肉制品中豬肉源成分的Proofman-梯型熔解溫度等溫擴增檢測

王博銳 許丹丹 谷蒙林 姚蔚 王耀 肖付剛 王德國

摘 要：建立一種基于Proofman探針（proofreading enzyme-mediated probe cleavage）的梯型熔解溫度等溫擴增（ladder-shape melting temperature isothermal amplification，LMTIA）方法檢測肉制品中的豬肉成分。選取豬細(xì)胞核中的特異性基因PRLR為靶基因，設(shè)計LMTIA引物和Proofman探針。通過優(yōu)化反應(yīng)體系，對所建立的方法進行特異性、靈敏度和最低檢測限結(jié)果評價。結(jié)果表明：所建立的Proofman-LMTIA方法可在30 min內(nèi)完成檢測；相對于從雞肉、鴨肉、牛肉、羊肉、貓肉、狗肉、玉米淀粉、紅薯淀粉、木薯淀粉、綠豆淀粉、小麥粉中提取的基因組DNA，可特異性檢測豬基因組DNA；檢測靈敏度為1 ng/μL，對人工模擬的混合肉樣中豬肉的最低檢測限為0.1%。所建立的Proofman-LMTIA方法對豬肉成分有較好的特異性，能夠快速、準(zhǔn)確檢測出肉制品中的豬肉成分，可對豬肉摻假進行快速檢測。

關(guān)鍵詞：Proofman探針；梯型熔解溫度等溫擴增技術(shù)；豬肉；快速檢測

Development of Proofman-Ladder-Shape Melting Temperature Isothermal Amplification Method for

Detection of Pig-Derived Components in Meat Products

WANG Borui1，2， XU Dandan1，2， GU Menglin2，3， YAO Wei1，2， WANG Yao1， XIAO Fugang2， WANG Deguo2，*

（1.College of Food and Bioengineering， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471000， China;

2.Key Laboratory of Biomarker Based Rapid-Detection Technology for Food Safety of Henan Province，

College of Food and Pharmacy， Xuchang University， Xuchang 461000， China; 3.College of Food Science and Engineering，

Henan University of Technology， Zhengzhou 450001， China）

Abstract： The study aimed to establish a proofreading enzyme-mediated probe cleavage combined with ladder-shape melting temperature isothermal amplification （Proofman-LMTIA） method for detection of pig-derived components in meat products. The LMTIA primers and Proofman probes were designed using the porcine prolactin receptor （PRLR） gene as the target. The LMTIA reaction system was optimized， and the specificity， sensitivity and limit of detection （LOD） of the proposed method were determined. The results showed that the amplification could be completed within 30 min， and the Proofman-LMTIA method could specifically detect the genomic DNA of pigs rather than of chicken， ducks， cattle， sheep， dogs， sweet potato， cassava， mung bean and wheat. The sensitivity was 1 ng/μL， and the LOD for artificially adulterated meat samples was 0.1%. The Proofman-LMTIA method has high specificity for pig-derived components， and can quickly and accurately detect pig-derived components in meat products and rapidly detect meat adulteration.

Keywords： proofreading enzyme-mediated probe cleavage; ladder-shape melting temperature isothermal amplification; pork; rapid detection

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20221215-156

中圖分類號：TS251.51? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2023）03-0028-05

引文格式：

王博銳， 許丹丹， 谷蒙林， 等. 肉制品中豬肉源成分的Proofman-梯型熔解溫度等溫擴增檢測[J]. 肉類研究， 2023， 37（3）： 28-32. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20221215-156.? ? http：//www.rlyj.net.cn

WANG Borui， XU Dandan， GU Menglin， et al. Development of proofman-ladder-shape melting temperature isothermal amplification method for detection of pig-derived components in meat products[J]. Meat Research， 2023， 37（3）： 28-32.

（in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20221215-156.? ? http：//www.rlyj.net.cn

隨著生活水平的不斷提高，人們對肉類的需求逐漸變高，部分商家為了較高的商業(yè)利潤，使用廉價的豬肉來代替昂貴的牛羊肉[1]。這種以次充好、以假亂真的現(xiàn)象損害了消費者的合法權(quán)益，擾亂了市場秩序[2]。盡管許多國家建立了肉制品的相關(guān)食品安全標(biāo)準(zhǔn)，要求肉制品標(biāo)簽需標(biāo)注物種信息類別和含量[3]，但是消費者從外觀上還是很難分辨出摻假肉。因此，為了確保市場秩序的穩(wěn)定和食品安全，需要一種簡單實用、成本低廉的快速檢測方法對肉及肉制品摻假進行檢測。

目前肉類摻假檢測方法主要分為基于蛋白質(zhì)分子和基于DNA分子的檢測技術(shù)[4]。其中基于蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)有電泳法[5-6]、質(zhì)譜技術(shù)[7-8]、酶聯(lián)免疫吸附法[9-10]

和蛋白質(zhì)組學(xué)[11]等。但蛋白質(zhì)在加工過程中易發(fā)生變性，在對熱加工處理的食品進行檢測時有很大的局限性[12]。

而基于DNA分子的實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[13-14]、數(shù)字PCR[15-16]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)[17-18]、滾環(huán)擴增技術(shù)[19-20]及重組酶聚合酶擴增技術(shù)[21-22]等檢測方法憑借特異性強、靈敏度高等優(yōu)點已成為目前肉類摻假的主要檢測方法[23]。但這些技術(shù)存在引物設(shè)計困難、易產(chǎn)生假陽性、擴增時間長、對靶序列長度要求高等缺點，導(dǎo)致這些方法不能夠得到更廣泛的應(yīng)用。因此，亟需建立一種快速、高效、操作簡單、成本較低的檢測新技術(shù)，以滿足市場的需求。

Wang Deguo等[24]在解決LAMP技術(shù)中的假陽性問題并闡明了單鏈模板的產(chǎn)生機理后，開發(fā)了一種新型核酸等溫擴增技術(shù)——梯型熔解溫度等溫擴增（ladder-shape melting temperature isothermal amplification，LMTIA）技術(shù)。該技術(shù)引物設(shè)計簡單、反應(yīng)時間迅速、靈敏度高、所需靶序列短等[25]，已應(yīng)用于食品摻假檢測[26-27]和病毒檢測[28]中。本研究以豬細(xì)胞核中的催乳素受體（prolactin receptor，PRLR）[29]基因為靶標(biāo)，將一種新型熒光雜交探針，即Proofman探針（proofreading enzyme-mediated probe cleavage）[30]與LMTIA技術(shù)相結(jié)合，其檢測原理如圖1所示。Proofman探針是根據(jù)LMTIA的環(huán)引物所設(shè)計，在Proofman探針的3端設(shè)計1 個錯配堿基，將熒光基團標(biāo)記在該錯配堿基上，猝滅基團標(biāo)記在探針的5端。反應(yīng)開始時，在引物F和B的作用下，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA；Proofman探針與莖環(huán)結(jié)構(gòu)進行互補配對，3端發(fā)生堿基錯配，在超保真DNA聚合酶的作用下切除錯配堿基，釋放熒光基團，通過收集熒光信號即可對目標(biāo)物質(zhì)進行檢測。旨在建立一種簡單、快速的Proofman-LMTIA方法檢測肉制品中的豬肉源基因，以期為市場上肉制品摻假提供一種快速、簡便的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮肉（雞肉、鴨肉、豬肉、羊肉、牛肉）、淀粉制品（玉米淀粉、紅薯淀粉、木薯淀粉、綠豆淀粉、小麥粉）及加工肉制品（熟牛肉、熟羊肉、牛肉卷、羊肉卷）購于許昌各大超市；貓肉、狗肉購于淘寶網(wǎng)。

血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；Nucleo Spin?Food試劑盒?德國Macherey-Nagel公司；通用型LMTIA反應(yīng)預(yù)混液?德歌生物技術(shù)有限公司；GPV8超保真DNA聚合酶（2 U/?L） 通用生物系統(tǒng)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Gentier 96E全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng) 西安天隆科技有限公司；Nano Drop One超微量核酸蛋白測定儀、SCI-VS可調(diào)式混勻儀 美國Thermo公司；1-15K高速冷凍離心機 德國Sigma公司；F6/10勻漿機 上海凈信科技有限公司；Archimed時間分辨熒光定量PCR系統(tǒng)?鯤鵬基因（北京）科技有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 模擬樣品的制備

將所購雞肉、鴨肉、豬肉、羊肉、牛肉、貓肉、狗肉等肉類去除表皮、脂肪和骨頭后使用勻漿機打成肉糜，于－20 ℃保存。

以牛羊肉為基質(zhì)，向其中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.1%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、100.0%的豬肉。參考Chen Xiaoyu等[31]的方法進行模擬樣品的制備：以牛肉為例，使用高速勻漿機將肉糜狀的牛肉（80 g）與豬肉（20 g）間歇性混合5 min，得到豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.0%的樣品（編號為A1）；將50 g牛肉糜與50 g A1間歇性混合5 min，得到豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.0%的樣品（編號為A2）；將50 g牛肉糜與50 g A2間歇性混合5 min，得到豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0%的樣品（編號為A3）；用上述方法依次制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%（A4）、0.1%（A5）的混合肉樣。再以同樣的方法制備以羊肉為基質(zhì)的豬肉混合肉樣。其中在進行肉糜混合時加入了不影響反應(yīng)的有色染料，混合至顏色均勻，每組實驗設(shè)置5 個平行。所有樣品保存于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA提取

稱取100 mg各樣品的肉糜及1.3.1節(jié)所制備的模擬肉樣，使用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取肉樣DNA。稱取玉米淀粉、紅薯淀粉、木薯淀粉、綠豆淀粉等樣品各200 mg，使用Nucleo Spin?Food試劑盒提取各植物淀粉DNA。提取完成后使用超微量核酸蛋白測定儀測定DNA的濃度和純度，A260 nm/A280 nm為1.6～2.0可用于LMTIA。所提取的DNA均于－20 ℃保存。

1.3.3 LMTIA引物和Proofman探針設(shè)計

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的豬源基因，本研究選取豬細(xì)胞核中的高度保守序列PRLR（GenBank ID：DQ453511.1）為靶標(biāo)，將該段序列使用Oligo 7軟件進行分析，選取具有梯型熔解溫度的片段，再使用Primer 3 Plus在線軟件（http：//www.primer3plus.com）進行LMTIA引物設(shè)計。根據(jù)環(huán)引物來設(shè)計Proofman探針，熒光基團標(biāo)記在3端錯配的堿基上，猝滅基團標(biāo)記在5端堿基末端。用于LMTIA的引物序列和Proofman探針序列見表1。引物及探針均由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。

1.3.4 反應(yīng)溫度優(yōu)化

使用10 ?L的反應(yīng)體系進行LMTIA反應(yīng)溫度的優(yōu)化，反應(yīng)體系為：1.3 μmol/L引物F、B，0.6 μmol/L引物L(fēng)F、0.3 μmol/L引物L(fēng)B和探針、1×通用型LMTIA反應(yīng)預(yù)混液1 μL（20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、10 mmol/L?KCl、10 mmol/L （NH4）2SO4、6 mmol/L MgSO4、0.1% TritonTM X-100）、0.32 U/μL Bst DNA聚合酶和2 μL提取的豬肉基因組DNA。反應(yīng)溫度設(shè)置為57、58、59、60 ℃，反應(yīng)條件為90 s采集一次熒光信號，共40 個循環(huán)。

1.3.5 靈敏度測定

將提取的豬肉基因組DNA梯度稀釋至10、1 ng/μL和100、10、1 pg/μL，測定所建立的Proofman-LMTIA檢測方法的靈敏度。由于樣品新鮮度、人為因素和DNA降解等原因都有可能造成檢測結(jié)果不一致，故每次實驗進行5 次重復(fù)，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.3.6 特異性分析

以H2O為陰性對照，豬肉基因組DNA為陽性對照，向優(yōu)化好的LMTIA反應(yīng)體系中加入從雞肉、鴨肉、牛肉、羊肉、貓肉、狗肉、玉米淀粉、紅薯淀粉、木薯淀粉、綠豆淀粉、小麥粉中提取的基因組DNA，觀察擴增結(jié)果。

1.3.7 豬肉樣品檢測限測定

將所提取的豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.1%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、100.0%的混合肉樣DNA分別加入到優(yōu)化的Proofman-LMTIA反應(yīng)體系中，每組實驗重復(fù)2 次，觀察擴增結(jié)果。

1.3.8 實際樣品豬肉源成分檢測

利用本研究建立的Proofman-LMTIA檢測方法與實時熒光定量PCR檢測方法（豬肉源實時熒光定量PCR檢測試劑盒）對市售牛羊肉及其制品進行豬肉源成分檢測，對檢測結(jié)果進行分析比較。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Gentier 96E全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)（V1）對檢測結(jié)果進行分析，獲取擴增曲線圖，再使用Excel、PowerPoint軟件對結(jié)果和擴增圖進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果

由圖2可知，反應(yīng)溫度對擴增效率的影響較大，在58 ℃和59 ℃時陰性對照不擴增，陽性對照擴增效率最好，結(jié)合后續(xù)特異性和靈敏度實驗選擇58 ℃作為Proofman-LMTIA反應(yīng)體系的最適溫度。

2.2 靈敏度測定結(jié)果

使用優(yōu)化好的反應(yīng)體系和最適溫度對梯度稀釋至10、1 ng/μL和100、10、1 pg/μL的豬肉基因組DNA進行測定。由圖3可知，10 ng/μL和1 ng/μL的DNA發(fā)生擴增，而100、10、1 pg/μL和陰性對照均未出現(xiàn)擴增。因此，該方法對豬基因組DNA的檢測靈敏度為1 ng/μL。

2.3 特異性分析結(jié)果

由圖4可知，只有豬DNA發(fā)生擴增，其余DNA及陰性對照均未擴增。說明該引物特異性較強，能夠區(qū)分豬DNA和其他物種DNA，能夠進行肉制品中豬源基因的檢測。

2.4 豬肉樣品檢測限測定結(jié)果

1～6. 豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100.0%、20.0%、10.0%、5.0%、1.0%、0.1%的混合肉樣；7. 陰性對照及豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%的混合肉樣。

由圖5可知，所制備的豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.1%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、100.0%的混合模擬肉樣在20 個循環(huán)數(shù)以內(nèi)只有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%的模擬肉樣和陰性對照未發(fā)生擴增，其余均發(fā)生擴增。說明該方法能在30 min之內(nèi)檢出豬肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%及以上的摻假樣品，即每1 kg肉制品中摻入1 g豬肉也可被檢出。

2.5 實際樣品檢測結(jié)果

用所建立的豬肉源基因Proofman-LMTIA檢測方法對24 份市售牛羊肉及其肉制品進行檢測，由表2可知，本研究建立的豬肉源Proofman-LMTIA檢測方法與實時熒光定量PCR檢測方法的檢測結(jié)果一致，總符合率為100.0%。由于目前樣品數(shù)量不多，陽性樣品檢出數(shù)較少，后續(xù)將增加樣品數(shù)量以驗證2 種方法的一致性。

3 結(jié) 論

本研究建立了一種基于Proofman探針的LMTIA方法以檢測肉制品中的豬肉源基因，將Proofman探針和超保真酶加入到LMTIA反應(yīng)體系中，更好地實現(xiàn)了反應(yīng)的不開蓋、可視實時檢測。本方法選取豬細(xì)胞核中單拷貝的PRLR基因，對所測試的十幾種非目標(biāo)DNA無交叉反應(yīng)，具有較強的特異性，且可檢測到靈敏度為1 ng/μL的豬基因組DNA。對混合模擬肉樣的檢測，檢測限達到0.1%。較其他分子生物學(xué)檢測方法具有相同或更高的檢測限，如TaqMan實時熒光PCR法的檢出限為5.0%[32]，可視化LAMP方法的檢出限為1%[17]。但目前本研究只能夠檢測肉制品中的豬肉源成分，無法檢測是否摻入雞鴨肉成分，故還不能得到更好的應(yīng)用，后續(xù)將致力于結(jié)合不同的熒光基團，做到高效、快速進行多物種同時檢測，早日應(yīng)用于肉制品摻假的市場監(jiān)管中。

本研究建立的Proofman-LMTIA檢測方法具有操作簡單、靈敏度高、特異性強、反應(yīng)時間短、適用范圍廣等優(yōu)點，可作為肉制品摻假快速檢測的有效手段，為規(guī)范肉制品市場秩序提供技術(shù)支持。

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收稿日期：2022-12-15

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31701689）；國家自然科學(xué)基金面上項目（32172300）；

河南省科技攻關(guān)項目（212102110214）；河南省高校重點研發(fā)項目（21B550006）

第一作者簡介：王博銳（1997—）（ORCID： 0000-0003-2275-7525），男，碩士研究生，研究方向為食品質(zhì)量與安全快速檢測。

E-mail： wangborui1997@163.com

通信作者簡介：王德國（1975—）（ORCID： 0000-0003-0594-9533），男，教授，博士，研究方向為食品質(zhì)量與安全快速檢測。

E-mail： wangdg666@126.com