；诖?，本實驗進(jìn)一步以前期篩選出的可激活Ⅰ型IFN信號通路的黃酮類組分為研究對象，觀察其對RSV感染小鼠IFN-α介導(dǎo)的JAK1/STAT1信號通路的影響，探討其發(fā)揮抗RSV作用的機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雌性BALB/c小鼠36只，4～6周齡，體質(zhì)量16～18 g，上海杰思捷實驗動物有限公司提供，動物合格證號20180004054465，生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2018-0004。飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對濕度40%～70%、晝夜交替照明環(huán)境。本實驗經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審批。

1.2 RSV病毒

RSV Long株，儲存于江蘇省兒童呼吸疾?。ㄖ嗅t(yī)藥）重點實驗室，利用人喉癌上皮細(xì)胞復(fù)蘇，擴增，收集，并檢測其毒力，備用。

1.3 藥物及制備

清肺口服液黃酮類組分包括：牡荊素（貨號ST00340120，純度≥98.0%）、槲皮素（貨號ST00230120，純度≥98.0%）、山柰酚（貨號ST00450120，純度≥98.0%）、芫花素（貨號ST04150120，純度≥98.0%）、芹菜素（貨號ST00410120，純度≥98.0%），上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)品公司；異鼠李素（貨號BCY000856，≥98.0%），江西佰草源生物科技公司。按照前期定量結(jié)果[7]組合，按牡荊素∶異鼠李素∶槲皮素∶山柰酚∶芫花素∶芹菜素=1∶1.16∶1.18∶2.24∶1.43∶3.76比例稱取各對照品，用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成濃度分別為0.3%、0.6%、1.2%混懸液，超聲震蕩使其充分溶解，備用。利巴韋林顆粒，50 mg/袋，批號1023508，四川百利藥業(yè)公司。

1.4 試劑與儀器

兔抗小鼠Janus 酪氨酸蛋白激酶1（JAK1）抗體（美國CST，批號3344S），兔抗小鼠信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）抗體（美國CST，批號14994S），兔抗GAPDH抗體（美國CST，批號2118S），山羊抗兔多克隆二抗（美國CST，批號7074P2），BCA蛋白定量試劑盒（上海西唐，批號WB101-96T），DEPC水（上海碧云天，批號R0021），HE染色液（武漢賽維爾，批號G1003），RIPA 裂解液（上海碧云天，批號P0013B），TRIzoI（南京迅貝，批號15596-018），SDS-PAGE 凝膠試劑盒（上海翌圣生物，批號20325ES62），IFN-α ELISA試劑盒（上海西唐，批號F10640-96T），ECL超敏顯色試劑盒（上海翌圣生物，批號36208ES76）。

ChemiDocTM蛋白印跡-多功能成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），PowerPac Basic電泳儀/濕轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司），MM400混合球磨儀（德國Retsch公司），Olympus BX51 倒置顯微鏡（日本Olympus 公司），Infinite M200 多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN 公司），BioPhotometer D30 蛋白核酸分析儀（德國Eppendorf公司），Quant Studio 7 Flex PCR System（美國Life Technologies公司）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

36只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機分為正常組、模型組、利巴韋林組和清肺口服液黃酮類組分低、中、高劑量組（黃酮組分低、中、高劑量組），每組6 只。第8～9日，除正常組外，其余組用異氟烷麻醉，經(jīng)鼻予RSV病毒液90 μL。第10～13日，給藥組分別予利巴韋林溶液（50 mg/kg）或清肺口服液黃酮類組分混懸液（30、60、120 mg/kg）灌胃，正常組和模型組灌胃等量生理鹽水。末次給藥后禁食不禁水，第14日頸椎脫臼處死小鼠，收集血清，分離肺組織，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 HE染色

取肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛溶液浸泡固定24 h，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察肺組織炎癥情況。

2.3 ELISA檢測

取小鼠血清，按試劑盒說明書對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行逐級稀釋，加樣，孵育，洗滌，顯色，終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，計算血清IFN-α含量。

2.4 RT-PCR檢測

取肺組織，加入TRIzol試劑，球磨儀研磨，取上清液，加入氯仿，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，提取總RNA。檢測總RNA 濃度并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，利用熒光定量PCR 儀檢測RSV-F、JAK1 和STAT1 mRNA 表達(dá)，以GAPDH 為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.5 Western blot檢測

稱取20 mg肺組織，加入裂解液和蛋白酶、磷酸酶抑制劑混合液，充分研磨，提取肺組織總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白變性，配膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，滴加JAK1、STAT1、GAPDH一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，加二抗常溫孵育1 h，TBST洗膜，曝光，Image J軟件檢測蛋白灰度值。

2.6 免疫組化染色

肺組織經(jīng)多聚甲醛固定后，脫水，浸蠟，石蠟包埋，切片，常規(guī)脫蠟，水化，抗原修復(fù)，清除內(nèi)源性過氧化物酶，封閉，分別加一抗、二抗孵育，辣根過氧化物酶顯色，復(fù)染，脫水封片，顯微鏡下觀察。以棕色顆粒為陽性表達(dá)，Image J 軟件計算JAK1 和STAT1陽性表達(dá)的平均光密度。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad Prism 7.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 黃酮類組分對模型小鼠肺組織病理形態(tài)的影響

正常組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔內(nèi)未見充血、水腫及炎性滲出；模型組小鼠肺組織充血明顯，伴大量炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主；利巴韋林組和黃酮組分各劑量組小鼠肺組織病理損傷狀況均明顯改善。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織形態(tài)（HE染色，×200）

4.2 黃酮組分對模型小鼠血清α干擾素含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清IFN-α含量增加（P＜0.001）；與模型組比較，利巴韋林組和黃酮組分低、中劑量組小鼠血清IFN-α含量減少（P＜0.001），黃酮組分高劑量組IFN-α含量增加（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠血清IFN-α含量比較（±s，pg/mL）

表2 各組小鼠血清IFN-α含量比較（±s，pg/mL）

注：與正常組比較，###P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，***P＜0.001

IFN-α 15.66±1.03 27.26±0.76###17.39±0.60***16.87±0.79***21.01±1.30***30.36±1.31*組別正常組模型組利巴韋林組黃酮組分低劑量組黃酮組分中劑量組黃酮組分高劑量組只數(shù)666666

4.3 黃酮組分對模型小鼠肺組織呼吸道合胞病毒-F、Janus酪氨酸蛋白激酶1和信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1 mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠肺組織RSV-F、JAK1和STAT1 mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，利巴韋林組及黃酮組分各劑量組RSV-F mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05），利巴韋林組及黃酮組分低劑量組JAK1和STAT1 mRNA表達(dá)明顯降低，黃酮組分高劑量組JAK1和STAT1 mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

表3 各組小鼠肺組織RSV-F、JAK1和STAT1 mRNA表達(dá)比較（±s）

表3 各組小鼠肺組織RSV-F、JAK1和STAT1 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

STAT1 1.00±0.00 3.19±0.73##1.20±0.05**1.51±0.19*2.16±0.12 4.87±1.10**組別正常組模型組利巴韋林組黃酮組分低劑量組黃酮組分中劑量組黃酮組分高劑量組只數(shù)666666 RSV-F 0 22.3±7.68##10.15±3.77*6.36±0.91*3.45±1.13*2.70±0.44*JAK1 1.00±0.00 3.33±0.76##1.26±0.09**1.54±0.17*2.22±0.12 5.46±1.11*

4.4 黃酮組分對模型小鼠肺組織Janus酪氨酸蛋白激酶1和信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠肺組織JAK1和STAT1蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；與模型組比較，利巴韋林組和黃酮組分中劑量組JAK1和STAT1蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01，P＜0.05），黃酮組分高劑量組JAK1和STAT1蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。見圖2、表4。

圖2 各組小鼠肺組織JAK1和STAT1蛋白免疫印跡

表4 各組小鼠肺組織JAK1和STAT1蛋白表達(dá)比較（±s，相對灰度值）

表4 各組小鼠肺組織JAK1和STAT1蛋白表達(dá)比較（±s，相對灰度值）

注：與正常組比較，###P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

STAT1 0.12±0.01 0.99±0.15###0.54±0.06*0.88±0.13 0.55±0.07*1.16±0.11*組別正常組模型組利巴韋林組黃酮組分低劑量組黃酮組分中劑量組黃酮組分高劑量組只數(shù)666666 JAK1 0.06±0.01 0.92±0.19###0.38±0.05**0.73±0.13 0.46±0.07**1.22±0.11*

免疫組化結(jié)果結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠肺組織JAK1和STAT1表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.001）；與模型組比較，利巴韋林組JAK1和STAT1表達(dá)明顯降低（P＜0.01），黃酮組分各劑量組JAK1和STAT1表達(dá)有上升趨勢，其中黃酮組分高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，P＜0.01）。見表5、圖3、圖4。

圖3 各組小鼠肺組織JAK1陽性表達(dá)（免疫組化染色，×200）

圖4 各組小鼠肺組織STAT1陽性表達(dá)（免疫組化染色，×200）

表5 各組小鼠肺組織JAK1和STAT1表達(dá)比較（±s，平均光密度）

表5 各組小鼠肺組織JAK1和STAT1表達(dá)比較（±s，平均光密度）

注：與正常組比較，#P＜0.05，###P＜0.001；與模型組比較，**P＜0.01，***P＜0.001

STAT1 9.00±2.65 23.67±3.22###11.33±3.22**39.33±1.53***26.67±2.08 48.00±4.58***組別正常組模型組利巴韋林組黃酮組分低劑量組黃酮組分中劑量組黃酮組分高劑量組只數(shù)666666 JAK1 16.00±1.00 25.00±2.00#18.33±2.52**26.67±2.31 28.00±3.46 37.00±2.00**

5 討論

天然免疫也稱固有免疫、非特異性免疫，是生命體在長期進(jìn)化過程中逐漸形成的免疫防御機制，是抵抗病原微生物感染的第一道防線[12-13]。黃酮類化合物存在于多種中藥中，具有廣泛的抗炎、抗病毒及調(diào)節(jié)機體免疫功能等作用[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物經(jīng)腸道梭狀芽孢桿菌代謝后的代謝產(chǎn)物脫氨基酪氨酸能與干擾素-α/β受體（IFNAR）結(jié)合，激活Ⅰ型IFN信號通路，從而激活下游JAK/STAT信號通路，誘導(dǎo)大量ISGs轉(zhuǎn)錄，增強小鼠清除病毒的能力，減輕肺部炎癥損傷，從而降低流感病毒感染的死亡率[17]。JAK/STAT信號通路作為Ⅰ型IFN信號通路的重要組成部分，一些病毒可通過抑制JAK/STAT信號通路mRNA和蛋白表達(dá)，阻礙IFN信號傳遞，抵御IFN系統(tǒng)，影響抗病毒效果[18]。研究表明，RSV可抑制JAK/STAT信號通路活性并降低IFN-β表達(dá)，從而降低宿主的天然抗病毒免疫反應(yīng)[19]。金欣口服液能通過上調(diào)Ⅰ型IFN 相關(guān)蛋白如p-STAT1、p-STAT2表達(dá)，發(fā)揮抗病毒作用[20]。Src同源磷酸酪氨酸磷酸酶2 可促進(jìn)IFN-α 誘導(dǎo)的JAK/STAT1信號通路，抑制RSV復(fù)制[21]。

課題組前期實驗研究表明，清肺口服液中黃酮類成分具有減輕RSV感染小鼠炎癥損傷和上皮屏障損傷作用?；谇捌谘芯砍晒?，本實驗建立RSV感染小鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肺組織充血明顯，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤。RSV-F是RSV復(fù)制的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)量可直接反映RSV 復(fù)制能力，模型組肺組織RSV-F mRNA高表達(dá)，提示模型建立成功；黃酮組分各劑量組和利巴韋林組小鼠肺組織炎癥損傷均有不同程度改善，RSV-F mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，表明清肺口服液黃酮類組分對RSV感染小鼠有一定的抗炎和抑制RSV復(fù)制作用。IFN-α作為機體天然免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵因子，通過與IFNAR結(jié)合，從而激活下游JAK/STAT信號通路，上調(diào)下游抗病毒蛋白和基因表達(dá)，發(fā)揮抗病毒作用。IFN-α具有多種生物活性，可調(diào)節(jié)機體免疫環(huán)境，增強淋巴細(xì)胞對病毒的殺滅作用。重組人干擾素α1b可提高RSV感染小鼠體內(nèi)JAK/STAT通路活性，發(fā)揮抗RSV效應(yīng)[22]。本實驗對血清IFN-α含量進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血清IFN-α含量明顯增加，說明RSV能激活Ⅰ型IFN通路，黃酮組分高劑量組血清IFN-α含量較模型組明顯增加，說明高劑量黃酮組分可上調(diào)RSV小鼠血清IFN-α水平，進(jìn)一步激活RSV感染小鼠Ⅰ型IFN通路，激活天然免疫系統(tǒng)。而與模型組相比，利巴韋林組及黃酮組分低、中劑量組IFN-α含量減少，說明其不能激活Ⅰ型IFN信號通路。分子實驗研究發(fā)現(xiàn)，黃酮組分高劑量組能升高IFN-α 下游JAK1 和STAT1 mRNA及蛋白表達(dá)，說明其可能通過激活I(lǐng)FN-α/JAK1/STAT1信號通路，增強小鼠天然免疫系統(tǒng)功能，發(fā)揮抗RSV作用。

綜上所述，清肺口服液黃酮類組分可以發(fā)揮抗小鼠RSV感染作用，其機制可能與上調(diào)IFN-α表達(dá)，激活JAK1/STAT1 信號通路，增強機體天然免疫功能有關(guān)。