超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中腎上腺素類藥物殘留

劉勇軍 李婷 劉洪斌 雷春娟

摘 要：建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的豬肉中腎上腺素類藥物殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。采用電噴霧離子源、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子模式測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法對(duì)豬肉中腎上腺素類藥物進(jìn)行定性和定量。結(jié)果表明：異丙腎上腺素、去氧腎上腺素、間羥胺定量限為5 ?g/kg，腎上腺素、多巴胺定量限為10 ?g/kg，去甲腎上腺素定量限為

50 ?g/kg；在1.0～100.0 ?g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，峰強(qiáng)度與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好（R2＞0.99）；方法的平均加標(biāo)回收率為81.9%～93.1%。建立的方法簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、靈敏度高，適用于實(shí)驗(yàn)室大批量檢測(cè)豬肉中腎上腺素類藥物殘留。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；豬肉；腎上腺素類藥物；殘留

Determination of Adrenergic Drug Residues in Pork by Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LIU Yongjun， LI Ting， LIU Hongbin， LEI Chunjuan

（China Animal Disease Control Center， Beijing 102600， China）

Abstract： An analytical method for simultaneous determination of adrenergic drug residues in pork was developed by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. The instrument was operated using an electrospray ionization source in the positive ion mode with multiple reaction monitoring （MRM）. Qualitative and quantitative analysis was performed by the internal standard method. The limit of quantitation was 5 ?g/kg for isoprenaline， phenylephrine and metaraminol; 10 ?g/kg for adrenaline and dopamine; and 50 ?g/kg for noradrenaline. The calibration curves were linear in the concentration range of 1.0–100.0 μg/L with correlation coefficients （R2） greater than 0.99. The average recoveries of spiked samples were in the range of 81.9%–93.1%. The proposed method is simple， rapid， reliable， stable， highly sensitive， and suitable for large-scale laboratory analysis of adrenergic drug residues in pork.

Keywords： ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; pork; adrenergic drug; residue

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220929-130

中圖分類號(hào)：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2023）03-0021-07

引文格式：

劉勇軍， 李婷， 劉洪斌， 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中腎上腺素類藥物殘留[J]. 肉類研究， 2023， 37（3）：

21-27. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220929-130.? ? http：//www.rlyj.net.cn

LIU Yongjun， LI Ting， LIU Hongbin， et al. Determination of adrenergic drug residues in pork by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2023， 37（3）： 21-27. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220929-130.? ? http：//www.rlyj.net.cn

腎上腺素類藥物通過(guò)與腎上腺素受體結(jié)合，激動(dòng)受體產(chǎn)生腎上腺樣作用，主要包括去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺、異丙腎上腺素、間羥胺和去氧腎上腺素，其基本化學(xué)結(jié)構(gòu)為β-苯乙胺（圖1）。

自20世紀(jì)60年代，腎上腺素類藥物一直被認(rèn)為是增加恢復(fù)心跳機(jī)會(huì)的特效藥。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2019年頒布的GB 31650—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》[1]規(guī)定在動(dòng)物食品中可以使用腎上腺素和去甲腎上腺素，且不需要制定殘留限量，對(duì)于其他腎上腺素類藥物殘留限量暫無(wú)規(guī)定。但人體攝入大劑量的兒茶酚胺類藥物能夠引起中樞神經(jīng)興奮，還會(huì)引起驚厥并抑制呼吸中樞，嚴(yán)重者引發(fā)胸痛、血壓驟升和心律失常[2-3]；

還可導(dǎo)致腦溢血、急性肺水腫，甚至死亡[4-6]。因此，建立動(dòng)物食品中腎上腺素類藥物的檢測(cè)方法非常必要。

為了規(guī)范腎上腺素類藥物在動(dòng)物中的使用，我國(guó)陸續(xù)出臺(tái)了一些標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21036—2007《飼料中鹽酸多巴胺的測(cè)定 高效液相色譜法》[7]為飼料中鹽酸多巴胺的高效液相色譜檢測(cè)法，最低檢測(cè)限為0.5 mg/kg，最低定量限為1.7 mg/kg；農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3147—2017《飼料中腎上腺素和異丙腎上腺素的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[8]中，飼料中腎上腺素和異丙腎上腺素的定量限分別為20 mg/kg和10 mg/kg，SN/T 5170—2019《出口動(dòng)物源食品中腎上腺素和去甲腎上腺素的測(cè)定》[9]規(guī)定，出口動(dòng)物源食品中腎上腺素和去甲腎上腺素檢測(cè)限為50.0 μg/kg，定量限為100 μg/kg。目前國(guó)內(nèi)外期刊文獻(xiàn)對(duì)于腎上腺素類藥物的檢測(cè)方法均有所報(bào)道[10-12]，常用的檢測(cè)方法有分子納米管印跡檢測(cè)法[13-15]、電化學(xué)生物傳感檢測(cè)法[16-18]、化學(xué)發(fā)光免疫法[19]、毛細(xì)管電泳法[20]、高效液相色譜法[21-22]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[23-25]等，但多數(shù)文獻(xiàn)[26-28]僅對(duì)1～2 種腎上腺素類藥物或其代謝物的殘留方法進(jìn)行相關(guān)研究報(bào)道，相關(guān)檢測(cè)方法的檢出限和定量限均較高，所以急需建立一種可檢測(cè)動(dòng)物食品中多種腎上腺素類藥物殘留的標(biāo)準(zhǔn)方法。因此，本研究旨在建立一種豬肉中腎上腺素類藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腎上腺素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)：腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素、去氧腎上腺素、多巴胺、間羥胺、去甲腎上腺素-D6、腎上腺素-D6、異丙腎上腺素-D7、多巴胺-D4和去氧腎上腺素-D3（純度均≥98.0%）? ?德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；純水、甲醇、甲酸、氨水、乙腈（均為色譜純） 美國(guó)Fisher試劑公司；三氯乙酸（化學(xué)純）、乙酸銨（色譜純） 北京化學(xué)試劑有限公司；濾膜（0.22 ?m） 天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Bond Elut PBA固相萃取柱（100 mg/3 mL，硅膠鍵合苯硼酸固相萃取柱） 美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity超高壓液相色譜儀、Xevo TQS質(zhì)譜儀、MassLynxTM色譜工作站 美國(guó)Waters公司；BS210S電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；Milli-Q Advantage超純水儀 美國(guó)密理博公司；3K15高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；Vortex-Genie 2旋渦混合器 美國(guó)Scientific Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

1.3.1.1 基礎(chǔ)溶液

5 g/100 mL三氯乙酸溶液：取三氯乙酸50 g，溶解至1 000 mL水中，混勻。0.1 mol/L乙酸銨緩沖溶液（pH 8.5）：稱取乙酸銨7.7 g，加水使其溶解，用氨水調(diào)pH值至8.5±0.1，加水定容至1 000 mL。洗脫液：取甲酸0.1 mL和甲醇50 mL，加水稀釋至100 mL，混勻。氨水溶液（pH 8.5）：取濃氨水約25 ?L，調(diào)pH值至8.5±0.1，混勻。流動(dòng)相A：稱取乙酸銨0.154 g和甲酸1 mL，加水稀釋至1 000 mL，混勻。

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

分別稱取腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素、去氧腎上腺素、多巴胺和間羥胺標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，精密稱定。分別用甲醇溶解并稀釋定容至100 mL棕色容量瓶，配制成質(zhì)量濃度為100 ?g/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。－18 ℃保存，有效期6 個(gè)月。

1.3.1.3 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液

分別稱取去甲腎上腺素-D6、腎上腺素-D6、異丙腎上腺素-D7、多巴胺-D4和去氧腎上腺素-D3各10 mg，分別用甲醇溶解并稀釋定容至100 mL棕色容量瓶，配制成質(zhì)量濃度為100 ?g/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。－18 ℃保存，有效期6 個(gè)月。

1.3.1.4 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液

精密量取腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素、去氧腎上腺素、多巴胺和間羥胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 mL，用甲醇稀釋定容至100 mL棕色容量瓶，配制成質(zhì)量濃度為1 ?g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。2～8 ℃下避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.1.5 混合內(nèi)標(biāo)工作液

精密量取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液各1 mL，用甲醇稀釋定容至100 mL棕色容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1 ?g/mL的混合內(nèi)標(biāo)工作液。2～8 ℃下避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.1.6 工作曲線溶液

取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制0.5、1.0、2.0、10.0、50.0、100.0 ?g/L的系列腎上腺素、異丙腎上腺素、去氧腎上腺素、多巴胺、間羥胺和1.0、2.0、10.0、50.0、200.0、500.0 ?g/L的去甲腎上腺素系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，取適量混合內(nèi)標(biāo)工作液配制40 ?g/L內(nèi)標(biāo)，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，得到相應(yīng)的峰面積。以腎上腺素類藥物與相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.2 液相色譜與質(zhì)譜條件

1.3.2.1 液相色譜條件

色譜柱：極性修飾Polaris Amide-C18色譜柱（150 mm×3.0 mm，3.0 μm）；流動(dòng)相：A相：含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸和2 mmol/L乙酸銨的水溶液，B相：乙腈；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 ?L，梯度洗脫條件見表1。

1.3.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；干燥氣溫度250 ℃，干燥氣流速7 L/min；鞘氣溫度325 ℃，鞘氣流速12 L/min；噴霧器壓力40 psi；毛細(xì)管電壓3 500 V；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碎裂電壓、碰撞能量等見表2。

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 提取

稱取5 g（精確至±0.01 g）豬肉，加入200 ?L同位素內(nèi)標(biāo)，渦旋均勻，加入10 mL 5 g/100 mL三氯乙酸溶液，渦旋1 min后，4 ℃、8 000 r/min離心5 min。吸取10 mL上清液于15 mL離心管中，加一定量濃氨水，調(diào)節(jié)pH值為8.5后，4 ℃、8 000 r/min離心5 min。取全部上清液混勻，待過(guò)柱凈化。

1.3.3.2 凈化

將全部上清液轉(zhuǎn)移至預(yù)先用3 mL甲醇、3 mL 0.1 mol/L、pH 8.5乙酸銨緩沖液活化的Bond Elut PBA固相萃取柱中，以1 滴/s的速率自流過(guò)柱。然后用5 mL上述乙酸銨緩沖液淋洗，抽干小柱，用5 mL 0.1%甲酸水溶液洗脫。最后擠干小柱，收集洗脫液混合均勻，過(guò)0.22 μm尼龍濾膜，待超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.3.4 結(jié)果計(jì)算

采用與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀配套使用的數(shù)據(jù)采集和處理一體化軟件MassLynxTM（美國(guó)Waters公司）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的自動(dòng)處理，經(jīng)軟件自動(dòng)處理得到試樣溶液中相應(yīng)各腎上腺素類藥物的質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算。

式中：ρi為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的試樣溶液中腎上腺素類藥物的質(zhì)量濃度/（μg/L）；X為試樣中腎上腺素類藥物的殘留量/（μg/kg）；V為試樣提取溶液總體積/mL；V1為用于凈化的提取溶液體積/mL；V2為最終定容體積/mL；m為試樣質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇與優(yōu)化

將適量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素、去氧腎上腺素、多巴胺、間羥胺溶液和內(nèi)標(biāo)去甲腎上腺素-D6、腎上腺素-D6、異丙腎上腺素-D7、多巴胺-D4和去氧腎上腺素-D3溶液采用流動(dòng)注射直接進(jìn)樣，通過(guò)全掃描方式確定其母離子，再對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描得到碎片離子，通過(guò)優(yōu)化條件，得到二級(jí)質(zhì)譜圖。通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)選擇相對(duì)豐度較高的離子對(duì)為定性定量離子對(duì)，并對(duì)毛細(xì)管電壓、碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳上機(jī)參數(shù)。優(yōu)化得到的質(zhì)譜條件見表2。

2.2 色譜柱的選擇

腎上腺素類藥物具有較強(qiáng)的水溶性，極性較強(qiáng)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用一般的C18色譜柱進(jìn)行檢測(cè)分析，保留效果很差，同時(shí)峰形也很不理想。因此本研究嘗試了極性修飾Polaris Amide-C18色譜柱和HSS T3色譜柱。極性修飾Polaris Amide-C18色譜柱和HSS T3色譜柱均對(duì)極性化合物具有保留效果良好、100%水相流動(dòng)相兼容、極低的質(zhì)譜檢測(cè)本底等優(yōu)良特征，因此，非常適合分析極性較強(qiáng)的腎上腺素類目標(biāo)物。通過(guò)不斷優(yōu)化流動(dòng)相比例和條件，發(fā)現(xiàn)使用HSS T3色譜柱時(shí)存在保留時(shí)間過(guò)短的問(wèn)題，一些雜質(zhì)峰會(huì)干擾目標(biāo)物，而相對(duì)而言，極性修飾Polaris Amide-C18色譜柱保留時(shí)間要長(zhǎng)一些，各目標(biāo)物的峰型較好，所以，最終選擇極性修飾Polaris Amide-C18色譜柱（150 mm×3.0 mm，3.0 μm）。

優(yōu)化條件下各腎上腺素類藥物及內(nèi)標(biāo)的色譜圖如圖2所示。

2.3 提取及凈化方法的選擇

6 種腎上腺素類藥物均含有羥基和氨基，極性較強(qiáng)，易溶于水和極性較強(qiáng)的有機(jī)試劑中。通過(guò)文獻(xiàn)檢索和已發(fā)布相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)腎上腺素類物質(zhì)提取試劑的選擇來(lái)看，目前選擇的常用提取溶劑為乙腈、三氯乙酸水溶液、高氯酸溶液和乙酸銨溶液等[29-31]。所以本研究通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，選擇乙腈、三氯乙酸水溶液和高氯酸溶液以及乙腈和三氯乙酸水溶液、高氯酸溶液不同比例的混合液進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)。

由表3可知，以5 g/100 mL三氯乙酸作為提取液時(shí)，能滿足6 種藥物的提取效果要求。

在凈化實(shí)驗(yàn)中，綜合考慮腎上腺素類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)，選用3 種固相萃取柱（混合陽(yáng)離子交換柱、HLB親水親酯柱和PBA苯硼酸共價(jià)柱）比較凈化效果。PBA固相萃取小柱的回收率明顯高于其他2 種固相萃取柱。因此本方法選擇PBA固相萃取柱作為凈化固相萃取柱。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，精密量取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液及混合內(nèi)標(biāo)工作液，用初始流動(dòng)相稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為0.50、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0 ?g/L的系列腎上腺素、異丙腎上腺素、去氧腎上腺素、多巴胺、間羥胺和1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0 ?g/L的去甲腎上腺素系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為20 ng/mL。采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)法進(jìn)行分析定量。6 種腎上腺素類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)如表4所示。

2.4.2 檢出限和定量限

空白試樣按相同的步驟處理后，在相應(yīng)的保留時(shí)間下，空白試樣對(duì)所測(cè)藥物應(yīng)無(wú)干擾。如果空白試樣在相應(yīng)的保留時(shí)間處出現(xiàn)被測(cè)藥物峰，應(yīng)扣除空白試樣值進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于（5.00±0.01） g豬肉空白樣品中，經(jīng)提取后測(cè)定，檢測(cè)限依據(jù)信噪比＞3計(jì)算，定量限依據(jù)信噪比＞10計(jì)算。6 種腎上腺素類藥物在豬肉中的檢測(cè)限和定量限見表5。

2.4.3 回收率和精密度

在豬肉基質(zhì)中添加腎上腺素類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)。6 種腎上腺素類物質(zhì)，每種藥物設(shè)置3 個(gè)添加濃度水平，每個(gè)濃度水平6 個(gè)重復(fù)樣品。

由表6可知，內(nèi)標(biāo)矯正后，加標(biāo)回收率為81.9%～93.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～8.7%。添加回收率為60%～120%，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%，說(shuō)明建立的方法重復(fù)性和準(zhǔn)確度較好，可以滿足豬肉中腎上腺素類藥物殘留量的測(cè)定。

3 結(jié) 論

本研究以豬肉基質(zhì)為研究對(duì)象，采用5 g/100 mL三氯乙酸溶液為提取液，PBA固相萃取柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行定性及定量分析，建立了豬肉中去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺、異丙腎上腺素、間羥胺、去氧腎上腺素6 種腎上腺素類藥物殘留的檢測(cè)方法。該方法樣品前處理提取簡(jiǎn)單、效率高，條件易于控制，具有較高的靈敏度和選擇性，能滿足豬肉中腎上腺素類藥物殘留確證的分析要求。而且該多殘留檢測(cè)方法的研究和開發(fā)對(duì)已頒布的相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和已報(bào)道的相關(guān)研究起到了很好的補(bǔ)充和完善作用，為我國(guó)對(duì)該類藥物的有效監(jiān)管提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

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