lncRNA NEAT1調(diào)節(jié)miR-15a-5p/HOXD10軸對子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響

聶桂蘭，范徐妃，王春茶，于輝蘭，范俊霞

lncRNA NEAT1調(diào)節(jié)miR-15a-5p/HOXD10軸對子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響

聶桂蘭1，范徐妃2，王春茶1，于輝蘭1，范俊霞1

1.金華市婦幼保健院產(chǎn)科，浙江金華 321000；2.金華市中心醫(yī)院產(chǎn)科，浙江金華 321000

探討長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）核富集轉(zhuǎn)錄本1（nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1）對子癇前期（preeclampsia，PE）滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響及分子機(jī)制。體外培養(yǎng)人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/Svneo，分為正常對照（NC）組、si-NC組、si-NEAT1組、si-NEAT1+anti-NC組和si-NEAT1+anti- miR-15a-5p組。采用四甲基偶氮唑藍(lán)法、流式細(xì)胞術(shù)和Transwell小室實驗檢測細(xì)胞增殖活性、凋亡和侵襲能力；實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測細(xì)胞中NEAT1、miR-15a-5p和同源盒基因D10（homeobox D10，HOXD10）mRNA表達(dá)；蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞中HOXD10和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白[鈣黏蛋白E（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）]的表達(dá)；雙熒光素酶報告基因和RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）實驗驗證HTR-8/Svneo細(xì)胞中NEAT1、miR-15a-5p和HOXD10的調(diào)控機(jī)制。敲減NEAT1可顯著促進(jìn)HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖、侵襲和EMT，抑制細(xì)胞凋亡，并上調(diào)miR-15a-5p表達(dá)，抑制HOXD10的mRNA和蛋白表達(dá)（<0.05）；下調(diào)miR-15a-5p的表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)NEAT1敲減對滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響（<0.05）。雙熒光素酶和RIP實驗證實NEAT1可靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控HTR-8/Svneo細(xì)胞中的miR-15a-5p，且HOXD10是miR-15a-5p的靶標(biāo)。敲減NEAT1可通過上調(diào)miR-15a-5p抑制HOXD10表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和侵襲，并抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡。

子癇前期；長鏈非編碼RNA；核富集轉(zhuǎn)錄本1；微RNA-15a-5p；同源盒基因D10；滋養(yǎng)細(xì)胞

子癇前期（preeclampsia，PE）是一種以高血壓、蛋白尿為主要特征的妊娠疾病，發(fā)生在妊娠20周后，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和新生兒死亡的主要原因之一[1]。絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞異常的細(xì)胞侵襲能力是PE發(fā)生發(fā)展的重要因素[2]，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在PE中發(fā)揮重要作用[3-4]，核富集轉(zhuǎn)錄本1（nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1）是lncRNA家族的活躍成員。據(jù)報道，NEAT1參與調(diào)控宮頸癌、乳腺癌和前列腺癌的發(fā)生和進(jìn)展[5-7]。研究顯示，NEAT1在PE中上調(diào)，并可能通過抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲促進(jìn)PE發(fā)展[8]。lncRNA可通過充當(dāng)微RNA（microRNA，miRNA）海綿參與基因調(diào)控，微RNA-15a-5p（microRNA- 15a-5p，miR-15a-5p）可抑制子宮內(nèi)膜癌和肺癌的發(fā)展[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-15a-5p在PE中下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[11]。生物信息學(xué)分析顯示，miR-15a-5p為NEAT1的潛在靶點，同源盒基因D10（homeobox D10，HOXD10）mRNA序列含有miR-15a-5p的結(jié)合位點。在PE中，HOXD10呈高表達(dá)，敲減HOXD10可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT[12]，表明HOXD10可能是PE中miR-15a-5p的潛在靶標(biāo)。以上研究提示NEAT1/ miR-15a-5p/HOXD10軸可能調(diào)節(jié)PE中滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲。因此，本研究以人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/Svneo為研究對象，分析NEAT1/miR- 15a-5p/HOXD10軸與滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)活性的關(guān)聯(lián)及該軸在PE發(fā)展中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/Svneo購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）；小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）陰性對照（si-NC）和NEAT1 siRNA（si-NEAT1）、miR-15a-5p mimic、miR-15a-5p inhibitor及其陰性對照（miR-NC、inhibitor-NC）購自廣州Ribobio公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（methylthiazolyltetrazolium，MTT）細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒、膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；Magna RIP? RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒購自美國Millipore公司；兔源一抗HOXD10、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）購自英國Abcam公司；鈣黏蛋白E（E- cadherin）、波形蛋白（vimentin）、神經(jīng)鈣黏素（N- cadherin）購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HTR-8/Svneo細(xì)胞接種在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件：37℃，5% CO2。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將HTR-8/SVneo細(xì)胞以1×105個細(xì)胞/孔的密度接種在6孔板上，生長并匯合到60%～70%。使用Lipofectamine? 3000轉(zhuǎn)染試劑將si-NEAT1、miR-15a-5p inhibitor和si-NC、inhibitor-NC分別轉(zhuǎn)染到HTR-8/SVneo細(xì)胞中，實驗分為正常對照組（NC組，未轉(zhuǎn)染）、si-NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-NEAT1組（轉(zhuǎn)染si-NEAT1）、si-NEAT1+anti-NC組（si-NEAT1與inhibitor-NC共轉(zhuǎn)染）、si-NEAT1+ anti-miR-15a-5p組（si-NEAT1與miR-15a-5p inhibitor共轉(zhuǎn)染）。轉(zhuǎn)染6h，然后在37℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中放置48h。隨后收集細(xì)胞，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測細(xì)胞中NEAT1、miR-15a-5p和HOXD10 mRNA的表達(dá)水平，并采用蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞中HOXD10蛋白表達(dá)，驗證轉(zhuǎn)染效果，并繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.3 細(xì)胞增殖活性檢測 轉(zhuǎn)染后，將HTR-8/Svneo細(xì)胞以5×103個細(xì)胞/孔接種到96孔板中，分別培養(yǎng)24、48和72h。隨后，向每孔中加入20μl 5mg/ml的MTT溶液，并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。之后加入150 μl二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），振搖15min。最后，使用酶標(biāo)儀檢測570nm處各孔的光密度（optical density，OD）。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測 用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并離心，向細(xì)胞中加入500μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞并將濃度調(diào)整為4×105個細(xì)胞/ml；隨后加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI，將細(xì)胞在黑暗中孵育30min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，激發(fā)波長488nm，F(xiàn)ITC檢測波長530nm，PI檢測波長575nm。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實驗 Transwell小室在37℃下用基質(zhì)凝膠包被30min，將轉(zhuǎn)染48h后的各組HTR-8/ Svneo細(xì)胞重懸于無血清培養(yǎng)基中。然后將200μl待測細(xì)胞懸液（1×104個細(xì)胞）置于上室，將含有10% FBS的600μl培養(yǎng)基放入下室。孵育48h后，取出Transwell小室，PBS沖洗3次，濕棉簽小心擦除上室底部膜表面的細(xì)胞，侵入膜下表面的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定并用0.1%結(jié)晶紫染色。使用光學(xué)顯微鏡對5個隨機(jī)選擇的視野中的染色細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，取平均值。

1.2.6 qRT-PCR 用TRizol試劑提取細(xì)胞的總RNA，隨后測定RNA濃度和純度，并通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。在ABI Prism?7500型熒光定量PCR儀上使用SYBR Green Super Mix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增RNA片段，評估NEAT1、miR- 15a-5p和HOXD10 mRNA表達(dá)水平。選擇GAPDH和U6作為lncRNA、mRNA和miRNA的內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計算靶基因的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法 收集細(xì)胞并使用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)（30μg）通過10%聚丙烯-酰氨凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。室溫下用5%脫脂牛奶封閉1h后，將膜與一抗在4°C下孵育過夜。然后與IgG二抗（1∶5000）在室溫下孵育1h。使用化學(xué)發(fā)光試劑顯影蛋白質(zhì)，用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達(dá)量。

1.2.8 靶基因預(yù)測和雙熒光素酶報告基因檢測 使用StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-15a-5p與NEAT1和HOXD10之間的結(jié)合位點；構(gòu)建野生型（WT）和突變型（MUT）重組報告質(zhì)粒（NEAT1-WT、HOXD10-WT、NEAT1-MUT、HOXD10-MUT）。使用Lipofectamine? 3000轉(zhuǎn)染試劑將NEAT1-WT、NEAT1-MUT或HOXD10-WT、HOXD10-MUT與miR-NC或miR-15a-5p mimic共轉(zhuǎn)染至HTR-8/Svneo細(xì)胞；HTR-8/Svneo細(xì)胞（2×105個細(xì)胞/孔）在6孔板中培養(yǎng)并在達(dá)到60%～70%融合時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48h后，收獲并裂解細(xì)胞，使用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)進(jìn)行熒光素酶測定，并將螢火蟲熒光素酶活性值標(biāo)準(zhǔn)化為海腎熒光素酶活性值。

1.2.9 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀測定 使用Magna RIP? RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）試劑盒驗證NEAT1與miR-15a-5p的結(jié)合。具體步驟：HTR-8/Svneo細(xì)胞在RIP裂解液中裂解。然后將包含Argonaute-2（Ago2）抗體或IgG抗體（作為陰性對照）的磁珠與細(xì)胞裂解物在4°C下孵育6h，提取免疫沉淀RNA，進(jìn)行qRT-PCR分析NEAT1與miR-15a-5p的富集。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 敲減NEAT1對HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖的影響

在48h和72h時，si-NEAT1組的OD值較NC組、si-NC組顯著降低（<0.05）；si-NEAT1+anti-miR- 15a-5p組的OD值較si-NEAT1組、si-NEAT1+anti-NC組顯著升高（<0.05），見表2。

2.2 敲減NEAT1對HTR-8/Svneo細(xì)胞凋亡和侵襲的影響

si-NEAT1組HTR-8/ Svneo細(xì)胞凋亡率較NC組、si-NC組顯著降低，侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加（<0.05）；si-NEAT1+anti-miR-15a-5p組HTR-8/Svneo細(xì)胞凋亡率較si-NEAT1組、si-NEAT1+anti-NC組顯著升高，侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少（<0.05），見表3。

2.3 敲減NEAT1對HTR-8/Svneo細(xì)胞中NEAT1、miR-15a-5p、HOXD10表達(dá)水平的影響

與NC組、si-NC組相比，si-NEAT1組HTR-8/ Svneo細(xì)胞中NEAT1、HOXD10 mRNA和HOXD10蛋白表達(dá)水平顯著降低，miR-15a-5p表達(dá)水平顯著升高（<0.05）；與si-NEAT1組、si-NEAT1+anti-NC組相比，si-NEAT1+anti-miR-15a-5p組HTR-8/ Svneo細(xì)胞中HOXD10 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，miR-15a-5p表達(dá)水平顯著降低（<0.05），見表4。

表1 引物序列

表2 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞OD值比較（）

注：與NC組比較，*<0.05；與si-NC組比較，#<0.05；與si-NEAT1組比較，△<0.05；與si-NEAT1+anti-NC組比較，▲<0.05

表3 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞凋亡率和侵襲細(xì)胞數(shù)量比較（）

注：與NC組比較，*<0.05；與si-NC組比較，#<0.05；與si-NEAT1組比較，△<0.05；與si-NEAT1+anti-NC組比較，▲<0.05

2.4 敲減NEAT1對HTR-8/Svneo細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與NC組、si-NC組相比，si-NEAT1組E-cadherin蛋白水平顯著降低，N-cadherin、vimentin蛋白水平顯著升高（<0.05）；與si-NEAT1組、si-NEAT1+anti- NC組相比，si-NEAT1+anti-miR-15a-5p組E-cadherin蛋白水平顯著升高，N-cadherin、vimentin蛋白水平顯著降低（<0.05），見表5。

2.5 NEAT1在HTR-8/Svneo細(xì)胞中靶向并負(fù)調(diào)控miR-15a-5p

通過StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測，miR-15a-5p被確定為NEAT1的潛在靶標(biāo)，見圖1。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，與NEAT1-WT+miR-NC組相比，NEAT1-WT+miR-15a-5p mimic組細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低[（1.02±0.11）（0.35±0.06），<0.05]，與NEAT1-MUT+miR-NC組相比，NEAT1-MUT+miR- 15a-5p mimic組細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著變化[（0.99±0.10）（1.01±0.09），>0.05]。RIP檢測結(jié)果顯示，相對于IgG對照組，NEAT1和miR-15a-5p在Ago2復(fù)合物中高度富集，見表6。

2.6 miR-15a-5p負(fù)調(diào)控HOXD10的表達(dá)

使用StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-15a-5p的靶基因，發(fā)現(xiàn)HOXD10的3'UTR具有與miR-15a-5p互補(bǔ)的序列，見圖2。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，與HOXD10-WT+miR-NC組相比，HOXD10-WT+miR- 15a-5p mimic組細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低[（1.00±0.11）（0.40±0.06），<0.05]，與HOXD10- MUT+miR-NC組相比，HOXD10-MUT+miR-15a-5p mimic組細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著變化[（0.98± 0.09）（1.02±0.10），>0.05]。

表4 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞中NEAT1、miR-15a-5p和HOXD10表達(dá)水平比較（）

注：與NC組比較，*<0.05；與si-NC組比較，#<0.05；與si-NEAT1組比較，△<0.05；與si-NEAT1+anti-NC組比較，▲<0.05

表5 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、vimentin蛋白水平比較（）

注：與NC組比較，*<0.05；與si-NC組比較，#<0.05；與si-NEAT1組比較，△<0.05；與si-NEAT1+anti-NC組比較，▲<0.05

圖1 StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測的NEAT1和miR-15a-5p的靶向結(jié)合序列

表6 RIP檢測結(jié)果（）

注：與IgG對照組比較，*<0.05

圖2 StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測的HOXD10和miR-15a-5p的靶向結(jié)合序列

3 討論

絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤到子宮壁的肌肉層是胎盤發(fā)育不可缺少的生理過程。研究表明，PE患者的滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯下降，導(dǎo)致螺旋動脈重塑不足，這是PE發(fā)病的主要驅(qū)動因素[13]。lncRNA的異常表達(dá)可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞過程（如遷移、侵襲）促進(jìn)PE的發(fā)生和進(jìn)展。

在PE患者胎盤組織中NEAT1表達(dá)水平升高[14]；敲減NEAT1表達(dá)可促進(jìn)PE大鼠胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲減NEAT1可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡，同時增加細(xì)胞活力和侵襲能力。EMT是細(xì)胞遷移和侵襲所必需的，其特點是低表達(dá)的上皮標(biāo)志物（E-cadherin）和高表達(dá)的間充質(zhì)標(biāo)志物（N-cadherin和vimentin）[15]。在本研究中，敲減NEAT1可降低E-cadherin表達(dá)，升高vimentin和N-cadherin表達(dá)，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的EMT過程。綜合以上結(jié)果可知，通過誘導(dǎo)EMT過程，敲減NEAT1可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡。這與既往研究結(jié)果一致，表明沉默NEAT1可能有助于緩解PE進(jìn)展。

lncRNA發(fā)揮其生物學(xué)功能的途徑主要是通過結(jié)合miRNA以調(diào)節(jié)下游靶基因。已發(fā)現(xiàn)miR-15a-5p在PE中下調(diào)[11]，過表達(dá)miR-15a-5p可誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)miR-15a-5p與NEAT1具有互補(bǔ)的結(jié)合位點。在HTR-8/Svneo細(xì)胞中敲減NEAT1后，miR-15a-5p的表達(dá)增加。隨后，雙熒光素酶報告實驗證實miR-15a-5p是NEAT1的靶基因；RIP檢測結(jié)果進(jìn)一步證實NEAT1和miR-15a-5p可在HTR-8/ Svneo細(xì)胞中結(jié)合。此外，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-15a- 5p逆轉(zhuǎn)NEAT1敲減對滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響，表明NEAT1可靶向負(fù)調(diào)控HTR-8/Svneo細(xì)胞中的miR-15a-5p。提示NEAT1可能通過與miR- 15a-5p競爭性結(jié)合促進(jìn)PE發(fā)展。

HOXD10在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化、血管生成及腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用[16]。HOXD10的表達(dá)水平和功能因癌癥類型而異，例如在膠質(zhì)瘤中HOXD10表達(dá)增加[17]，而在子宮內(nèi)膜癌中HOXD10表達(dá)減少[18]。Zhang等[12]研究顯示，HOXD10在PE胎盤中呈高表達(dá)，敲減其表達(dá)可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT。本研究使用生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測到miR-15a-5p和HOXD10之間存在結(jié)合位點，表明HOXD10是miR-15a-5p的潛在靶標(biāo)。雙熒光素酶報告實驗進(jìn)一步證實HOXD10是miR- 15a-5p的靶基因。此外，qRT-PCR證實這一發(fā)現(xiàn)，NEAT1敲減可正向調(diào)節(jié)HOXD10表達(dá)，而miR- 15a-5p抑制挽救NEAT1敲減誘導(dǎo)的HOXD10表達(dá)減少。提示miR-15a-5p可通過靶向HOXD10抑制細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和侵襲。

綜上所述，敲減NEAT1可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)miR-15a-5p/HOXD10軸有關(guān)。本研究表明NEAT1是治療PE的潛在靶點，可為PE發(fā)病機(jī)制的研究提供有效的理論依據(jù)。但lncRNA的功能非常復(fù)雜，仍需要進(jìn)一步的體內(nèi)實驗和機(jī)制探索，以深入揭示PE的發(fā)病機(jī)制。

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Influences of lncRNA NEAT1 on the proliferation, apoptosis and invasion of preeclamptic trophoblast cells by regulating the miR-15a-5p/HOXD10 axis

NIE Guilan, FAN Xufei, WANG Chuncha, YU Huilan, FAN Junxia

1.Department of Obstetrics, Jinhua Maternal & Child Health Care Hospital, Jinhua 321000, Zhejiang, China; 2.Department of Obstetrics, Jinhua Municipal Central Hospital, Jinhua 321000, Zhejiang, China

To investigate the influences and molecular mechanism of long noncoding RNA (lncRNA) nuclear-enriched abundant transcript 1 (NEAT1) on the proliferation, apoptosis and invasion of preeclampsia (PE) trophoblast cells.Human chorionic trophoblast cells HTR-8/Svneo were cultured in vitro and grouped into normal control (NC) group, si-NC group, si-NEAT1 group, si-NEAT1+anti-NC group, and si-NEAT1+anti-miR-15a-5p group. Cell proliferation activity, apoptosis and invasion ability were detected by methylthiazolyltetrazolium (MTT) method, flow cytometry and Transwell chamber assay; quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the expression of NEAT1, miR-15a-5p and homeobox D10 (HOXD10) mRNA in cells; Western blotting was used to detect the expression of HOXD10 and epithelial-mesenchymal transition (EMT)-related proteins (E-cadherin, vimentin and N-cadherin) in cells; the regulatory mechanism of NEAT1, miR-15a-5p and HOXD10 in HTR-8/Svneo cells was verified by dual-luciferase reporter gene and RNA-binding protein immunoprecipitation (RIP) experiments.Knockdown of NEAT1 greatly promoted the proliferation, invasion and EMT of HTR-8/Svneo cells, inhibited cell apoptosis, up-regulated the expression of miR-15a-5p, and inhibited the expression of HOXD10 mRNA and protein (<0.05); down-regulation of miR-15a-5p expression greatly reversed the influences of NEAT1 knockdown on the proliferation, apoptosis and invasion of trophoblast cells (<0.05). Dual-luciferase and RIP experiments confirmed that NEAT1 could target and negatively regulate miR-15a-5p in HTR-8/Svneo cells, and HOXD10 was a target of miR-15a-5p.Knockdown of NEAT1 may inhibit the expression of HOXD10 by up-regulating miR-15a-5p, thereby promoting the proliferation and invasion of trophoblast cells, and inhibiting the apoptosis of trophoblast cells.

Preeclampsia; Long noncoding RNA; Nuclear-enriched transcript 1; MicroRNA-15a-5p; Homeobox D10; Trophoblast cell

R714.25

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.07.003

浙江省基礎(chǔ)公益研究計劃項目（LQ19H040002）

范徐妃，電子信箱：fanx0_08@163.com

（2022–09–07）

（2023–01–31）