不同劑量UVA1光療對(duì)免疫接觸性致敏小鼠皮膚光損傷的影響

鄧蕙妍?田歆?李華平?陳教全?朱慧蘭

【摘要】目的 探討不同劑量長(zhǎng)波紫外線1（UVA1）照射對(duì)皮膚造成的損傷程度，平衡UVA1光療作用與光損傷的關(guān)系，以期獲得治療的最大效益。方法 模擬不同劑量UVA1照射治療免疫接觸性致敏小鼠模型，觀察治療過(guò)程中皮膚的光損傷程度并對(duì)光損傷相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 隨著劑量和照射次數(shù)的增加，皮膚出現(xiàn)黑斑的小鼠比例高于無(wú)曬傷表現(xiàn)或紅斑的小鼠（P < 0.05），但皮膚厚度和組織形態(tài)學(xué)與未照光免疫接觸性致敏小鼠模型組相比均無(wú)明顯改變。皮膚丙二醛（MDA）和還原型谷胱甘肽（GSH）檢測(cè)顯示，隨著照射劑量和照射次數(shù)的增加，小鼠皮膚MDA含量也隨之升高（P < 0.05）；對(duì)GSH而言，隨著照射劑量的增大，小鼠皮膚GSH含量下降（P < 0.05）；不同的照射次數(shù)對(duì)小鼠皮膚GSH含量無(wú)明顯影響。結(jié)論 不同劑量的UVA1光療均可造成皮膚光損傷，并隨著劑量和次數(shù)的增加而損傷加重。但短期內(nèi)這種光損傷是輕微的，尤其是低劑量UVA1照射，中高劑量UVA1照射則需考慮光療作用與光損傷的平衡。

【關(guān)鍵詞】長(zhǎng)波紫外線1；光療；光損傷；丙二醛；還原型谷胱甘肽

Effect of different doses of UVA1 phototherapy on skin photodamage in immune-contact sensitized mice Deng Huiyan，Tian Xin， Li Huaping， Chen Jiaoquan， Zhu Huilan. Department of Dermatology， Guangzhou Institute of Dermatology， Guangzhou? 510095，China

Corresponding author， Zhu Huilan， E-mail： zhlhuilan@126.com

【Abstract】Objective To evaluate the degree of skin injury caused by different doses of UVA1 irradiation and balance the relationship between UVA1 phototherapy and photodamage， aiming to maximize the therapeutic benefits. Methods Different doses of UVA1 irradiation were simulated to treat immune-contact sensitized mouse models. The degree of skin photodamage during treatment was observed and photodamage-related indexes were detected. Results With the increase of dose and irradiation times， the proportion of mice with black spots on the skin was significantly higher than that of mice without sunburn or erythema （both P < 0.05）. However， there were no significant changes in skin thickness and histomorphology compared with the non-photosensitized mouse model group. The detection of malondialdehyde （MDA） and reduced glutathione （GSH） on the skin showed that the increase of doses and irradiation times would cause the increase of MDA content （P < 0.05）； For GSH， the increase of doses would cause the decrease of GSH content （P < 0.05）；and the irradiation time exerted no effect （P > 0.05）. Conclusions Different doses of UVA1 phototherapy can cause skin photodamage， which is aggravated with the increase of dose and frequency. However， this photodamage is mild in the short term， especially with low-dose UVA1 irradiation. The balance between phototherapy effect and photodamage needs to be considered for moderate- and high-dose UVA1 irradiation.

【Key words】UVA1； Phototherapy； Photodamage；Malondialdehyde；Glutathione

長(zhǎng)波紫外線（UVA）分為UVA1（340～400 nm）

和UVA2（320～340 nm），其中UVA2物理和生物學(xué)效應(yīng)與中波紫外線（UVB，280～320 nm）相近。UVA1能夠穿透真皮乳頭層進(jìn)入皮下組織淺層。與UVB相比，由于波長(zhǎng)增加，UVA1的穿透深度增加。根據(jù)其波長(zhǎng)，UVA1的靶向位置正好是皮膚深層的細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等［1］。其物理特性決定了UVA1對(duì)炎癥性皮膚病治療有效。目前UVA1在臨床上用于銀屑病、局限性硬皮病、特應(yīng)性皮炎、色素性蕁麻疹等多種免疫相關(guān)性皮膚病，療效肯定，但治療劑量并無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。UVA1治療劑量分為3個(gè)等級(jí)：10～29 J/cm2為低劑量，30～59 J/cm2為中劑量，60～120 J/cm2為高劑量［1］。

UVA1光療由于穿透較深，在治療的同時(shí)可以引起皮膚日曬傷和光老化反應(yīng)，出現(xiàn)紅斑、水腫等急性光損傷表現(xiàn)和皮膚萎縮、色素異常等慢性光損傷表現(xiàn)。為探討不同劑量UVA1照射對(duì)皮膚造成的損傷程度，避免在治療過(guò)程中由于光熱效應(yīng)，導(dǎo)致皮膚在原有疾病的基礎(chǔ)上損傷加重，本研究模擬不同劑量UVA1照射治療免疫接觸性致敏小鼠模型，觀察了治療過(guò)程中皮膚的光損傷程度并對(duì)光損傷相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

材料與方法

一、材 料

BALB/c雄性小鼠63只，6～8月齡，體重20～30 g，購(gòu)買(mǎi)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（粵）2022-0298。UVA1光療儀，LED光源，波長(zhǎng)366.42 nm，購(gòu)自徐州市科諾醫(yī)學(xué)儀器設(shè)備有限公司。丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒，購(gòu)自南京建成科技有限公司。微量還原型谷胱甘肽（GSH）測(cè)定試劑盒，購(gòu)自南京建成科技有限公司。正置白光拍照顯微鏡，日本Nikon，型號(hào)Eclipse Ci-L。測(cè)量分析軟件，美國(guó)Media Cybemetics，型號(hào)Image-Pro Plus 6.0。

二、方 法

1.實(shí)驗(yàn)分組

60只BALB/c雄性小鼠，編號(hào)后使用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行分組，共4組，分別為模型組（15只）、UVA1低劑量照射組（15只）、UVA1中劑量照射組（15只）和UVA1高劑量照射組（15只），另設(shè)空白陰性對(duì)照小鼠3只（空白對(duì)照組）。模擬臨床治療方案對(duì)小鼠進(jìn)行UVA1光療。模型組：建立免疫接觸性致敏小鼠模型；UVA1低劑量照射組：30 J/cm2 UVA1對(duì)免疫接觸性致敏小鼠模型進(jìn)行照射，每周2次；UVA1中劑量照射組：60 J/cm2 UVA1對(duì)免疫接觸性致敏小鼠模型進(jìn)行照射，每周2次；UVA1高劑量照射組：80 J/cm2 UVA1對(duì)免疫接觸性致敏小鼠模型進(jìn)行照射，每周2次。每次照射光源與小鼠的垂直照射距離為15 cm?？瞻讓?duì)照組只對(duì)小鼠進(jìn)行背部去毛拍照，未進(jìn)行其他處理。本實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)倫理規(guī)范（IACUC-G16014）。

2.免疫接觸性致敏小鼠模型的構(gòu)建

小鼠預(yù)先背部去毛3 cm×4 cm，小鼠尾靜脈注射濃度0.5 mg/mL的抗DNP IgE單克隆抗體，給藥劑量2 μg/只，注射體積200 μL/只。24 h后在小鼠雙耳各涂0.15% 2，4-二硝基氟苯（DNFB）進(jìn)行激發(fā)，每天1次連續(xù)激發(fā)。觀察連續(xù)出現(xiàn)風(fēng)團(tuán)3 d后開(kāi)始進(jìn)行UVA1照射，每周2次，療程為8周。期間正常飲食。

3.標(biāo)本采集及保存

處死小鼠后，切下背部的皮膚組織，一部分用4%甲醛液固定，一部分用生理鹽水沖洗，液氮速凍后轉(zhuǎn)入-70℃超低溫冰箱保存。

4.指標(biāo)檢測(cè)

4.1 曬傷程度

觀察各組小鼠的曬傷程度并評(píng)分，1分為無(wú)曬傷；2分為出現(xiàn)紅斑；3分為出現(xiàn)黑斑；4分為出現(xiàn)水皰。

4.2 皮膚厚度

對(duì)各組小鼠分別于照射的1周、2周、4周、6周和8周進(jìn)行皮膚厚度的測(cè)量。送檢樣本經(jīng)4%多聚甲醛固定，固定狀態(tài)良好后，嚴(yán)格按照本單位病理實(shí)驗(yàn)檢查SOP程序進(jìn)行修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片最后鏡檢合格的樣片。使用Eclipse Ci-L拍照顯微鏡選取組織的目的區(qū)域進(jìn)行40倍成像，成像時(shí)盡量讓組織充滿整個(gè)視野，保證每張照片的背景光一致。使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件，統(tǒng)一以mm作為標(biāo)準(zhǔn)單位，測(cè)量每張切片中的5處皮膚厚度，并計(jì)算出平均值。

4.3 MDA檢測(cè)

對(duì)各組小鼠分別于照射的1周、2周、4周、6周和8周進(jìn)行皮膚MDA含量的檢測(cè)。樣品與試劑混合，蓋上蓋，旋渦混勻器混勻，95℃以上水浴40 min，取出后流水冷卻，4000 r/min離心10 min，530 nm，將酶標(biāo)板空板進(jìn)行掃描，準(zhǔn)確吸取0.25 mL各管反應(yīng)液加入到新的96孔板中，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度，根據(jù)公式計(jì)算MDA含量。

4.4 還原型GSH檢測(cè)

對(duì)各組小鼠分別于照射的1周、2周、4周、6周和8周進(jìn)行皮膚GSH含量的檢測(cè)。樣品與試劑混合，靜置 5 min，405 nm 處，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算GSH含量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用R 4.1.3 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用 Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、 Leven 法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。正態(tài)分布計(jì)量資料以表示，非正態(tài)分布資料以中位數(shù)（四分位間距）表示。采用廣義線性模型分析光療劑量及照射次數(shù)和小鼠曬傷情況的關(guān)系；采用雙因素方差分析UVA1 光療劑量對(duì)不同組別小鼠皮膚厚度、皮膚MDA含量和皮膚GSH含量的影響，組間比較采用Bonferroni檢驗(yàn)；P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、UVA1光療對(duì)小鼠皮膚曬傷程度的影響

連續(xù)記錄小鼠每次UVA1光療后第二日的皮膚曬傷情況，共16次。結(jié)果顯示在控制了劑量分組以后，隨著照射次數(shù)增加，出現(xiàn)曬傷的可能性更大（Z = 2.596，P < 0.05，見(jiàn)圖1、2）。全部小鼠均未觀察到水皰的出現(xiàn)。

二、UVA1光療對(duì)小鼠皮膚厚度和組織結(jié)構(gòu)的影響

不同劑量UVA1照射和不同照射次數(shù)之間的交互作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 1.185，P > 0.05），即不同劑量UVA1照射和不同照射次數(shù)的交互作用對(duì)小鼠皮膚厚度沒(méi)有明顯影響；不同劑量UVA1照射的主效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果為F = 2.572，P > 0.05，表明不同劑量UVA1照射時(shí)，小鼠皮膚厚度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不同照射次數(shù)的主效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果為F = 0.528，P > 0.05，表明不同的照射次數(shù)對(duì)小鼠皮膚厚度無(wú)明顯影響，見(jiàn)圖3；第8周結(jié)束照射時(shí)，不同劑量照射組皮膚組織形態(tài)學(xué)無(wú)明顯異常，見(jiàn)圖4。

三、UVA1光療對(duì)小鼠皮膚MDA含量的影響

不同劑量UVA1照射和照射次數(shù)存在交互作用（F = 15.990，P < 0.05），因此分析單獨(dú)效應(yīng)，同一劑量UVA1照射情況下，隨著照射次數(shù)的增加，小鼠的皮膚MDA含量也不斷增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在同樣照射次數(shù)的條件下，UVA1高劑量照射組小鼠皮膚MDA含量高于中UVA1低劑量照射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 6.287， P < 0.05）。見(jiàn)圖5。

四、UVA1光療對(duì)小鼠皮膚GSH含量的影響

不同劑量UVA1照射和不同照射次數(shù)之間的交互作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 0.968，P > 0.05），即不同劑量UVA1照射和不同照射次數(shù)的交互作用對(duì)小鼠皮膚GSH含量沒(méi)有明顯影響；不同劑量UVA1照射的主效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果為F = 35.609，P < 0.05，表明在同樣照射次數(shù)情況下，不同劑量UVA1照射對(duì)小鼠皮膚GSH有明顯影響，且隨著照射劑量的增大，GSH含量下降。不同照射次數(shù)的主效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果為F = 3.132， P > 0.05，表明不同的照射次數(shù)對(duì)小鼠皮膚GSH含量無(wú)影響。見(jiàn)圖6。

討論

光療是多種病因皮膚病的一線治療手段，目前研究表明其治療機(jī)制涉及DNA損傷導(dǎo)致的環(huán)丁烷嘧啶二聚體形成、活性氧產(chǎn)生、順式-反式尿烷酸異構(gòu)化、維生素D合成、血小板活化因子分泌和炎癥小體激活等［2-7］。根據(jù)其作用機(jī)制可知，光療的治療作用是雙刃劍，治療的同時(shí)可能會(huì)造成皮膚組織的光損傷。

UVA在皮膚中產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的光氧化損傷。脂質(zhì)過(guò)氧化作用（LPO）導(dǎo)致細(xì)胞膜連續(xù)損傷和隨后的信號(hào)通路嚴(yán)重紊亂，是光氧化應(yīng)激促進(jìn)皮膚老化和皮膚癌生成的途徑之一。MDA是脂質(zhì)降解的主要終產(chǎn)物，代表了LPO的公認(rèn)參數(shù)［8］。

皮膚擁有一個(gè)復(fù)雜的、部分可誘導(dǎo)的抗氧化網(wǎng)絡(luò)來(lái)防御光氧化應(yīng)激，抗氧化劑網(wǎng)絡(luò)包括低分子自由基清除劑，如谷胱甘肽、維生素C、維生素 E 以及協(xié)調(diào)的細(xì)胞內(nèi)酶途徑。該酶促途徑由超氧化物歧化酶 （SOD） 組成，SOD催化毒性超氧陰離子 （O2） 向過(guò)氧化氫 （H2O2） 的轉(zhuǎn)變。這些酶有兩種亞型，位于線粒體的錳-SOD 和位于胞質(zhì)的銅-鋅-SOD。由活性 SOD 和其他途徑產(chǎn)生的 H2O2 分子被攝取，并通過(guò)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 （GPX） 或過(guò)氧化氫酶進(jìn)一步加工成分子 O2 和水。GPX 還以相同的方式解毒脂質(zhì)氫過(guò)氧化物，因此對(duì)于通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化特異性預(yù)防膜損傷具有特別重要的意義［9-10］。Schneider等檢測(cè)UVA1與皮膚成纖維細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)時(shí)證實(shí)，抗氧化皮膚保護(hù)系統(tǒng)對(duì)活性氧，雖然能夠適應(yīng)重復(fù)的UVA暴露，但處于脆弱的平衡。它提供的保護(hù)量可能因個(gè)人而異。決定這種變異的確切因素尚待詳細(xì)研究，然而，似乎該機(jī)制對(duì)GSH耗竭非常敏感［8］。由上可知，UVA1的光損傷程度與MDA和GSH水平密切相關(guān)。除此以外，紫外線照射除了急性光損傷以外，還會(huì)導(dǎo)致光老化，引起皮膚厚度增加，組織結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂。

紫外線對(duì)皮膚的急慢性光損傷除了與波長(zhǎng)有關(guān)，也與劑量密切相關(guān)。與此相對(duì)，光療的效果也與劑量聯(lián)系緊密。對(duì)白癜風(fēng)、硬皮病、特應(yīng)性皮炎等疾病的臨床研究或回顧性分析發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量的UVA1治療均對(duì)疾病有效，但不同疾病某個(gè)等級(jí)的劑量效果可能更佳［11-13］。

UVA1由于波長(zhǎng)較長(zhǎng)，對(duì)表皮全層和真皮淺層均有影響，曾有學(xué)者對(duì)人工皮膚進(jìn)行不同劑量UVA1照射，發(fā)現(xiàn)UVA1劑量達(dá)到40 J/cm2時(shí)，真皮淺層的成纖維細(xì)胞活性下降，皮膚發(fā)生光損傷［14］。由此可知，如何平衡不同劑量的治療和光損傷的關(guān)系對(duì)臨床應(yīng)用有極大影響。既往未見(jiàn)利用活體病理模型進(jìn)行UVA1光療后皮膚光損傷的觀察研究，本實(shí)驗(yàn)引入免疫性接觸性致敏小鼠模型，模擬人體在致敏狀態(tài)下接受不同劑量UVA1治療，觀察其光損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UVA1每周2次，照射8周的療程，隨著照射劑量和次數(shù)的增加，皮膚紅斑和黑斑出現(xiàn)的頻率增高，但低、中、高劑量UVA1照射均沒(méi)有引起小鼠皮膚厚度的改變，對(duì)皮膚組織結(jié)構(gòu)亦無(wú)明顯影響。表明不同劑量UVA1光療8周的療程不會(huì)導(dǎo)致皮膚組織形態(tài)學(xué)的改變。MDA和GSH的結(jié)果提示，低劑量UVA1照射在早期對(duì)皮膚MDA的含量無(wú)明顯影響，但照光次數(shù)增多后也會(huì)引起MDA含量增加，而中、高劑量的UVA1在照射早期就能引起MDA含量增加；對(duì)GSH而言，不同的照射次數(shù)對(duì)小鼠皮膚GSH含量無(wú)明顯影響。

綜上所述，不同劑量的UVA1光療均可造成小鼠皮膚光損傷，并隨著劑量和次數(shù)的增加而損傷加重。但8周的光療并未引起皮膚組織形態(tài)學(xué)的改變，由此可認(rèn)為，這種損傷是相對(duì)輕微的，尤其是低劑量UVA1光療。因此在臨床實(shí)際治療時(shí)，當(dāng)短期應(yīng)用低劑量UVA1光療時(shí)，可忽略其對(duì)皮膚的光損傷作用，當(dāng)需要中、高劑量UVA1進(jìn)行光療，特別是治療時(shí)間較長(zhǎng)，照射次數(shù)較多時(shí)，需考慮治療效果與光損傷作用的平衡，以期取得最大獲益。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2022-12-25）

（本文編輯：楊江瑜）