薄層色譜技術(shù)在中獸藥鑒別檢驗(yàn)中的問(wèn)題

楊 潔，付國(guó)平，崔榮飛，呂 潔，劉 偉，陳佳靜，朱子晨，趙義良*

(1.石家莊市畜產(chǎn)品和獸藥飼料質(zhì)量檢測(cè)中心 050040；2.石家莊市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì) 050000；3.石家莊市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 050000；4.石家莊市藁城區(qū)畜牧工作總站 052160）

中獸藥的質(zhì)量直接關(guān)系到養(yǎng)殖動(dòng)物的用藥安全，從而關(guān)系到食品安全。中獸藥的鑒別主要采用顯微鑒別、光譜色譜和理化鑒別等。薄層色譜，或稱薄層層析（thin-layer chromatography，TLC），是色譜技術(shù)的一種，是將適宜的固定相涂布于支持板上，形成均勻薄層，以合適的溶劑為流動(dòng)相，對(duì)混合樣品進(jìn)行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術(shù)。通過(guò)對(duì)薄層色譜上是否存在斑點(diǎn)，能夠?qū)χ蝎F藥的真?zhèn)芜M(jìn)行準(zhǔn)確的判斷，斑點(diǎn)的顏色深淺程度以及大小等都能在一定程度上對(duì)藥品的優(yōu)劣作出判斷。與高效液相色譜法和氣相色譜法比較，薄層色譜操作簡(jiǎn)單，成本較低，色譜結(jié)果直觀。與紙層析法比較，薄層色譜靈敏度高，分離效果好，用時(shí)短，顯色方法多，可用腐蝕性顯色劑[1]。

薄層色譜技術(shù)從上世紀(jì)50 年代發(fā)展至今，仍被廣泛采用，是分析鑒別中獸藥的重要方法?！吨腥A人民共和國(guó)獸藥典》（2020 年版二部）中薄層色譜技術(shù)鑒別占鑒別方法80%以上[2-3]。

1 薄層色譜基本原理

薄層色譜法是一種吸附薄層色譜分離法，它利用各成分對(duì)同一吸附劑吸附能力不同，使在移動(dòng)相(溶劑)流過(guò)固定相(吸附劑)的過(guò)程中，連續(xù)的產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而達(dá)到各成分互相分離的目的。薄層層析可根據(jù)作為固定相的支持物不同，分為薄層吸附層析（吸附劑）、薄層分配層析(纖維素)、薄層離子交換層析（離子交換劑）、薄層凝膠層析（分子篩凝膠）等。一般實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較多的是以吸附劑為固定相的薄層吸附層析。

薄層色譜技術(shù)在中獸藥檢測(cè)中的應(yīng)用主要是鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測(cè)定，使用時(shí)將固定相均勻涂于玻璃板、塑料或鋁箔上，待成膜后，用點(diǎn)樣器吸取適當(dāng)樣品，點(diǎn)在薄層的起始線上，待干燥后，用適當(dāng)?shù)恼归_劑展開，待展開至一定距離后取出，晾干，噴顯色劑顯色。用硅膠和氧化鋁作支持劑，其主要原理是吸附力與分配系數(shù)的不同，使混合物得以分離。當(dāng)溶劑沿著吸附劑移動(dòng)時(shí)，帶著樣品中的各組分一起移動(dòng)，同時(shí)發(fā)生連續(xù)吸附與解吸作用以及反復(fù)分配作用。由于各組分在溶劑中的溶解度不同，以及吸附劑對(duì)它們的吸附能力的差異，最終將混合物分離成一系列斑點(diǎn)。如作為標(biāo)準(zhǔn)的化合物在層析薄板上一起展開，則可以根據(jù)這些已知化合物的Rf 值(溶質(zhì)移動(dòng)的距離/溶液移動(dòng)的距離)對(duì)各斑點(diǎn)的組分進(jìn)行鑒定。

2 薄層色譜檢測(cè)鑒別方法

雙黃連口服液是 《中華人民共和國(guó)獸藥典》（2020年版二部）修訂的獸藥品種，具有辛涼解表、清熱解毒的功能，主治犬、貓、雞感冒發(fā)熱。雙黃連口服液的鑒別（1）、（2）試驗(yàn)均使用薄層色譜法。

鑒別（1）：取雙黃連口服液1 mL，加75%乙醇5 mL，搖勻，作為供試品溶液。另取黃芪苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液；取綠原酸對(duì)照品，加75%乙醇制成每1 mL 含0.1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。取一聚酰胺薄膜，平鋪于潔凈玻璃板上，劃定起始線，用點(diǎn)樣器吸取上述3 種溶液各1～2 μL，點(diǎn)于起始點(diǎn)不同位置，晾干。取適量醋酸于展缸中，放入晾干的展板，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與黃芪苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置，顯相同顏色的斑點(diǎn)；在與綠原酸對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

鑒別（2）：取雙黃連口服液1 mL，加甲醇5 mL，搖勻，靜置，取上清液，作為供試品溶液。另取連翹對(duì)照藥材0.5 g，加水20 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液濃縮至近干，加甲醇5 mL 使溶解，搖勻，靜置，取上清液，作為對(duì)照藥材溶液。用取樣器吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（5∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置，顯相同顏色的斑點(diǎn)[4]。

3 檢測(cè)方法和注意要點(diǎn)

利用薄層色譜技術(shù)對(duì)中獸藥進(jìn)行鑒別時(shí)，容易精密度差以及重現(xiàn)性不足的情況，在一定程度上降低了檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.1 樣品處理

中獸藥樣品成分復(fù)雜，各成分之間干擾嚴(yán)重，有時(shí)難以很好的分離，樣品的前處理對(duì)中獸藥薄層色譜檢測(cè)很重要。韓易航等對(duì)清解合劑薄層色譜鑒別試驗(yàn)的前處理進(jìn)行了改進(jìn)，用毒性較小的乙醇代替毒性較大的甲醇和丙酮對(duì)樣品進(jìn)行前處理，分離效果好，斑點(diǎn)清晰、操作簡(jiǎn)單，試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，所用試劑更安全，對(duì)環(huán)境友好[5]。

3.2 薄層板

薄層板需要有一定的機(jī)械強(qiáng)度及化學(xué)惰性，且厚度均勻、表面平整。玻璃板最常用，有時(shí)還用塑料、鋁箔。常用的固定相有硅膠G、硅膠GF、硅膠H、硅膠HF，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化鋁、氧化鋁G、微晶纖維素、微晶纖維素F 等。固定相均勻涂布在玻璃板上，晾干后待用。為了良好的重現(xiàn)性，實(shí)驗(yàn)室一般直接采購(gòu)成品薄層板。不同廠家，不同批次的薄層板，質(zhì)量可能不同。應(yīng)在采購(gòu)一批新板子后，進(jìn)行質(zhì)量驗(yàn)收，合格后方可使用，并在實(shí)驗(yàn)記錄中標(biāo)明板子生產(chǎn)廠家，型號(hào)等信息。

薄層板可以自制也可使用成品，實(shí)驗(yàn)室一般直接采購(gòu)成品薄層板。不同廠家生產(chǎn)的薄層板，所用的硅膠粒度、性質(zhì)、粘合劑和制作工藝都不同，造成色譜行為的差異。實(shí)驗(yàn)時(shí)必須詳細(xì)記錄薄層板的類型、廠家、批號(hào)、實(shí)驗(yàn)溫度、濕度等信息，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性。

3.3 點(diǎn)樣

手動(dòng)點(diǎn)樣的點(diǎn)樣器最常用的是內(nèi)徑為0.5 mm 管口平整的點(diǎn)樣毛細(xì)管，有0.5 μL、1.0 μL、2.0 μL、5.0 μL、10.0 μL 等。

點(diǎn)樣直徑應(yīng)不超過(guò)5 mm，盡量減少溶劑擴(kuò)散，直徑應(yīng)盡量小。點(diǎn)樣距離一般為1～1.5 cm 即可。點(diǎn)樣量較大時(shí)應(yīng)特別注意點(diǎn)樣直徑和間距。點(diǎn)樣毛細(xì)管不能交叉使用。如需重復(fù)點(diǎn)樣，待溶劑揮發(fā)后才可繼續(xù)點(diǎn)樣?？梢韵扔勉U筆在薄層板上距一端2 cm 處輕輕劃線，作為起始線。在同一塊板子上點(diǎn)的樣品之間要有一定的距離，通常間距5 mm 以上。點(diǎn)樣要輕，不能破壞薄層板上的固定相。

也可使用全自動(dòng)點(diǎn)樣儀，可進(jìn)行接觸式點(diǎn)狀點(diǎn)樣，噴霧式帶狀、方形點(diǎn)樣；適用于不同厚度的薄層板，最大至4 mm；進(jìn)樣針規(guī)格有10 μL、25 μL、100 μL。全自動(dòng)點(diǎn)樣儀具有加熱功能。當(dāng)點(diǎn)樣量較大時(shí)，或是溶劑較難揮發(fā)(如水溶液)，可選擇加熱方式點(diǎn)樣，減少斑點(diǎn)擴(kuò)散。點(diǎn)樣臺(tái)的高度可以調(diào)節(jié)，可點(diǎn)不同厚度的薄層板，無(wú)需調(diào)節(jié)點(diǎn)樣頭。全自動(dòng)點(diǎn)樣儀占用空間少，吸樣、點(diǎn)樣等全部為一整體，節(jié)約人力和時(shí)間。

在點(diǎn)樣和用鉛筆在薄層板上劃線時(shí)，應(yīng)注意不要破壞薄層板涂層。樣品之間應(yīng)有一定的距離，至少5 mm，以免樣品交叉。點(diǎn)樣器為一次性耗材，點(diǎn)完一種藥品后應(yīng)更換。

新手制作的薄層色譜圖邊緣效應(yīng)嚴(yán)重、斑點(diǎn)拖尾，而有經(jīng)驗(yàn)者制作的薄層色譜圖無(wú)邊緣效應(yīng)、斑點(diǎn)無(wú)拖尾現(xiàn)象。檢測(cè)人員應(yīng)不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，以求得到較好的色譜圖。

3.4 展開

展開劑如果各成分比例發(fā)生變化，會(huì)造成色譜斑點(diǎn)明顯減少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此展開劑應(yīng)嚴(yán)格按照獸藥典檢測(cè)方法說(shuō)明的比例進(jìn)行配制，現(xiàn)用現(xiàn)配，不能重復(fù)使用。配制時(shí)按比例將各試劑放入三角瓶，充分混勻，備用。若需分層，則按藥典要求靜置，取所需的上層或下層使用。展開劑通常含有揮發(fā)性試劑，因此一般在通風(fēng)櫥中操作。

展開劑選擇的依據(jù)是根據(jù)溶劑極性大小，極性小的化合物用極性小的展開劑，極性大的則相反。在實(shí)際工作中，展開劑通常有2 種或2 種以上的溶劑，目的是調(diào)整展開劑的極性，改善色譜分離效果。Rf 值的范圍應(yīng)在0.2～0.7。展開劑根據(jù)其極性大小可分為3 種，弱極性溶劑體系：主要是正己烷和水，甲醇、乙醇或乙酸乙酯來(lái)調(diào)節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性，適用于生物堿、黃酮、萜類成分的分離；中等極性溶劑體系：主要是氯仿和水，甲醇、乙醇或乙酸乙酯等來(lái)調(diào)節(jié)極性，適用于蒽醌、香豆素和一些極性較大的木脂素和萜類成分的分離；強(qiáng)極性溶劑體系：主要是正丁醇和水，用甲醇、乙醇或乙酸乙酯等來(lái)調(diào)節(jié)極性，適用于極性很大的生物堿類成分的分離。

薄層色譜專用的展缸，常用的是直立式雙槽展缸。雙槽展缸使用方便，便于預(yù)平衡和濕度控制，節(jié)省展開劑。展開時(shí)展開劑液面需在點(diǎn)樣位置以下，展開劑使用前需充分混勻。展開后薄層板取出平放晾干，用鉛筆劃出展開劑前沿位置，距薄層板一端約2 cm。

展開缸應(yīng)適合薄層板的大小，配有嚴(yán)密的蓋子，底部平整光滑有雙槽。展開時(shí)應(yīng)在蓋子與展開缸連接處涂抹凡士林密封，防止展開劑逸出，影響展開效果。

展開前如需溶劑蒸氣預(yù)平衡，可在展開缸中加入適量的展開劑，密閉15～30 min，溶劑蒸氣預(yù)平衡后應(yīng)迅速放入載有供試品的薄層板，立即密閉，按照要求展開。

3.5 顯色

薄層板展開后，如果展開的化合物斑點(diǎn)本身有顏色，可以直接觀察，如果本身無(wú)色，可在紫外燈照射下觀察，看有無(wú)熒光斑點(diǎn)。如果以上方法都觀察不到斑點(diǎn)，則需要使用顯色劑使展開的斑點(diǎn)顯色。使用顯色劑的方法有噴霧法和浸漬法，噴霧法是最常用的方法。噴霧時(shí)將適當(dāng)?shù)娘@色劑裝入噴霧瓶，先對(duì)著通風(fēng)櫥試噴，待出霧成均勻細(xì)霧狀后再對(duì)展板噴霧，噴霧時(shí)噴霧瓶應(yīng)距展板有一定的距離。浸漬法是將展開后的薄層板垂直放入浸漬槽數(shù)秒鐘，浸漬槽為扁的玻璃槽，取出展板后擦干背面的展開劑，晾干。

顯色劑的選擇應(yīng)根據(jù)待檢化合物的性質(zhì)進(jìn)行，如成分未知，選擇硫酸作顯色劑或鐵氰化鉀-三氯化鐵試劑。前者與化合物產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)，按氧化程度不同呈現(xiàn)不同的顏色或熒光；后者與化合物反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色。已知成分選擇顯色好的顯色劑，醛酮類用2,4-二硝基苯肼，黃酮類用三氯化鋁乙醇溶液，氨基糖類用對(duì)二甲氨基苯甲醛。中獸藥檢測(cè)嚴(yán)格按照獸藥典要求規(guī)范操作即可。應(yīng)注意含有硫酸的顯色劑，對(duì)薄層板噴霧時(shí)應(yīng)控制用量，因?yàn)榱蛩嵋资贡影灏l(fā)黑，影響顯色效果。噴霧時(shí)應(yīng)均勻細(xì)致，噴霧不均勻也會(huì)影響顯色。

檢測(cè)儀器主要是紫外光燈，分365 nm 的長(zhǎng)波段和254 nm 的短波段。365 nm 波段主要用于觀察有熒光的色譜，254 nm 波段主要用于觀察硅膠GF254 板在熒光背景下的熒光淬滅暗色斑點(diǎn)[5]。

3.6 溫濕度

溫度影響有機(jī)溶劑的揮發(fā)，Rf 值隨溫度升高而增大。溫度會(huì)影響展開劑中各種溶劑蒸汽的比例，從而影響展開效果。因此應(yīng)控制實(shí)驗(yàn)室溫度，實(shí)驗(yàn)記錄中準(zhǔn)確記錄溫度。

濕度影響薄層板的吸附能力，從而影響分離效果。實(shí)驗(yàn)記錄中也應(yīng)準(zhǔn)確記錄空氣濕度。

4 討論

薄層色譜技術(shù)一直被很多分析工作者所關(guān)注，并被用于多個(gè)領(lǐng)域。但由于儀器的自動(dòng)化程度低、分辨率及重復(fù)性不理想等問(wèn)題，薄層色譜技術(shù)在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)都停留在定性和半定量的水平上。直到1970 年代開始，薄層色譜向儀器化、高效化發(fā)展，逐漸形成了儀器化、現(xiàn)代化薄層色譜。現(xiàn)今，隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，薄層色譜也出現(xiàn)了很多新的技術(shù)類型，除了普通薄層色譜，還有高效薄層色譜、棒狀薄層色譜(TLCFID)、加壓薄層色譜(OPLC)、離心薄層色譜(CTLC)、膠束薄層色譜(M-TLC)、包合薄層色譜(ICC)、二維薄層(2D TLC)、超薄層色譜(UTLC) 等；薄層色譜技術(shù)與其他定量技術(shù)聯(lián)用，有薄層-酸性染料比色法、薄層層析-紫外分光光度法、TLC-HPLC 法，可準(zhǔn)確定性定量一些復(fù)方中獸藥中的某些成分。薄層色譜也與現(xiàn)代高科技的分析技術(shù)相結(jié)合，如薄層色譜-傅立葉變換紅外光譜聯(lián)用檢測(cè)、薄層色譜-拉曼光譜聯(lián)用檢測(cè)、薄層色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)、薄層色譜-核磁共振聯(lián)用檢測(cè)、薄層色譜-電化學(xué)方法聯(lián)用檢測(cè)等，使其成為一種更靈敏、高效的分離分析方法。應(yīng)用領(lǐng)域涉及農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、橡膠工業(yè)、有機(jī)合成等，特別在醫(yī)藥領(lǐng)域中的藥物分析和中藥檢驗(yàn)方面使用較多，今后，薄層色譜法仍將是經(jīng)濟(jì)、可靠、快速的重要分析方法之一[7]。

薄層色譜有很明顯的優(yōu)點(diǎn)，設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、適用性廣、成本相對(duì)低廉、可比性好、分離快速，可以快速給出可靠、準(zhǔn)確的結(jié)果。薄層色譜也有其缺點(diǎn)，如儀器普及率低、設(shè)備不簡(jiǎn)單、結(jié)果重復(fù)性和穩(wěn)定性差、鑒別速度較慢、展開劑毒性較大。容易受到薄層板質(zhì)量、顯色劑用量、加熱條件、溫濕度等外界因素和操作人員熟練程度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果易產(chǎn)生誤差。我們對(duì)這些影響因素，應(yīng)采取有效的解決方案，以確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和流程規(guī)范性。因此，薄層色譜技術(shù)在中獸藥檢測(cè)中的應(yīng)用研究還需進(jìn)一步加強(qiáng)。