利用可視基因膜芯片技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)分析肉制品中動(dòng)物源性成分

邵彪 高利亭 徐陳紅 張霞 陳剛 汪少蕓

摘 要：為調(diào)查了解肉制品中動(dòng)物源性成分，以幫助判別摻假情況，應(yīng)用可視基因膜芯片檢測(cè)技術(shù)對(duì)市售的肉松、香腸、肉卷、預(yù)制調(diào)理肉、肉干及肉脯等23 份樣品動(dòng)物源性成分進(jìn)行篩查分析，同時(shí)，針對(duì)篩查結(jié)果采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法進(jìn)一步確證。結(jié)果表明：可視基因膜芯片檢測(cè)法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果一致，提高了未知樣品的篩查效率；在本次隨機(jī)分析的樣品中，動(dòng)物源性成分檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)簽標(biāo)示不一致的情況占比高達(dá)21.7%，肉制品摻假虛標(biāo)情況不容忽視。

關(guān)鍵詞：可視基因膜芯片；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；肉制品；動(dòng)物源性成分；摻假

Analysis of Animal Derived Ingredients in Meat Products by using Optical Gene Thin-Film Biosensor Chips and Real-Time Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction （RT-qPCR）

SHAO Biao1， GAO Liting1， XU Chenhong1， ZHANG Xia1， CHEN Gang1， WANG Shaoyun2，*

（1.Nantong Products Quality Supervision and Inspection Institute， Nantong 226011， China;

2.College of Biological Science and Engineering， Fuzhou University， Fuzhou 350108， China）

Abstract： For the purse of investigating animal derived ingredients in meat products in order to help in identifying adulteration in meat products， optical gene thin-film biosensor chip technology was used to screen and analyze the animal derived components of 23 samples of meat floss， sausage， meat roll， pre-processed meat and dried meat sold on the market. The obtained results were consistent with those of real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR）. The biosensor chip enabled more efficient screening of unknown samples. When random samples were analyzed using the biosensor chip， the results for 21.7% of these samples were inconsistent with the label information， so adulteration and false labeling of meat products should not be ignored.

Keywords： optical gene thin-film biosensor chips; real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction; meat products; animal derived ingredients; adulteration

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20221027-143

中圖分類號(hào)：TS251.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2023）03-0007-07

引文格式：

邵彪， 高利亭， 徐陳紅， 等. 利用可視基因膜芯片技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)分析肉制品中動(dòng)物源性成分[J].

肉類研究， 2023， 37（3）： 7-13. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20221027-143.? ? http：//www.rlyj.net.cn

SHAO Biao， GAO Liting， XU Chenhong， et al. Analysis of animal derived ingredients in meat products by using optical gene thin-film biosensor chips and real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR）[J]. Meat Research， 2023， 37（3）： 7-13. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20221027-143.? ? http：//www.rlyj.net.cn

肉類是人類飲食結(jié)構(gòu)中不可或缺的組成部分。隨著我國(guó)居民消費(fèi)水平的提高，對(duì)肉類的需求量逐年增加，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2021年國(guó)內(nèi)畜禽肉總產(chǎn)量達(dá)9 645 萬(wàn)t，居世界之首。肉制品是以畜禽肉為主要原料，經(jīng)調(diào)味后采用不同加工工藝制作的熟肉制成品或半成品，因風(fēng)味獨(dú)特、口感多樣、便于加工、貯藏等特點(diǎn)深受人們喜愛(ài)，常見(jiàn)的如香腸、火腿、肉松、肉干、肉鋪、肉串、培根、腌臘肉、醬鹵肉、燒烤肉和肉罐頭等。然而，由于不同動(dòng)物來(lái)源的肉類價(jià)格差異較大，在利益的驅(qū)動(dòng)下，肉制品中摻假摻雜現(xiàn)象屢見(jiàn)不鮮，不法商人利用加工過(guò)程絞碎、成形、腌制、熱處理等工藝對(duì)原有形狀的改變，并借助調(diào)味料、食品添加劑的掩飾，將價(jià)格低廉的肉類冒充或摻入到價(jià)格較高的肉類中，達(dá)到以假亂真的目的。肉制品摻假不僅直接損害消費(fèi)者的經(jīng)濟(jì)利益，而且?guī)?lái)潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，如存在不明來(lái)源肉類藥物殘留超標(biāo)、疫病風(fēng)險(xiǎn)、過(guò)敏原危害及添加劑危害等問(wèn)題，此外，還涉及民族信仰與宗教倫理問(wèn)題[1-3]。因此，對(duì)肉制品摻假實(shí)施監(jiān)管非常必要。

圍繞肉類摻假甄別，國(guó)內(nèi)外已開(kāi)發(fā)出很多種分析檢測(cè)方法，包括：波譜分析法，如紅外光譜法[4-5]、拉曼光譜法[6-7]、核磁共振法[8-9]、高光譜成像法[10-11]等；蛋白質(zhì)分析法，如電泳法[12]、色譜法[13]、酶聯(lián)免疫法[14]、

質(zhì)譜法[15-16]；分子生物學(xué)分析法，如普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法[17-18]、熒光定量PCR法[19-20]、等溫?cái)U(kuò)增法[21-22]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法[23-24]、DNA條形碼鑒別技術(shù)[25-26]、數(shù)字

PCR法[27-29]等。由于肉制品加工工藝復(fù)雜，通常涉及調(diào)味、熱處理等工序，導(dǎo)致干擾因素增多、蛋白質(zhì)變性等情況發(fā)生，在一定程度上制約了波譜分析法、蛋白質(zhì)分析法的使用。遺傳物質(zhì)DNA分子具有高度的穩(wěn)定性和物種特異性，因此，以DNA為檢測(cè)對(duì)象的分子生物學(xué)法無(wú)疑成為肉制品動(dòng)物源性成分分析最為理想的選擇方案。其中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法因靈敏度高、特異性好、操作便捷且具有一定的定量功能，是當(dāng)前分子生物學(xué)檢測(cè)最常用的手段，然而其對(duì)于未知成分的檢測(cè)需要設(shè)計(jì)不同的引物、探針逐一排查，增加了檢測(cè)成本?？梢暬蚰ば酒夹g(shù)是一種利用特異探針雜交產(chǎn)生可見(jiàn)信號(hào)的基因芯片技術(shù)，該方法利用反向斑點(diǎn)雜交原理，將核苷酸探針順序排列于支持膜表面，形成探針陣列，采用多重PCR技術(shù)將待檢測(cè)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)變性后形成的單鏈DNA與膜芯片上的探針雜交，經(jīng)底物顯色形成可視的檢測(cè)結(jié)果[30-32]。一般情況下，芯片上固定多個(gè)基因靶點(diǎn)，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目的基因。因此，該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、通量高、成本低和結(jié)果肉眼可見(jiàn)的特點(diǎn)，已在微生物檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)、過(guò)敏原檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域使用[33-35]。

本研究利用可視基因膜芯片對(duì)市售肉制品進(jìn)行篩查分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行確認(rèn)，以證實(shí)2 種方法的一致性和可行性，同時(shí)，對(duì)目前肉制品中動(dòng)物源性成分與標(biāo)簽不一致而涉嫌摻假行為進(jìn)行調(diào)查，為行業(yè)監(jiān)管提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉松（6 份）、香腸（6 份）、肉卷（4 份）、預(yù)制調(diào)理肉（4 份）、肉干（2 份）、肉脯（1 份）均購(gòu)自南通地區(qū)市場(chǎng)及超市。

深加工食品DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）

有限公司；TaqProbe 2×qPCR-Low-ROX預(yù)混液 生工生物工程（上海）股份有限公司；膜芯片動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒 四川華漢三創(chuàng)生物科技有限公司；三氯甲烷（純度≥99.0%） 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇（純度≥99.7%） 上海振興化工一廠；異丙醇（色譜級(jí)，純度99.8%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MFS-24膜芯片雜交儀 四川華漢三創(chuàng)生物科技有限公司；7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國(guó)ABI公司；C1000 Touch梯度PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司；H1650R高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；移液器（2.5、10、200、1 000 μL） 德國(guó)Eppendorf公司；DEAOU-US 200超微量分光光度計(jì) 廣州迪澳生物科技有限公司；GC-100恒溫干浴器、MINI-6K離心機(jī) 杭州佑寧儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

選擇代表性樣品，粉碎、碾磨均勻后，按照深加工食品DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，整個(gè)過(guò)程應(yīng)避免交叉污染。DNA提取完成后，使用核酸蛋白測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定，確保A260 nm/A280 nm為1.8～2.0。

1.3.2 膜芯片檢測(cè)

1）多重PCR擴(kuò)增體系配制。反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中多重PCR反應(yīng)預(yù)混液（2×Multiplex PCR Master Mix）10 μL，加入一定體積的樣品，確保反應(yīng)體系中樣品DNA含量為50～400 ng，用無(wú)核酸酶水補(bǔ)充至20 μL。

2）多重PCR擴(kuò)增。包括3 個(gè)步驟：50 ℃預(yù)處理2 min，95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸15 s，30 個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸30 min，4 ℃保持。

3）膜芯片雜交。產(chǎn)物變性：將PCR產(chǎn)物95 ℃變性5 min后立即置于冰上放置備用；按要求配制好相關(guān)試劑，加入雜交液后執(zhí)行雜交顯示程序，包括雜交（45 ℃、10 min）、雜交清洗（52 ℃、3 min）2 次、酶孵育標(biāo)記（42 ℃、10 min）、酶標(biāo)清洗Ⅰ（42 ℃、3 min）、酶標(biāo)清洗Ⅱ（37 ℃、3 min）2 次、顯色液顯色（37 ℃、10 min）、顯色清洗（37 ℃、1 min）2 次。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物及探針（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系（20 μL）：TaqProbe qPCR Mastermix 10 μL、上游引物（10 μmol/L）1 μL、下游引物（10 μmol/L）1 μL、TaqMan探針0.5 μL、DNA模板2 μL、無(wú)核糖核酸酶ddH2O 5.5 μL。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸60 s并收集熒光信號(hào)，循環(huán)40 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

基因膜芯片結(jié)果由膜芯片雜交儀自動(dòng)拍照并經(jīng)

MFS-24自動(dòng)分析軟件（版本號(hào)MFS24.V.1.0.5.21.03）處理；實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果圖片由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀配套7500軟件（版本號(hào)V2.3）處理而成。

2 結(jié)果與分析

2.1 可視基因膜芯片點(diǎn)陣圖及陽(yáng)性質(zhì)控結(jié)果

本研究所采用的11 種動(dòng)物源性成分膜芯片點(diǎn)陣如

圖1所示，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)11 種動(dòng)物源性成分的檢出限為0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。利用試劑盒所帶的11 種動(dòng)物源性成分多重PCR陽(yáng)性質(zhì)控進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如圖2所示。

由圖1～2可知，膜芯片上PC點(diǎn)、內(nèi)參點(diǎn)及11 種動(dòng)物源性成分陽(yáng)性質(zhì)控點(diǎn)均顯色，而NC點(diǎn)及空白對(duì)照均不顯色，符合預(yù)期要求。

2.2 樣品的可視基因膜芯片檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)11 種動(dòng)物源性成分膜芯片點(diǎn)陣圖與膜芯片顯色結(jié)果，可以判別測(cè)試結(jié)果的有效性及樣品中所含的動(dòng)物源性成分。由表2～6可知，PC點(diǎn)均顯色，而NC點(diǎn)及空白對(duì)照均未顯色，表明測(cè)試結(jié)果均有效。由表2可知，6 份肉松樣本中有1 份（6#）配料表中標(biāo)識(shí)為豬肉，實(shí)際檢出豬和雞成分。由表3可知，6 份香腸樣本中有2 份標(biāo)識(shí)與實(shí)際分析結(jié)果不一致，其中香腸1#標(biāo)識(shí)為牛肉，實(shí)際檢出牛、豬和雞成分，香腸5#標(biāo)識(shí)為雞肉、豬肉，實(shí)際只檢出雞成分。由表4可知，4 份肉卷樣本中有2 份標(biāo)識(shí)與實(shí)際分析結(jié)果不一致，其中肉卷2#標(biāo)識(shí)為牛肉，實(shí)際檢出豬、牛、雞成分，肉卷3#標(biāo)識(shí)為羊肉，實(shí)際不僅檢出羊成分，還檢出豬成分。由表5～6可知，4 份預(yù)制調(diào)理肉、2 份肉干及1 份肉脯樣本實(shí)際檢測(cè)結(jié)果均與標(biāo)識(shí)一致。

由此可以看出，利用可視基因膜芯片技術(shù)，通過(guò)一次多重PCR反應(yīng)，在芯片所包含的11 種動(dòng)物源性成分范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)未知樣品成分的篩查，操作簡(jiǎn)單、快速，顯色結(jié)果肉眼可視。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR確認(rèn)結(jié)果

對(duì)于可視基因膜芯片檢測(cè)與標(biāo)識(shí)不符的5 個(gè)樣品，根據(jù)樣品篩查出的成分，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)各組分進(jìn)行確認(rèn)。

A. 肉松6#（A1、A2. 豬、雞目標(biāo)基因）；B. 香腸1#（B1、B2、B3. 牛、豬、雞目標(biāo)基因）；C. 香腸5#（C1、C2. 雞、豬目標(biāo)基因）；D. 肉卷2#（D1、D2、D3. 豬、牛、雞目標(biāo)基因）；E. 肉卷3#（E1、E2. 羊、豬目標(biāo)基因）。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法是目前分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域使用最為普遍的方法，能夠通過(guò)對(duì)探針?biāo)鶚?biāo)記熒光信號(hào)的監(jiān)測(cè)，實(shí)時(shí)顯示PCR擴(kuò)增結(jié)果，并可以通過(guò)循環(huán)閾（cycle threshold，Ct）值判斷樣本中目標(biāo)核酸起始濃度，具有定量功能。由圖3A可知，豬、雞目標(biāo)基因出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線。由圖3B可知，牛、豬、雞目標(biāo)基因出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線。由圖3C可知，雞目標(biāo)基因出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，而豬目標(biāo)基因無(wú)擴(kuò)增曲線；由圖3D可知，豬、牛、雞目標(biāo)基因出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線。由圖3E可知，羊、豬目標(biāo)基因出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線。上述所有擴(kuò)增曲線相應(yīng)的Ct值均小于30，表明各目標(biāo)組分檢出，通過(guò)與可視基因膜芯片檢測(cè)結(jié)果比較可以看出，2 種技術(shù)測(cè)定結(jié)果一致，證實(shí)了可視基因膜芯片篩查結(jié)果的可靠性。

另外，對(duì)于本次用于分析檢測(cè)的23 份各類肉制品樣品，存在5 批次的摻假、虛標(biāo)情況，占比達(dá)21.7%，主要涉及在價(jià)格較高的牛、羊肉制品中摻加價(jià)格低廉的豬肉或雞肉，或在豬肉制品中摻加雞肉。

3 結(jié) 論

本研究利用可視基因膜芯片技術(shù)對(duì)南通地區(qū)市售的肉松、香腸、肉卷、預(yù)制調(diào)理肉、肉干和肉脯等肉類加工制品動(dòng)物源性成分進(jìn)行篩查，同時(shí)對(duì)于檢出成分與標(biāo)識(shí)不符的樣品采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行驗(yàn)證確認(rèn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2 種方法所獲得的結(jié)果一致。可視基因膜芯片技術(shù)以多重PCR為基礎(chǔ)并在芯片上集成了多個(gè)目標(biāo)探針，能夠?qū)崿F(xiàn)1 次反應(yīng)、多個(gè)目標(biāo)組分同時(shí)定性檢測(cè)，具有通量高、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，同時(shí)，相較于熒光定量PCR技術(shù)，其對(duì)儀器的依賴程度不高，結(jié)果肉眼可見(jiàn)，所使用引物及探針使用親和素和氨基標(biāo)記，成本相較于熒光探針標(biāo)記也更加低廉。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)更為靈敏且具有定量功能，對(duì)于食品摻假鑒別而言，過(guò)高的靈敏度沒(méi)有實(shí)際意義，反而增加了樣本接觸性污染結(jié)果的干擾識(shí)別難度；核酸定量分析雖然在食品成分分析中具有重要意義，能夠反映食品各組分比例關(guān)系，但由于受DNA提取效率及缺乏有效標(biāo)準(zhǔn)品等因素的影響，導(dǎo)致目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在動(dòng)物源成分鑒別中難以有效發(fā)揮其定量?jī)?yōu)勢(shì)，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的鑒別方法主要將其作為定性的手段。由此可見(jiàn)，對(duì)于成分未知的樣品而言，使用可視基因膜芯片技術(shù)可以在芯片標(biāo)記的物種探針?lè)秶鷥?nèi)實(shí)現(xiàn)快速篩查，能夠避免直接使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法逐一分析帶來(lái)的繁瑣程序和高昂成本。

本研究利用11 種常見(jiàn)動(dòng)物源性成分基因膜芯片隨機(jī)分析的23 份樣品中，檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)識(shí)不符的占比達(dá)21.7%，表明肉制品中虛標(biāo)比例較高，涉嫌產(chǎn)品摻假問(wèn)題需要引起監(jiān)管部門(mén)和社會(huì)的關(guān)注，應(yīng)加大力度打擊生產(chǎn)加工過(guò)程弄虛作假，維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，確保食品質(zhì)量與安全。

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收稿日期：2022-10-27

基金項(xiàng)目：南通市科技計(jì)劃項(xiàng)目（JC2020108）；江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局科技計(jì)劃項(xiàng)目（KJ204137）；

國(guó)家自然科學(xué)基金海峽聯(lián)合基金項(xiàng)目（U1905202）

第一作者簡(jiǎn)介：邵彪（1983—）（ORCID： 0000-0001-8749-889X），男，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全分析。

E-mail： shaobiao1983@sina.com

*通信作者簡(jiǎn)介：汪少蕓（1970—）（ORCID： 0000-0003-1244-8964），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)。

E-mail： shywang@fzu.edu.cn