類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白GhCBL3-A01調(diào)控棉花黃萎病抗性的功能分析

高升旗 邵武奎 趙準(zhǔn) 邵盤霞 胡文冉 黃全生

摘要：【目的】解析類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白（calcium B-like protein， CBL）基因GhCBL3-A01在棉花抗黃萎病反應(yīng)中的功能，為棉花抗病育種提供基因資源?！痉椒ā繌拿藁ɑ蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)獲得 GhCBL3-A01基因的同源序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction， qRT-PCR）檢測(cè)大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）、茉莉酸甲酯（methyl jasminate， MeJA）和H₂O₂處理的棉株中GhCBL3-A01基因的表達(dá)量變化。利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing， VIGS）技術(shù)研究GhCBL3-A01在棉花抗黃萎病中的功能。通過(guò)檢測(cè)活性氧積累以及相關(guān)基因的表達(dá)量，初步分析GhCBL3-A01的作用機(jī)制?！窘Y(jié)果】陸地棉中GhCBL3-A01及其3個(gè)同源蛋白均含有3個(gè)CBL家族典型的EF-hand結(jié)構(gòu)域。大麗輪枝菌、MeJA和H₂O₂處理后，GhCBL3-A01的表達(dá)量顯著升高。VIGS沉默GhCBL3-A01導(dǎo)致病株率和病情指數(shù)顯著降低，莖稈維管束褐變程度減輕，有病菌繁殖的莖段數(shù)量明顯減少，增強(qiáng)了棉株對(duì)黃萎病的抗性。GhCBL3-A01基因沉默棉株葉片中活性氧積累增多，防御相關(guān)基因PR1、NPR1、PR4和PDF1.2以及茉莉酸信號(hào)通路關(guān)鍵基因AOS1、OPR3、MYC2和LOX2的表達(dá)量增加?！窘Y(jié)論】GhCBL3-A01通過(guò)調(diào)控防御相關(guān)基因、茉莉酸信號(hào)通路基因的表達(dá)和活性氧積累負(fù)調(diào)控棉花對(duì)黃萎病的抗性，是提高棉花黃萎病抗性的候選基因。

關(guān)鍵詞：棉花；黃萎??；類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白；GhCBL3-A01；抗病基因；病毒誘導(dǎo)的基因沉默

Functional analysis of cotton calcineurin B-like protein GhCBL3-A01 in regulating the resistance to Verticillium wilt

Gao Shengqi1， 2， Shao Wukui1， 2， Zhao Zhun1， 2， Shao Panxia1， 2， Hu Wenran1， 2， Huang Quansheng1， 2*

[1. Institute of Nuclear Technology and Biotechnology， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences/Xinjiang Key Laboratory of Crop Biotechnology， Urumqi 830091， China; 2. National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Germplasm Innovation in Arid Desert Areas （Preparation）， Urumqi 830091， China]

Abstract： [Objective] This research aims to investigate the role of calcium B-like protein （CBL） gene GhCBL3-A01 in resistance to Verticillium wilt in cotton， so as to provide genetic resource for cotton disease resistance breeding. [Methods] The homologous sequences of GhCBL3-A01 gene were obtained from cotton genomic database for bioinformatic analysis. The relative expression levels of GhCBL3-A01 under Verticillium dahliae， methyl jasminate （MeJA） and H₂O₂treatments were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR）. The function of GhCBL3-A01 in cotton resistance to Verticillium wilt was analysed by virus-induced gene silencing （VIGS） technique. The functional mechanisms of GhCBL3-A01 were analyzed by detecting the accumulation of reactive oxygen species （ROS） and the expression levels of related genes. [Results] GhCBL3-A01 and its three homologous proteins in upland cotton all contain three typical EF-hand domains of the CBL family. The expression level of GhCBL3-A01 was significantly increased under the treatment of Verticillium dahliae， MeJA， and H₂O₂. Silencing GhCBL3-A01 by VIGS resulted in a significant decrease in rate of diseased plants and disease index， a reduction in the browning degree of vascular bundles， and a decline in the number of hyphae in stem segments， which enhanced the resistance of cotton plants to Verticillium wilt. The expression levels of disease resistance-related genes （PR1， NPR1， PR4， and PDF1.2） and jasmonic acid （JA） signaling pathway genes （AOS1， OPR3， MYC2， and LOX2） were increased， and ROS accumulation was enriched in GhCBL3-A01 silenced cotton plants. [Conclusion] GhCBL3-A01 negatively regulates the resistance of cotton to Verticillium wilt by regulating the expression levels of defense-related genes and JA signaling pathway genes as well as the accumulation of ROS， which is a candidate gene for improving the resistance of cotton to Verticillium wilt.

Keywords： cotton; Verticillium wilt; calcineurin B-like protein（CBL）; GhCBL3-A01; resistance gene; virus-induced gene silencing

棉花（Gossypium spp.）是紡織工業(yè)的天然纖維來(lái)源。棉花的生長(zhǎng)發(fā)育經(jīng)常受到多種病害的影響，尤其是黃萎?。╒erticillium wilt），導(dǎo)致產(chǎn)量和纖維品質(zhì)嚴(yán)重下降^[1-2]。目前，利用殺菌劑無(wú)法有效防治棉花黃萎病，最有效的措施是選育抗病品種。因此，鑒定黃萎病抗性基因并解析其作用機(jī)制對(duì)于培育優(yōu)質(zhì)抗病棉花品種至關(guān)重要^[3]。

近年來(lái)，關(guān)于棉花對(duì)黃萎病菌侵染的防御反應(yīng)機(jī)制取得了新的研究進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)幾種信號(hào)通路（包括植物激素等）能夠激活棉花對(duì)大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）的防御反應(yīng)^[4]。已鑒定到一些黃萎病抗性相關(guān)基因。如棉花乳膠蛋白基因GhMLP28正調(diào)控乙烯響應(yīng)因子GhERF6，這2個(gè)基因編碼的蛋白通過(guò)協(xié)同互作保護(hù)棉花免受黃萎病菌的侵染^[5]。鈣依賴蛋白激酶GhCPK33通過(guò)磷酸化12-氧代植二烯酸還原酶GhOPR3負(fù)調(diào)控棉花對(duì)黃萎病菌的抗性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)GhOPR3可直接調(diào)控茉莉酸（jasmonic acid， JA）的生物合成，從而提高棉花對(duì)黃萎病的抗性^[6]。抑制油菜素內(nèi)酯（brassinosteroid， BR）GhBZR1基因的表達(dá)能增強(qiáng)感病陸地棉（Gossypium hirsutum L.）品系86-1對(duì)黃萎病菌的抗性，而超表達(dá)GhBZR1降低轉(zhuǎn)基因擬南芥（Arabidopsis thaliana）對(duì)黃萎病菌的抗性^[7]。陸地棉Rho鳥(niǎo)苷三磷酸酶GhROP6通過(guò)參與JA合成、JA信號(hào)通路以及木質(zhì)素合成代謝調(diào)控棉花抗黃萎病反應(yīng)^[8]。促絲裂原活化蛋白激酶GhMAPKKK2通過(guò)參與JA和水楊酸（salicylic acid， SA）信號(hào)通路在棉花抗黃萎病反應(yīng)中發(fā)揮正調(diào)控作用^[9]。沉默GhMYB43增強(qiáng)棉株對(duì)黃萎病菌的抗性，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)GhMYB43負(fù)調(diào)控木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵酶編碼基因和JA信號(hào)通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平^[10] 。此外，利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing， VIGS）技術(shù)發(fā)現(xiàn)，沉默棉花非特異抗性基因GhNDR1和絲裂原活化蛋白激酶的激酶GhMKK2降低了棉花對(duì)黃萎病的抗性^[11]。沉默棉花病原體相關(guān)分子模式調(diào)節(jié)因子GhBAK1導(dǎo)致細(xì)胞死亡，同時(shí)產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species， ROS），從而使棉花品系CA4002對(duì)黃萎病產(chǎn)生抗性^[12]。鈣依賴蛋白激酶GhCPK28-A10（Gh_A10G086300）負(fù)調(diào)控棉花對(duì)黃萎病的抗性反應(yīng)^[13]，而且GhCPK28（由Gh_A11G186100編碼）可以與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶GhPBL9和核糖體蛋白GhRPL12C相互作用，激活調(diào)控棉花黃萎病抗性的潛在分子靶點(diǎn)^[14]。GhDIR參與木質(zhì)素的形成，與植物對(duì)病原菌的防御反應(yīng)有關(guān)^[15]。Sun等^[16]利用VIGS技術(shù)發(fā)現(xiàn)，沉默GhADF6增加了根細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白的豐度，增強(qiáng)棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗性。Zhao等^[17]發(fā)現(xiàn)，抑制GhRDUF4D基因表達(dá)導(dǎo)致植株對(duì)黃萎病菌的抗性減弱。然而，目前關(guān)于棉花對(duì)大麗輪枝菌入侵的防御反應(yīng)機(jī)制尚不十分清楚^[18]。

為應(yīng)對(duì)病原菌入侵，植物已進(jìn)化出兩層天然免疫系統(tǒng)，即病原相關(guān)分子模式激發(fā)的免疫反應(yīng)（pattern-triggered immunity， PTI）和效應(yīng)子激發(fā)的免疫反應(yīng)（effector-triggered immunity， ETI）。胞質(zhì)鈣離子（Ca^2＋）的變化和ROS的爆發(fā)對(duì)激活PTI和ETI反應(yīng)具有重要意義^[19]。Ca^2＋作為1種重要的次級(jí)信使，幾乎參與非生物和生物應(yīng)激反應(yīng)中細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的各個(gè)方面^[20]。鈣調(diào)蛋白（calmo-dulin， CaM）、CaM相關(guān)蛋白（CaM-related proteins）、鈣依賴蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase， CDPK）和類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白（calcium B-like protein， CBL）是植物中4類主要的Ca^2＋傳感器^[21]。其中，CBL作為1類特殊的Ca^2＋傳感器，在植物非生物脅迫響應(yīng)中起著重要作用。例如，AtCBL1正調(diào)控?cái)M南芥對(duì)鹽和干旱脅迫的響應(yīng)^[22]。AtCBL9不僅影響植株對(duì)鹽脅迫和甘露醇的反應(yīng)，還調(diào)節(jié)滲透脅迫誘導(dǎo)的脫落酸（abscisic acid， ABA）積累^[23]。水稻（Oryza sativa）OsCBL8受多種脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，轉(zhuǎn)基因超表達(dá)植株的耐鹽性增強(qiáng)^[24]。玉米（Zea mays）ZmCBL4參與調(diào)控鹽脅迫引發(fā)的鈣信號(hào)，從而提高植株對(duì)鹽脅迫的耐受性^[25]。然而，目前關(guān)于CBL在防御病原菌入侵方面的研究報(bào)道較少。

本課題組前期用黃萎病致病菌V991接種陸地棉標(biāo)準(zhǔn)品系TM-1，以篩選黃萎病抗性相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)Gh_A01G0740受棉花黃萎病菌強(qiáng)烈誘導(dǎo)。序列比對(duì)分析表明，該基因與擬南芥AtCBL3基因高度同源，而且該基因在陸地棉TM-1基因組中共有4個(gè)同源序列，將其命名為GhCBL3-A01?；诖?，本研究進(jìn)一步分析了GhCBL3-A01的基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守基序和啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件，在黃萎病菌、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， MeJA）以及 H₂O₂脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平，然后通過(guò)VIGS技術(shù)下調(diào)GhCBL3-A01的表達(dá)，對(duì)該基因在棉花抗黃萎病中的功能進(jìn)行初步分析，為豐富棉花抗病基因資源提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試植物材料及生長(zhǎng)條件。供試棉花材料為陸地棉標(biāo)準(zhǔn)品系TM-1。首先將TM-1的帶絨種子用98%的硫酸溶液浸泡，然后在清水中多次洗滌后晾干；用70%的乙醇溶液進(jìn)行表面消毒后用無(wú)菌水沖洗。每盆（直徑為7 cm，高8 cm）播種5粒，共18盆。播種后將材料移至溫室（28 ℃、16 h光照/8 h黑暗）生長(zhǎng)。

煙草材料為本氏煙（Nicotiana benthamiana），由新疆農(nóng)作物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室繁殖保存，并種植于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花樓光照培養(yǎng)室（28 ℃、16 h光照/8 h黑暗）。煙草每盆播種4粒，出苗后每盆留2株。

1.1.2 黃萎病菌。黃萎病菌強(qiáng)致病力的V991菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。用無(wú)菌去離子水將V991菌液稀釋至孢子含量為1×10⁶～1×10⁷mL^－1，作為接種棉花的孢子懸浮液。

1.1.3 供試載體和菌株。亞細(xì)胞定位載體pCAMBIA1302、煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus， TRV）載體、陽(yáng)性對(duì)照載體TRV-GhCLA1、大腸桿菌TOP10和農(nóng)桿菌菌株GV3101均由本課題組保存。

1.2 方法

1.2.1 GhCBL3-A01基因的克隆和序列分析。從棉花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站（https：//www.cottongen.org）^[26]獲得GhCBL3-A01基因的全長(zhǎng)序列。在TM-1葉片中擴(kuò)增GhCBL3-A01的全長(zhǎng)序列。通過(guò)序列比對(duì)得到GhCBL3-A01的3個(gè)同源基因（Gh_D01G0760， Gh_A04G0051和 Gh_A13G1099）的序列。使用DNAMAN軟件對(duì)這4個(gè)同源基因的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析。利用在線網(wǎng)站GSDS2.0（http：//gsds.gao-lab.org/）和SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分別繪制4個(gè)同源基因的基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域。從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm. nih.gov/）獲得擬南芥AtCBL3、玉米ZmCBL3、小麥（Triticum aestivum）TaCBL3、水稻OsCBL3、油菜（Brassica napus）BnCBL3和煙草（Nicotiana tabacum）NtCBL3的蛋白序列，利用MEGA 5軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，設(shè)自展值（bootstrap value）為1 000，其他參數(shù)為系統(tǒng)默認(rèn)值。

1.2.2 亞細(xì)胞定位。擴(kuò)增GhCBL3-A01編碼序列，構(gòu)建pCAMBIA1302-35S：：GhCBL3-GFP融合表達(dá)載體，將該載體和空載體（pCAMBIA1302-35S-GFP）分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101。按照Tamara等^[27]的方法，將農(nóng)桿菌菌液接種至3周齡煙草葉片。避光處理2～5 d后在激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein， GFP）信號(hào)并拍照。

1.2.3 植物激素與脅迫處理。用灌根法將V991懸浮液（每盆30 mL）施入4周齡棉株的培養(yǎng)盆中，采集處理后0 h、0.5 h、2 h、6 h、12 h和24 h的根系樣品。分別用200 μmol·L^－1MeJA和1 mmol·L^－1 H₂O₂噴施葉片，每盆用量均為50 mL，于處理后0 h、0.5 h、1 h 、2 h 和 3 h采集根系樣品^[6]。上述所有處理均以3份樣本混合作為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理重復(fù)3次，以等量清水處理作為對(duì)照（Mock）。將樣品迅速放在液氮中，于－80 ℃保存用于后續(xù)提取RNA。

1.2.4 基因表達(dá)分析。采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441，天根生化科技有限公司）提取RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒EasyScript?? One-Step gDNA Removal和cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）制備cDNA。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，根據(jù)ABM熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)，以陸地棉泛素基因GhUBQ7（DQ116441）為內(nèi)參基因，使用Applied Biosystems StepOne熒光定量?jī)x［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction， qRT-PCR），用2^－ΔΔC_t法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。所用引物信息見(jiàn)附表1。

1.2.5 VIGS實(shí)驗(yàn)。利用primer 5.0軟件在GhCBL3-A01基因的第303個(gè)堿基至終止子區(qū)設(shè)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為378 bp的特異引物。將此特異片段連接至VIGS載體中。分別將TRV：：GhCBL3-A01載體和陽(yáng)性對(duì)照載體TRV：：GhCLA1與TRV：：RNA1載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101，并于－80 ℃儲(chǔ)存。待棉花幼苗生長(zhǎng)至子葉完全展開(kāi)時(shí)，參照邵武奎等^[13]的方法分別將農(nóng)桿菌菌液注射至棉花幼苗子葉中，23 ℃黑暗處理24 h后正常培養(yǎng)。重復(fù)3次以上，每次重復(fù)至少注射120個(gè)植株。

1.2.6 棉花植株抗病性分析。VIGS處理大約14 d后，當(dāng)TRV：：GhCLA1陽(yáng)性對(duì)照棉株出現(xiàn)白化表型時(shí)，用qRT-PCR檢測(cè)TRV：：00和TRV：：GhCBL3-A01葉片中GhCBL3-A01的相對(duì)表達(dá)量。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的大約90株棉花幼苗用灌根法接種V991孢子懸浮液。接種后16 d和20 d，調(diào)查植株的發(fā)病情況，并計(jì)算病株率和病情指數(shù)（disease index， DI）。病株率＝發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100%。病情指數(shù)＝∑（各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)病級(jí)值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí)值）×100。相應(yīng)的病級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)為植株無(wú)癥狀表現(xiàn)；1級(jí)為1～2片真葉發(fā)病；2級(jí)為3～4片真葉發(fā)?。?級(jí)為4片以上真葉發(fā)病或脫落；4級(jí)為全株枯死^[28]。

取子葉節(jié)下方1 cm處莖段置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar， PDA）培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，觀察莖段上黃萎病菌的生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)被感染的莖段數(shù)量。對(duì)照植株和沉默植株分別采集30個(gè)莖段。對(duì)采集的莖段進(jìn)行剖稈，觀察維管束褐變情況并拍照。

提取對(duì)照植株和沉默植株的莖段DNA，利用真菌特異性 ITS1-F引物與V. dahliae特異性引物 ST-VE1-R進(jìn)行qRT-PCR，檢測(cè)黃萎病菌V991 DNA的相對(duì)豐度，以GhUBQ7作為內(nèi)參（引物序列見(jiàn)附表1）。

1.2.7 ROS測(cè)定和相關(guān)基因的表達(dá)分析。接種V991后24 h，取TRV：：00 和 TRV：：GhCBL3-A01植株的第2片真葉，每個(gè)材料至少選擇3株。參考Li等^[29]的方法分別用3，3- 鹽酸二氨基聯(lián)苯胺（3，3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride， DAB-HCl）和臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色。在顯微鏡下觀察葉片顏色的變化情況。

取接種V991后24 h的棉花葉片，通過(guò)qRT-PCR分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。NPR1（Gh_A08G2190）、PDF1.2（Gh_D01G2290）、 PR1 （Gh_A12G0274）和PR4 （Gh_D13G1816）這4個(gè)抗病相關(guān)基因和JA信號(hào)通路相關(guān)基因AOS1（Gh_D05G2484）、OPR3（Gh_D05G0339）、MYC2（Gh_A08G1412）和LOX2（Gh_A05G0552）的引物序列見(jiàn)附表1，以GhUBQ7為內(nèi)參基因，方法同1.2.4，重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

用Microsoft Excel 2019軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhCBL3-A01的生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式分析

與未接菌的對(duì)照相比，GhCBL3-A01基因在接種黃萎病菌后2 h、6 h、12 h和24 h表達(dá)量顯著升高，推測(cè)GhCBL3-A01可能參與調(diào)控棉花黃萎病抗性（圖1A）。序列分析表明，GhCBL3-A01基因編碼區(qū)全長(zhǎng)681 bp，編碼含有226個(gè)氨基酸殘基的多肽。經(jīng)預(yù)測(cè)，GhCBL3-A01蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為25.9 ku，等電點(diǎn)為4.77。GhCBL3-A01及其在陸地棉中的3個(gè)同源基因均含有8個(gè)外顯子、7個(gè)內(nèi)含子（附圖1）。這4個(gè)同源基因編碼的蛋白均含有3個(gè)典型的EF-hand（EFh）結(jié)構(gòu)域（附圖2）。蛋白序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)GhCBL3-A01與GhD01G0760編碼蛋白的序列一致性為99.71%，GhCBL3-A01與擬南芥AtCBL3序列相似性也較高（附圖3）。對(duì)蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，與GhCBL3-A01序列最接近的蛋白是GhD01G0760編碼蛋白、BnCBL3和AtCBL3，而GhCBL3-A01的其他2個(gè)同源基因（GhA04G0051和GhA13G1099）編碼的蛋白分別與AtCBL4、AtCBL8和AtCBL5的關(guān)系更為密切（圖1B）。

利用qRT-PCR分析GhCBL3-A01在MeJA和H₂O₂處理后棉花幼苗根系中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，GhCBL3-A01的表達(dá)量受MeJA和H₂O₂的影響。MeJA處理后1 h和2 h，GhCBL3-A01的表達(dá)量顯著高于對(duì)照處理（圖1C）。H₂O₂處理后0.5 h，GhCBL3-A01的表達(dá)量顯著低于對(duì)照處理；H₂O₂處理后2 h，GhCBL3-A01的表達(dá)量顯著高于對(duì)照處理（圖1D）。以上結(jié)果表明GhCBL3-A01受V991、MeJA和H₂O₂誘導(dǎo)表達(dá)，可能通過(guò)JA信號(hào)通路參與對(duì)棉花黃萎病的防御反應(yīng)。

2.2 GhCBL3-A01亞細(xì)胞定位分析

在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)GhCBL3-A01，GhCBL3-A01-GFP融合蛋白的熒光分布在煙草葉片表皮細(xì)胞質(zhì)膜，對(duì)照處理的熒光分布在細(xì)胞質(zhì)膜（圖2），表明GhCBL3-A01蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。

2.3 沉默GhCBL3-A01增強(qiáng)棉花對(duì)黃萎病的抗性

為進(jìn)一步探究GhCBL3-A01在棉花黃萎病抗性中的功能，采用VIGS技術(shù)降低GhCBL3-A01的表達(dá)。侵染后14 d，陽(yáng)性對(duì)照TRV：：GhCLA1棉株新展開(kāi)的真葉出現(xiàn)白化表型，表明VIGS系統(tǒng)在本實(shí)驗(yàn)條件下是有效的（圖3A）。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)GhCBL3-A01在TRV：：00和TRV：：GhCBL3-A01植株葉片中的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)TRV：：GhCBL3-A01植株中GhCBL3-A01的表達(dá)量極顯著降低（圖3B）。

棉花三葉期接種黃萎病菌V991。接種病原菌后16 d，TRV：：00植株葉片萎蔫和黃化的程度比TRV：：GhCBL3-A01植株更嚴(yán)重（圖3C）。接種V991后16 d，TRV：：00和TRV：：GhCBL3-A01的病株率分別為50.55%和36.54%，病情指數(shù)分別為34.55和22.74，均存在顯著差異；接種V991后21 d，TRV：：00和TRV：：GhCBL3-A01的病株率分別為72.05%和47.45%，病情指數(shù)分別為67.79和39.77，差異均極顯著（圖 3D～E）。TRV：：00植株莖稈維管束褐化程度比TRV：：GhCBL3-A01植株更明顯（圖3F）。莖段培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，TRV：：GhCBL3-A01有病菌繁殖的莖段數(shù)明顯低于TRV：：00植株（圖3G）。黃萎病菌豐度檢測(cè)顯示，在TRV：：GhCBL3-A01植株中檢測(cè)到的黃萎病真菌DNA水平極顯著低于TRV：：00植株（圖3H）。以上結(jié)果表明，沉默GhCBL3-A01增強(qiáng)了棉花對(duì)黃萎病的抗性，GhCBL3-A01是棉花黃萎病抗性的負(fù)調(diào)控因子。

2.4 GhCBL3-A01基因抗病機(jī)制分析

根據(jù)以上研究結(jié)果，GhCBL3-A01受H₂O₂誘導(dǎo)表達(dá)，且該基因負(fù)調(diào)控棉花對(duì)黃萎病菌的抗性。由此推測(cè)，沉默GhCBL3-A01可能影響ROS積累和細(xì)胞的氧化狀態(tài)，進(jìn)而增強(qiáng)棉株的黃萎病抗性。為證實(shí)這一推測(cè)，用DAB 進(jìn)行染色，檢測(cè)黃萎病菌侵染后TRV：：00和TRV：：GhCBL3-A01幼苗葉片的ROS積累情況，發(fā)現(xiàn)TRV：：GhCBL3-A01的葉片中褐色斑點(diǎn)更多（圖4A）。臺(tái)盼藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)相較TRV：：GhCBL3-A01，TRV：：00的葉片出現(xiàn)更多的藍(lán)色斑點(diǎn)聚集（圖4B）。表明GhCBL3-A01基因沉默棉株葉片中ROS積累增多，細(xì)胞死亡減少。這進(jìn)一步證實(shí)沉默GhCBL3-A01會(huì)影響黃萎病菌侵染后棉花葉片中ROS積累，進(jìn)而有助于提高棉花的抗病性。

與清水處理相比，接種V991后TRV：：00及TRV：：GhCBL3-A01植株中NPR1、PDF1.2、PR1和PR4這4個(gè)防御相關(guān)基因的表達(dá)量均增加。接種V991后，與對(duì)照TRV：：00相比，NPR1、PDF1.2、PR1和PR4 這4個(gè)防御相關(guān)基因在TRV：： GhCBL3-A01棉株中的表達(dá)水平顯著升高。而清水處理下，TRV：：00和TRV：：GhCBL3-A01植株中PDF1.2、PR1和PR4的表達(dá)量無(wú)顯著差異，TRV：：GhCBL3-A01植株中NPR1的表達(dá)量顯著高于TRV：：00（圖 4C～F）。與清水處理相比，接種V991后TRV：：00與TRV：：GhCBL3-A01植株中JA信號(hào)通路相關(guān)基因AOS1、OPR3 和MYC2的表達(dá)量增加，而LOX2的表達(dá)量降低。在清水處理及接種V991后，TRV：：GhCBL3-A01植株中AOS1、OPR3、MYC2和LOX2的表達(dá)量均顯著高于TRV：：00植株（圖 4G～J）。上述結(jié)果表明在黃萎病菌處理下，沉默GhCBL3-A01導(dǎo)致防御相關(guān)基因和JA信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，從而增強(qiáng)了棉花植株的抗病性。

3 討論

Ca^2＋作為1種重要的次級(jí)信使，廣泛參與非生物和生物應(yīng)激反應(yīng)中的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。Ca^2＋傳感器蛋白CBL參與不同的生物學(xué)過(guò)程^[21]。本研究發(fā)現(xiàn)GhCBL3-A01參與調(diào)節(jié)棉花對(duì)黃萎病菌的抗性。黃萎病菌V991侵染后，GhCBL3-A01的表達(dá)水平先升高后降低，表明GhCBL3-A01是黃萎病菌的應(yīng)答基因。JA和H₂O₂處理均可誘導(dǎo)GhCBL3-A01的表達(dá)。已有研究表明JA在植物對(duì)病原菌侵染的先天性免疫應(yīng)答中起著重要作用^[30]，JA信號(hào)的改變可影響植株對(duì)黃萎病菌的抗性^[31]。鈣依賴蛋白激酶GhCPK33可以磷酸化GhOPR3導(dǎo)致后者的穩(wěn)定性降低，從而抑制JA的生物合成，負(fù)調(diào)控黃萎病抗性^[6]。BIN2與JAZ蛋白相互作用并在植物對(duì)黃萎病菌的防御反應(yīng)中起負(fù)調(diào)控作用^[32]。外源施用JA可誘導(dǎo)擬南芥葉片中胞質(zhì)游離Ca^2＋濃度增加^[33]。由于JA通常誘導(dǎo)產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性，推測(cè)GhCBL3-A01可能參與棉花對(duì)黃萎病的響應(yīng)并通過(guò) JA信號(hào)途徑發(fā)揮作用。植物免疫應(yīng)答涉及ROS信號(hào)通路，激活細(xì)胞外ROS的產(chǎn)生，引起激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)與局部細(xì)胞死亡，即超敏反應(yīng)^[34]。CDPK可以感知細(xì)胞質(zhì)Ca^2＋信號(hào)，CDPK5和激酶BIK1不僅正調(diào)控flg22引發(fā)的Ca^2＋內(nèi)流，而且直接磷酸化還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADPH）氧化酶RBOHD以激活ROS的產(chǎn)生^[35]。本研究中，與對(duì)照相比，GhCBL3-A01基因沉默棉花葉片在黃萎病菌侵染后ROS的積累明顯增加，細(xì)胞死亡減少。因此，GhCBL3-A01在棉花黃萎病抗性響應(yīng)中的功能可能與ROS的積累有關(guān)。

接種V991后，與TRV：：GhCBL3-A01植株相比，TRV：：00植株的萎蔫和黃化更為嚴(yán)重，維管束褐化明顯，且病株率和病情指數(shù)顯著升高，TRV：：00植株中檢測(cè)到的黃萎病真菌DNA水平顯著高于TRV：：GhCBL3-A01植株，說(shuō)明GhCBL3-A01負(fù)調(diào)控棉花黃萎病抗性。研究發(fā)現(xiàn)，植物一旦感知到入侵的病原體，就會(huì)分泌蛋白質(zhì)進(jìn)入外質(zhì)體，植物免疫系統(tǒng)可識(shí)別保守的分子模式進(jìn)而引發(fā)一系列的免疫反應(yīng)^[36]。病原相關(guān)蛋白PR1與煙草對(duì)卵菌病原菌的抗性有關(guān)^[37]。幾丁質(zhì)酶PR4是1種內(nèi)源性植物防御酶，參與產(chǎn)生防御相關(guān)的信號(hào)分子^[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，TRV：：GhCBL3-A01棉花植株受到黃萎病菌侵染后，抗病相關(guān)基因PR1、PR4、NPR1和PDF1.2的表達(dá)水平明顯上升。MeJA處理后，GhCBL3-A01的表達(dá)量明顯上調(diào)。接種V991后，TRV：：GhCBL3-A01植株中JA信號(hào)通路相關(guān)基因AOS1、OPR3和MYC2的表達(dá)量增加，而LOX2的表達(dá)量降低，但均顯著高于對(duì)照TRV：：00植株，表明沉默GhCBL3-A01可能會(huì)影響JA信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)及JA信號(hào)通路，但GhCBL3-A01參與JA信號(hào)通路的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

黃萎病菌、MeJA及H₂O₂處理均可誘導(dǎo)GhCBL3-A01表達(dá)。利用VIGS技術(shù)抑制GhCBL3-A01的表達(dá)可提高棉花對(duì)黃萎病的抗性，導(dǎo)致葉片ROS積累量增加，接種V991后防御相關(guān)基因和JA信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照植株。說(shuō)明GhCBL3-A01通過(guò)調(diào)節(jié)ROS積累、防御相關(guān)基因和JA信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)負(fù)調(diào)控棉花黃萎病抗性。

附圖附表：

詳見(jiàn)本刊網(wǎng)站（http：//journal.cricaas.com.cn/）本文網(wǎng)頁(yè)版。

附表1 本研究所用的引物序列

Table S1 Primer sequences used in this study

附圖1 GhCBL3-A01及其同源基因的結(jié)構(gòu)

Fig. S1 Structures of GhCBL3-A01 and its homologous genes

附圖2 GhCBL3-A01及其同源蛋白的保守結(jié)構(gòu)域

Fig. S1 Conserved domains of GhCBL3-A01 and its homologous proteins

附圖3 GhCBL3-A01同源蛋白的多序列比對(duì)

Fig. S3 Multiple sequence alignment of GhCBL3-A01 homologous proteins

參考文獻(xiàn)：

[1] 林玲， 張昕， 鄧晟. 棉花黃萎病研究進(jìn)展[J/OL]. 棉花學(xué)報(bào)， 2014， 26（3）： 260-267[2023-11-10]. https：//doi.org/10.11963/cs140310.Lin Ling， Zhang Xin， Deng Sheng. Research advances in cotton Verticillium wilt[J/OL]. Cotton Science， 2014， 26（3）： 260-267[2023-11-10]. https：//doi.org/10.11963/cs140310.

[2] Shaban M， Miao Y H， Ullah A， et al. Physiological and molecular mechanism of defense in cotton against Verticillium dahliae[J/OL]. Plant Physiology and Biochemistry， 2018， 125： 193-204[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1016/j.plaphy.2018.02.011.

[3] Li T G， Wang B L， Yin C M， et al. The Gossypium hirsutum TIR-NBS-LRR gene GhDSC1 mediates resistance against Verticillium wilt[J/OL]. Molecular Plant Pathology， 2019， 20（6）： 857-876[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1111/mpp.12797.

[4] Gao X Q， Xin C X， Lin W W， et al. Bifurcation of Arabidopsis NLR immune signaling via Ca²⁺-dependent protein kinases[J/OL]. PLoS Pathogens， 2013， 9（1）： e1003127[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1371/journal.ppat.1003127.

[5] Yang C L， Liang S， Wang H Y， et al. Cotton major latex protein 28 functions as a positive regulator of the ethylene responsive factor 6 in defense against Verticillium dahliae[J/OL]. Molecular Plant， 2015， 8： 399-411[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1016/j.molp.2014.11.023.

[6] Hu Q， Zhu L F， Zhang X N， et al. GhCPK33 negatively regulates defense against Verticillium dahliae by phosphorylating GhOPR3[J/OL]. Plant Physiology， 2018， 178（2）： 876-889[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1104/pp.18.00737.

[7] 賀浪， 張華崇， 司寧， 等. 陸地棉GhBZR1基因的克隆及功能研究[J/OL]. 棉花學(xué)報(bào)， 2021， 33（6）： 435-447[2023-11-10]. https：//doi.org/10.11963/cs20200083.He Lang， Zhang Huachong， Si Ning， et al. Cloning and functional analysis of GhBZR1 in Gossypium hirsutum L.[J/OL]. Cotton Science， 2021， 33（6）： 435-447[2023-11-10]. https：//doi.org/10.11963/cs20200083.

[8] 周雪慧， 高二林， 王鈺靜， 等. GhROP6通過(guò)調(diào)控茉莉酸合成與木質(zhì)素代謝參與棉花抗黃萎病反應(yīng)[J/OL]. 棉花學(xué)報(bào)， 2022， 34（2）： 79-92[2023-11-10]. https：//doi.org/10.11963/cs20210047.Zhou Xuehui， Gao Erlin， Wang Yujing， et al. GhROP6 involved in cotton resistance to Verticillium wilt through regulating jasmonic acid synthesis and lignin metabolism[J/OL]. Cotton Science， 2022， 34（2）： 79-92[2023-11-10]. https：//doi.org/10.11963/cs20210047.

[9] 李秀青， 王倩， 胡子曜， 等. GhMAPKKK2基因在棉花抗黃萎病中的功能分析[J/OL]. 棉花學(xué)報(bào)， 2022， 34（1）： 1-11[2023-11-10]. https：//doi.org/10.11963/cs20210068.Li Xiuqing， Wang Qian， Hu Ziyao， et al. Functional analysis of GhMAPKKK2 gene in cotton resistance to Verticillium wilt[J/OL]. Cotton Science， 2022， 34（1）： 1-11[2023-11-10]. https：//doi.org/10.11963/cs20210068.

[10] 沈吉麗， 肖勝華， 惠慧， 等. GhMYB43負(fù)調(diào)控木質(zhì)素的生物合成和茉莉酸信號(hào)[J/OL]. 棉花學(xué)報(bào)， 2020， 32（6）： 522-537[2023-11-10]. https：//doi.org/10.11963/1002-7807.sjlzlf.20200907.Shen Jili， Xiao Shenghua， Xi Hui， et al. GhMYB43 negatively regulates lignin biosynthesis and jasmonic acid signaling[J/OL]. Cotton Science， 2020， 33（6）： 435-447[2023-11-10]. https：//doi.org/10.11963/1002-7807.sjlzlf.20200907.

[11] Gao X Q， Wheeler T， Li Z H， et al. Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromises cotton resistance to Verticillium wilt[J/OL]. The Plant Journal， 2011， 66： 293-305[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1111/j.1365-313X.2011.04491.x.

[12] Gao X Q， Li F J， Li M Y， et al. Cotton GhBAK1 mediates Verticillium wilt resistance and cell death[J/OL]. Journal of Integrative Plant Biology， 2013， 55（7）： 586-596[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1111/jipb.12064.

[13] 邵武奎， 趙準(zhǔn)， 胡文冉， 等. 陸地棉鈣依賴蛋白激酶GhCDPK28-A10參與抗黃萎病的功能分析[J/OL]. 棉花學(xué)報(bào)， 2023， 35（1）： 17-28[2023-11-10]. https：//doi.org/10.11963/cs20220047.Shao Wukui， Zhao Zhun， Hu Wenran， et al. Functional analysis of cotton calcium-dependent protein kinase GhCDPK28-A10 involved in resistance to Verticillium wilt[J/OL]. Cotton Science， 2023， 35（1）： 17-28[2023-11-10]. https：//doi.org/10.11963/cs20220047.

[14] Wu Y J， Zhang L， Zhou J L， et al. Calcium-dependent protein kinase GhCDPK28 was identified and involved in Verticillium wilt resistance in cotton[J/OL]. Front Plant Sciences， 2021， 12： 772649[2023-11-10]. https：//doi.org/10.3389/fpls.2021.772649.

[15] 趙付安， 房衛(wèi)平， 楊曉杰， 等. 陸地棉D(zhuǎn)irigent-like基因 （GhDIR） 的克隆與分析[J/OL]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)， 2011， 26（5）： 29-33[2023-11-10]. https：//doi.org/10.7668/hbnxb.2011.05.007.Zhao Fuan， Fang Weiping， Yang Xiaojie， et al. Cloning and analysis of upland cotton （Gossypium hirsutum） dirigent-like gene （GhDIR） [J/OL]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica， 2011， 26（5）： 29-33[2023-11-10]. https：//doi.org/10.7668/hbnxb.2011.05.007.

[16] Sun Y D， Zhong M M， Li Y B， et al. GhADF6-mediated actin reorganization is associated with defense against Verticillium dahliae infection in cotton[J/OL]. Molecular Plant Pathology， 2021， 22（12）： 1656-1667[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1111/mpp.13137.

[17] Zhao Y P， Shen J L， Li W J， et al. Evolutionary and characteristic analysis of RING-DUF1117 E3 ubiquitin ligase genes in Gossypium discerning the role of GhRDUF4D in Verticillium dahliae resistance[J/OL]. Biomolecules， 2021， 11（8）： 1145[2023-11-10]. https：//doi.org/10.3390/biom11081145.

[18] Yang J， Wang X F， Xie M X， et al. Proteomic analyses on xylem sap provides insights into the defense response of Gossypium hirsutum against Verticillium dahliae[J/OL]. Journal of Proteomics， 2020， 213： 103599[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1016/j.jprot.2019.103599.

[19] Yang J， Zhang Y， Wang X F， et al. HyPRP1 performs a role in negatively regulating cotton resistance to V. dahliae via the thickening of cell walls and ROS accumulation[J/OL]. BMC Plant Biology， 2018， 18： 339[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1186/s12870-018-1565-1.

[20] Bender K W， Snedden W A. Calmodulin-related proteins step out from the shadow of their namesake[J/OL]. Plant Physiology， 2013， 163： 486-495[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1104/pp.113.221069.

[21] Manik S M N， Shi S J， Mao J J， et al. The calcium sensor CBL-CIPK is involved in plants response to abiotic stresses[J/OL]. International Journal of Genomics， 2015， 2015： 493191[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1155/2015/493191.

[22] Cheong Y H， Kim K N， Pandey G K， et al. CBL1， a calcium sensor that differentially regulates salt， drought， and cold responses in Arabidopsis[J/OL]. The Plant Cell， 2003， 15： 1833-1845[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1105/tpc.012393.

[23] Pandey G K， Cheong Y H， Kim K N， et al. The calcium sensor calcineurin B-like 9 modulates abscisic acid sensitivity and biosynthesis in Arabidopsis[J/OL]. The Plant Cell， 2004， 16： 1912-1924[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1105/tpc.021311.

[24] Gu Z M， Ma B J， Jiang Y， et al. Expression analysis of the calcineurin B-like gene family in rice （Oryza sativa L.） under environmental stresses[J/OL]. Gene， 2008， 415： 1-12[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1016/j.gene.2008.02.011.

[25] Wang M Y， Gu D， Liu T S， et al. Overexpression of a putative maize calcineurin B-like protein in Arabidopsis confers salt tolerance[J/OL]. Plant Molecular Biology， 2007， 65： 733-746[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1007/s11103-007-9238-8.

[26] Zhang T Z， Hu Y， Jang W K， et al. Sequencing of allotetraploid cotton （Gossypium hirsutum L. acc. TM-1） provides a resource for fiber improvement[J/OL]. Nature Biotechnology， 2015， 33： 531-537[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1038/nbt.3207.

[27] Tamara P， Roman P， Viktor Z. Subcellular localization of Arabidopsis pathogenesis-related 1 （PR1） protein[J/OL]. International Journal of Molecular Sciences， 2017， 18： 825[2023-11-10]. https：//doi.org/10.3390/ijms18040825.

[28] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部種子管理局. 棉花黃萎病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程： NY/T 2952－2016[S]. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2016.Seed Administration of the Ministry of Agriculture of the Peoples Republic of China. Technical specification for evaluating resistance to Verticillium wilt of cotton： NY/T 2952－2016[S]. Beijing： China Standards Press， 2016.

[29] Li Y B， Han L B， Wang H Y， et al. The thioredoxin GbNRX1 plays a crucial role in homeostasis of apoplastic reactive oxygen species in response to Verticillium dahliae infection in cotton[J/OL]. Plant Physiology， 2016， 170（4）： 2392－2406[2023-11-10]. https：//doi/10.1104/pp.15.01930.

[30] Zhu Y T， Hu X Q， Wang P， et al. GhODO1， an R2R3-type MYB transcription factor， positively regulates cotton resistance to Verticillium dahliae via the lignin biosynthesis and jasmonic acid signaling pathway[J/OL]. International Journal of Biological Macromolecules， 2022， 201： 580-591[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2022.01.120.

[31] Jiang Y， Yu D Q. The WRKY57 transcription factor affects the expression of jasmonate ZIM-domain genes transcriptionally to compromise botrytis cinerea resistance[J/OL]. Plant Physiology， 2016， 171： 2771-2782[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1104/pp.16.00747.

[32] Song Y， Zhai Y H， Li L X， et al. BIN2 negatively regulates plant defence against Verticillium dahliae in Arabidopsis and cotton[J/OL]. Plant Biotechnology Journal， 2021， 19： 2097-2112[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1111/pbi.13640.

[33] Sun Q P， Guo Y， Sun Y， et al. Influx of extracellular Ca²⁺involved in jasmonic-acid-induced elevation of [Ca²⁺]cyt and JR1 expression in Arabidopsis thaliana[J/OL]. Journal of Plant Research， 2006， 119： 343-350[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1007/s10265-006-0279-x.

[34] Locato V， De Gara L. Programmed cell death in plants： an overview[J/OL]. Methods Molecular Biology， 2018， 1743： 1-8[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1007/978-1-4939-7668-3_1.

[35] Dubiella U， Seybold H， Durian G， et al. Calcium-dependent protein kinase/NADPH oxidase activation circuit is required for rapid defense signal propagation[J/OL]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2013， 110： 8744-8749[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1073/pnas.1221294110.

[36] Doehlemann G， Hemetsberger C. Apoplastic immunity and its suppression by filamentous plant pathogens[J/OL]. New Phytologist， 2013， 198： 1001-1016[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1111/nph.12277.

[37] Hugot K， Rivière M P， Moreilhon C， et al. Coordinated regulation of genes for secretion in tobacco at late developmental stages： association with resistance against oomycetes[J/OL]. Plant Physiology， 2004， 134： 858-870[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1104/pp.103.034173.

[38] van Loon L C， Rep M， Pieterse C M. Significance of inducible defense related proteins in infected plants[J/OL]. Annual Review Phytopathology， 2006， 44： 135-162[2023-11-10]. https：//doi.org/10.1146/annurev.phyto.44.070505.143425.

（責(zé)任編輯：王小璐? ? 責(zé)任校對(duì)：秦凡）

收稿日期：2023-11-23? ? ? ? ? ?第一作者簡(jiǎn)介：高升旗（1984―），男，助理研究員，gaoshengqi@xaas.ac.cn。? ?*通信作者：hquansheng@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金——新疆聯(lián)合基金（U1703114）；中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目（ZYYD2022B07）