巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子、伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)蛋白及循環(huán)腫瘤細(xì)胞在骨肉瘤中的表達(dá)及臨床意義

郭一帆，李龍，程虎

商洛市中心醫(yī)院脊柱外科，陜西 商洛 726000

骨肉瘤多發(fā)生于兒童及青少年，研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤患者術(shù)后5年生存率較低，僅為20%，不利于青少年健康成長(zhǎng)，隨著化療手段及技術(shù)的進(jìn)步，骨肉瘤患者5年生存率有了明顯提高[1-2]。臨床仍在不斷尋找有效的、特異性的分子靶向治療方案，從而達(dá)到改善患者預(yù)后的目的。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（macrophage migration inhibity factor，MIF）是一種細(xì)胞因子，與細(xì)胞增殖、分化、血管生成相關(guān)，在惡性腫瘤中過(guò)度表達(dá)。伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)蛋白（reversion inducing cysteine rich protein with kazal motifs，RECK）具有干擾腫瘤基因表達(dá)、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素之一。外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）能在特定條件下進(jìn)入血液循環(huán)，在原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞分化環(huán)節(jié)中均有參與，可促進(jìn)腫瘤生成及發(fā)展。檢索相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，MIF、RECK及CTC在骨肉瘤中均異常表達(dá)[3-5]，但關(guān)于其與骨肉瘤預(yù)后關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。本研究探討MIF、RECK及CTC在骨肉瘤中的表達(dá)及臨床意義，為臨床對(duì)骨肉瘤患者實(shí)施分子靶向治療提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年2月至2020年2月在商洛市中心醫(yī)院治療的骨肉瘤患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為骨肉瘤[6]，且在商洛市中心醫(yī)院初次確診；②入院前未接受包括放化療在內(nèi)的任何治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①確診為骨巨細(xì)胞瘤；②合并其他惡性腫瘤；③明顯肝腎功能異常；④合并嚴(yán)重內(nèi)科疾病。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入132例骨肉瘤患者，設(shè)為觀察組，其中，男性70例，女性62例；平均年齡（32.49±7.41）歲；低中分化69例，高分化63例。選取同期在商洛市中心醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療并經(jīng)病理檢查確診為軟骨瘤的129例患者，設(shè)為對(duì)照組，其中，男性73例，女性56例；平均年齡（32.81±7.01）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有患者均知情同意。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 MIF、RECK檢測(cè)方法收集標(biāo)本統(tǒng)一進(jìn)行分割保存，采用免疫組化染色法檢測(cè)MIF、RECK蛋白表達(dá)情況。將標(biāo)本從液氮中取出后放入4%多聚甲醛中，固定處理48 h后取出，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）漂洗，之后將標(biāo)本包埋處理，做成3 μm厚度的切片。將切片進(jìn)行免疫組化染色：均經(jīng)甲醛溶液固定、石蠟包埋、載玻片泡酸、高溫滅菌用PBS洗滌及多聚賴氨酸涂片等處理，隨后進(jìn)行染色及蘇木精復(fù)染、脫水、樹(shù)膠封固。最后在顯微鏡下觀察。根據(jù)細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行MIF、RECK陽(yáng)性判定，由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立打分。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強(qiáng)度評(píng)分：未染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。染色指數(shù)=陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分+染色強(qiáng)度評(píng)分。染色指數(shù)≥3分為陽(yáng)性表達(dá)，染色指數(shù)＜3分為陰性表達(dá)[7]。

1.2.2 CTC檢測(cè)方法采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清CTC水平。CTC陽(yáng)性判定：5 ml外周血中只要發(fā)現(xiàn)CTC即可判定為陽(yáng)性[8]。

1.3 隨訪

對(duì)132例骨肉瘤患者進(jìn)行為期2年的隨訪（隨訪方式為電話隨訪），隨訪截止時(shí)間為2022年2月，記錄骨肉瘤患者的生存及死亡情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；影響因素分析采用Cox多元回歸分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MIF、RECK、CTC陽(yáng)性表達(dá)情況的比較

觀察組患者M(jìn)IF、CTC陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于對(duì)照組，RECK陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 兩組患者M(jìn)IF、RECK、CTC陽(yáng)性表達(dá)情況的比較[ n（%）]

2.2 不同預(yù)后骨肉瘤患者M(jìn)IF、RECK、CTC陽(yáng)性表達(dá)情況的比較

隨訪2年，132例骨肉瘤患者中，死亡58例，生存74例。死亡患者M(jìn)IF、CTC陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于生存患者，RECK陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于生存患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表2）

表2 不同預(yù)后骨肉瘤患者M(jìn)IF、RECK、CTC陽(yáng)性表達(dá)情況的比較[ n（%）]

2.3 骨肉瘤患者預(yù)后影響因素分析

以性別、年齡、肺部轉(zhuǎn)移、規(guī)律化療、分化程度、MIF表達(dá)、RECK表達(dá)、CTC表達(dá)為自變量，以預(yù)后死亡為因變量進(jìn)行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析。單因素分析結(jié)果顯示：性別、年齡及規(guī)律化療情況均可能與患者預(yù)后無(wú)關(guān)，而發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移、低中分化、MIF陽(yáng)性、RECK陰性、CTC陽(yáng)性均可能與患者預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）。將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素帶入多因素分析，結(jié)果顯示：發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移、低中分化、MIF陽(yáng)性、RECK陰性、CTC陽(yáng)性均為骨肉瘤患者預(yù)后死亡的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。（表3）

表3 骨肉瘤患者預(yù)后死亡的影響因素分析

3 討論

骨肉瘤是常見(jiàn)于間葉組織的原發(fā)性惡性腫瘤，有70%～80%的患者發(fā)病年齡為10～25歲，以股骨、脛骨、腓骨等部位多發(fā)，臨床癥狀為病灶局部疼痛、軟組織腫脹及運(yùn)動(dòng)功能受限等[9]。研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤的分子機(jī)制復(fù)雜，在該病發(fā)生的過(guò)程中有多種蛋白參與，并影響病情進(jìn)展[10]。分子靶向治療為目前的研究熱點(diǎn)，通過(guò)改變癌基因，在分子水平阻斷腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以阻礙腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)移。

研究發(fā)現(xiàn)，MIF有助于惡性腫瘤（如肝癌、前列腺癌等）許多方面的進(jìn)展，包括細(xì)胞增殖、存活、侵襲和血管生成[11]。骨肉瘤多發(fā)生于骨骼系統(tǒng)中長(zhǎng)骨的兩端，這些部位血管比較豐富，為腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供了有利條件，而MIF表達(dá)與血管生成、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12]。RECK在腫瘤組織中表達(dá)量較低，其作為基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，具有調(diào)控細(xì)胞分化及凋亡的作用，在惡性腫瘤組織中，若RECK表達(dá)量顯著降低，則表示腫瘤可能發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移[13]。CTC存在于外周血中，若在腫瘤原發(fā)灶種植，將加重患者病情，為腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)創(chuàng)造有利條件。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中，均存在CTC[14]。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者M(jìn)IF、CTC陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于對(duì)照組，RECK陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組，與以往研究所得結(jié)果一致[15]。可見(jiàn)MIF、CTC、RECK均與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展有一定聯(lián)系，將三者作為早期骨肉瘤的診斷指標(biāo)應(yīng)用于臨床有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，死亡患者M(jìn)IF、CTC陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于生存患者，RECK陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于生存患者，發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移、低中分化、MIF陽(yáng)性、RECK陰性、CTC陽(yáng)性均為骨肉瘤患者預(yù)后死亡的危險(xiǎn)因素，說(shuō)明MIF、CTC、RECK在骨肉瘤患者預(yù)后中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，MIF、CTC、RECK可用于骨肉瘤患者早期診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)中，三者可能為骨肉瘤患者的潛在治療靶點(diǎn)，但MIF、CTC、RECK在骨肉瘤患者中的具體作用機(jī)制仍未闡明，有待后續(xù)進(jìn)行深入研究。