miRNA-455- 3 p在乳腺癌組織中的表達(dá)及與紫杉醇耐藥的關(guān)系△

嵇曉輝，姜麗娜，王娜，劉薇，楊金花#

鄭州人民醫(yī)院1病理科，2乳腺外科，鄭州 450003

乳腺癌屬于多基因異質(zhì)性惡性腫瘤，在女性中 其發(fā)病率僅次于宮頸癌，且近年來其發(fā)病呈逐漸年輕化的趨勢，對女性身心健康的影響極大，發(fā)病后患者多會出現(xiàn)胸痛、乳頭內(nèi)陷、乳頭破碎等癥狀，早期多采用根治性手術(shù)治療[1]。但由于乳腺癌早期臨床癥狀無特異性，多數(shù)患者確診時病情已進(jìn)展至中晚期，錯過了最佳的手術(shù)時機(jī)，只能依靠化療穩(wěn)定病情[2]。紫杉醇（paclitaxel，PTX）是常用的乳腺癌化療藥物，該藥物具有促進(jìn)微管蛋白聚合、抑制解聚的作用，可確保微管蛋白處于穩(wěn)定狀態(tài)，避免細(xì)胞有絲分裂，與靶向藥物聯(lián)合應(yīng)用還能在減輕不良反應(yīng)的同時提高治療效果，長期治療雖然能在一定程度上增加腫瘤細(xì)胞的敏感性，但也有可能產(chǎn)生較大的毒性[3]。因此，盡早明確乳腺癌的耐藥機(jī)制，研發(fā)新型靶向治療藥物，在提高藥物敏感性的同時減輕不良反應(yīng)，才能保障整體治療效果[4]。微小RNA（microRNA，miRNA）作為保守的內(nèi)源性非編碼小RNA，其組織特異性較高，目前已有研究認(rèn)為miRNA-455-3p能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性[5]。此外，自噬相關(guān)蛋白12（autophagy related 12，ATG12）在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，與惡性腫瘤靶向治療耐藥存在一定關(guān)聯(lián)，但在乳腺癌中的研究較少?；诖耍狙芯刻接懭橄侔┙M織中miRNA-455-3p的表達(dá)及與PTX耐藥的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年7月至2021年7月鄭州人民醫(yī)院收治的乳腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2015版）》[6]中乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②經(jīng)病理檢查確診為乳腺癌，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①對PTX過敏；②存在化療禁忌證；③合并其他器官感染或腫瘤；④認(rèn)知功能障礙，無法完全配合治療；⑤接受過化療或放療。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入80例乳腺癌患者，年齡30～78歲，平均（54.41±5.62）歲；病程1～6年，平均（3.21±0.46）年；PTX敏感者40例，PTX耐藥者40例；TNM分期：Ⅲ期60例，Ⅳ期20例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意。

1.2 實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測miRNA-455- 3 p、ATG12 mRNA的表達(dá)水平

取80例乳腺癌患者的乳腺癌組織和相應(yīng)癌旁組織，PTX耐藥和PTX敏感乳腺癌患者的乳腺癌組織，液氮中冷凍，隨后迅速置于-80℃冰箱中保存待檢。采用Trizol法提取組織樣品中的總RNA，然后采用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），并以cDNA作為模板，利用Primer 5設(shè)計(jì)引物，配制PCR反應(yīng)體系，最后于熒光定量PCR儀上對miRNA-455a-3p表達(dá)水平進(jìn)行檢測，重復(fù)測量3次取平均值，以U6為內(nèi)參，采用 2-△△Ct法計(jì)算 miRNA-455-3p 的相對表達(dá)量。miRNA-455-3p正向引物：5'-CGTCGAAGAAGGGCAAGTAG-3'，反向引物：5'-CACCATTCCAAGCACAACAC-3'；U6正 向 引 物 ：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，采用 2-△△Ct法計(jì)算 PTX 耐藥和PTX敏感乳腺癌患者乳腺癌組織中ATG12mRNA的相對表達(dá)量。ATG12正向引物：5'-CTGCTGCGGCGGGCGAGAG-3'，反向引物：5'-GGGCGAAACTGCAACCGAAGACG-3'；GAPDH正向引物：5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，反向引物：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGGA-3'。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組采用含有300 μg/ml PTX的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，24 h后更換為不含PTX的RPMI-1640培養(yǎng)液，一旦細(xì)胞融合度高達(dá)70%，則反復(fù)使用PTX誘導(dǎo)，并反復(fù)換液、傳代，24周后建立PTX耐藥細(xì)胞MCF-7/PTX。將MCF-7/PTX接種于96孔板中，1×105/孔，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%，采用Lipofectamine 3000將miRNA-NC、miRNA-455-3p mimics分別轉(zhuǎn)染至乳腺癌耐藥MCF-7/PTX細(xì)胞，分別作為miRNANC組、miRNA-455-3p組。

1.3.2 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量將細(xì)胞裂解液加入待裂解細(xì)胞中后，離心取上清液，并采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白對試劑盒中的蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測定，吸取50 μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），隨后于100 V恒壓條件下將蛋白印跡轉(zhuǎn)移到纖維素膜中，于4℃條件下采用5%脫脂牛奶封閉纖維素膜，并孵育過夜，隨后加入P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶-π（glutathione S-transferase-π，GST-π）一抗，室溫下孵育2 h，采用TBST洗滌；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1.5 h，隨后采用電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）法對蛋白進(jìn)行檢測，同時利用Image Scanner軟件分析P-gp、GST-π蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡能力將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中孵育24 h，1×105/孔，PTX處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。胰蛋白酶消化細(xì)胞后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌重懸，隨后取 100 μl細(xì)胞懸液加入 5 μl膜聯(lián)蛋白 V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）孵育 10 min，然后加入 5 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀和Flowjo軟件計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.4 觀察指標(biāo)

①比較乳腺癌組織和癌旁組織中miRNA-455-3p的相對表達(dá)量。②比較PTX耐藥和PTX敏感乳腺癌患者乳腺癌組織中miRNA-455-3p、ATG12mRNA的相對表達(dá)量。③比較miRNA-NC組、miRNA-455-3p組MCF-7/PTX細(xì)胞的凋亡率以及P-gp、GST-π蛋白的相對表達(dá)量。④分析乳腺癌組織miRNA-455-3p的表達(dá)與ATG12表達(dá)的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織和癌旁組織中miRNA-455- 3 p相對表達(dá)量的比較

乳腺癌組織中miRNA-455-3p的相對表達(dá)量為（1.01±0.03），明顯高于癌旁組織的（0.73±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=59.029，P＜0.01）。

2.2 PTX敏感和PTX耐藥乳腺癌患者乳腺癌組織中miRNA-455- 3 p、ATG12 mRNA相對表達(dá)量的比較

PTX敏感乳腺癌患者乳腺癌組織中miRNA-455-3p的相對表達(dá)量明顯高于PTX耐藥患者，ATG12mRNA相對表達(dá)量明顯低于PTX耐藥患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 PTX敏感和PTX耐藥乳腺癌患者乳腺癌組織中miRNA-455- 3 p、ATG12 mRNA相對表達(dá)量的比較（±s）

表1 PTX敏感和PTX耐藥乳腺癌患者乳腺癌組織中miRNA-455- 3 p、ATG12 mRNA相對表達(dá)量的比較（±s）

PTX耐藥情況PTX敏感（n=40）PTX耐藥（n=40）t值P值1.02±0.02 0.68±0.04 48.083 0.000 0.63±0.08 1.29±0.12 28.943 0.000 miRNA-455-3p ATG12 mRNA

2.3 miRNA-455- 3 p過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞MCF- 7/PTX凋亡情況及P-gp、GST- π蛋白相對表達(dá)量的影響

miRNA-455-3p組細(xì)胞凋亡率明顯高于miRNANC組，P-gp、GST-π蛋白相對表達(dá)量均明顯低于miRNA-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表2）

表2 miRNA-455- 3 p組和miRNA-NC組MCF- 7/PTX細(xì)胞凋亡情況及P-gp、GST-π蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

表2 miRNA-455- 3 p組和miRNA-NC組MCF- 7/PTX細(xì)胞凋亡情況及P-gp、GST-π蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

組別miRNA-NC組miRNA-455-3p組t值P值8.41±0.42 16.84±0.52 56.401 0.000 1.06±0.11 0.46±0.06 21.415 0.000 1.02±0.08 0.47±0.05 26.073 0.000凋亡（%）P-gp蛋白GST-π蛋白

2.4 miRNA-455- 3 p表達(dá)與ATG12表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，乳腺癌組織中miRNA-455-3p的表達(dá)與ATG12的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.697，P＜0.01）。

3 討論

乳腺癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前臨床尚未完全明確，可能與遺傳、外源性雌激素刺激、不良生活習(xí)慣等因素有關(guān)[7]?；熥鳛槿橄侔┏Ｒ姷妮o助治療方法之一，以PTX最為常見，該藥可有效抑制病情進(jìn)展，治療效果顯著，但若患者對PTX產(chǎn)生耐藥性，極有可能增加化療失敗、腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，甚至還有可能縮短患者的生存期，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[8]。因此，臨床只有盡早明確乳腺癌組織產(chǎn)生PTX耐藥的原因，才能及時采取有效的措施進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)而降低乳腺癌組織對PTX的耐藥性，達(dá)到提高患者臨床治療效果的目的[9]。

miRNA含有20～24個核苷酸，可通過與靶基因3'-非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）完全或不完全結(jié)合的方式對靶基因和蛋白翻譯功能進(jìn)行降解和抑制，使miRNA調(diào)控信號通路出現(xiàn)異常[10]。目前已有研究證實(shí)，腫瘤內(nèi)的miRNA與化療藥物的耐藥性存在一定關(guān)聯(lián)[11]。miRNA-455-3p是功能性miRNA的一種，可在多種惡性腫瘤耐藥性的產(chǎn)生過程中發(fā)揮調(diào)控作用，但miRNA-455-3p對乳腺癌PTX耐藥的影響及其調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究[12]。目前也有研究認(rèn)為自噬與腫瘤細(xì)胞耐藥性存在一定關(guān)聯(lián)，ATG12作為自噬小體形成的主要參與因子之一，可誘導(dǎo)自噬小體的形成促進(jìn)自噬的發(fā)生，自噬的發(fā)生能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對治療的抵抗[13-14]。相關(guān)研究認(rèn)為，miRNA可在調(diào)控ATG12的表達(dá)后，直接參與腫瘤耐藥性的產(chǎn)生過程[15-16]。本研究也認(rèn)為miRNA-455-3p與ATG12的表達(dá)存在關(guān)聯(lián)，與癌旁組織相比，乳腺癌組織中miRNA-455-3p的相對表達(dá)量明顯更高，且PTX敏感組織中miRNA-455-3p的相對表達(dá)量明顯高于PTX耐藥組織，而ATG12mRNA的相對表達(dá)量明顯低于PTX耐藥組織。提示ATG12可能是miRNA-455-3p的潛在靶基因之一，且ATG12還可能在PTX的作用下對耐藥細(xì)胞的自噬和凋亡產(chǎn)生影響，從而干擾miRNA-455-3p的表達(dá)，增強(qiáng)乳腺癌的耐藥性。

P-gp蛋白作為多藥耐藥基因編碼的產(chǎn)物，可將PTX泵出細(xì)胞外，同時還能對腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[17-18]。GST-π蛋白可使細(xì)胞毒性藥物參與到化療中，使化療耐藥，而下調(diào)P-gp和GST-π蛋白的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的耐藥性，抑制P-gp和GST-π蛋白的表達(dá)還能有效逆轉(zhuǎn)miRNA-455-3p對MCF-7/PTX細(xì)胞凋亡的影響[19-20]。本研究結(jié)果顯示，miRNA-455-3p組細(xì)胞凋亡率明顯高于miRNA-NC組，P-gp、GST-π蛋白的相對表達(dá)量均明顯低于miRNA-NC組，提示miRNA-455-3p高表達(dá)可能抑制了乳腺癌PTX的耐藥過程，干擾miRNA-455-3p的表達(dá)可能增強(qiáng)乳腺癌組織的耐藥性。但本研究僅為單中心研究，且樣本量較少，后續(xù)還需要加大樣本量，并進(jìn)行多中心分析，才能進(jìn)一步提高研究結(jié)果的真實(shí)性和可靠性。

綜上所述，乳腺癌組織中miRNA-455-3p表達(dá)與PTX耐藥存在一定關(guān)聯(lián)，miRNA-455-3p能夠靶向抑制ATG12的表達(dá)，降低耐藥乳腺癌細(xì)胞的自噬活性，促進(jìn)細(xì)胞迅速凋亡，最終改善乳腺癌細(xì)胞對PTX的敏感性。