微生物實驗室菌種復(fù)蘇傳代保存流程分析

尹桂麗+徐建寶+周燕燕

摘 要：微生物實驗室中的菌種管理工作是一件非常重要的工作環(huán)節(jié)，對微生物實驗結(jié)果的影響具有非常重要，為提高實驗室的工作質(zhì)量、加強對微生物菌種的保管質(zhì)量，根據(jù)相關(guān)工作經(jīng)驗和調(diào)查結(jié)果對現(xiàn)有的實驗室菌種保存及管理模式進行改進，從而形成一個科學(xué)、規(guī)范、合理的微生物實驗室菌種復(fù)蘇、傳代、保存體系是一件非常重要的事情，從而促進我國微生物實驗精確度提升，增強相關(guān)工程管理質(zhì)量的規(guī)范程度，為我國醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展及生產(chǎn)質(zhì)量提高創(chuàng)造良好的條件。

關(guān)鍵詞：菌種復(fù)蘇；傳代；保存

微生物實驗是我國建筑醫(yī)藥研發(fā)及生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，是確保我國醫(yī)藥研發(fā)行業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵基礎(chǔ)。根據(jù)藥典中的標準，微生物實驗室對于新引進的培養(yǎng)基需要通過靈敏度測試后才能投入使用；另外，在對無菌實驗成果進行檢查時需要使用金黃色葡萄球菌作為對比參照，而在對日常灌裝環(huán)境質(zhì)量檢測時需要使用環(huán)境菌進行輔助檢驗。由此可見，菌種為微生物實驗中非常關(guān)鍵的因素，所以必須要建立起一個科學(xué)、健全的微生物實驗室菌種的復(fù)蘇、傳代及保存體系。

1 用具與設(shè)備

接種環(huán)，接種針，酒精燈，電熱恒溫培養(yǎng)箱，生化培養(yǎng)箱，冰箱，滅菌柜，超凈臺，液氮罐，超低溫冰箱，1.5mL凍存管，試管等。

2 菌種的復(fù)活

應(yīng)在環(huán)境潔凈度D級下的局部潔凈度不低于B級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行，其全過程必須嚴格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，制備F1，（接收到合適菌種準備使用時，應(yīng)根據(jù)菌種/細胞株的說明書制備復(fù)活的培養(yǎng)基對標準菌株、細胞株進行復(fù)活。清潔安瓶（可用75%乙醇）后，用砂輪在安瓶的上部1/3處劃線，用干燥的無菌紗布包裹安瓶，將安瓶打開。用一無菌吸管吸取0.5-0.8mL適量的液體培養(yǎng)基（生抱梭菌用液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基；大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、短小芽胞桿菌、銅綠假單胞菌和枯草芽抱桿菌用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基；白色念珠菌、黑曲霉用沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基）滴加到安瓶中，輕輕旋轉(zhuǎn)安瓶并吹打，使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解，再將安瓶內(nèi)的菌液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的培養(yǎng)基中，根據(jù)菌種類型將其放入適宜的培養(yǎng)條件[需氧菌培養(yǎng)溫度（30-35）℃，18-24h；真菌培養(yǎng)溫度（20-25）℃，3-5d下培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基是否渾濁，渾濁說明菌種復(fù)活生長，此為F1，如不渾濁，需氧菌應(yīng)延長培養(yǎng)時間至5天以上，真菌應(yīng)延長培養(yǎng)時間至7d以上，仍不渾濁，按121℃，30min條件火菌處理，再對復(fù)活后的標準儲備菌株進行純度和特性的確認。

3 菌種的傳代

菌種是微生物實驗中的重要輔助工具，所以其質(zhì)量非常重要，每一個菌種在使用前都需要進過嚴格的測評才能投入實驗中。微生物實驗是一項對嚴謹性和精確性要求非常高的工作，所以對于試驗中要用到的每一類菌種的復(fù)蘇、傳代和保存都有一套非常嚴格的標準及原則，已經(jīng)透過嚴格檢定、確定與相關(guān)條件相吻合的菌種才能執(zhí)行傳代步驟。另外，傳代工作流程在實際操作時也有非常嚴格的要求，傳代次數(shù)不宜過多，且要減少不必要的傳代工作，同時還要對傳代時的溫度進行合理調(diào)控。

4 菌種的保藏

在菌種的復(fù)蘇及傳代工作完成后，實驗室中的菌種管理工作體系已經(jīng)進入最后一個環(huán)節(jié)，這一環(huán)節(jié)同樣是保證菌種質(zhì)量及功效的重要步驟。而在實驗室的當(dāng)中對菌種進行保藏的方法有很多，下面筆者就對幾種實驗室中常見的菌種保藏方法進行簡要闡述。

4.1 甘油冷凍管保藏法

甘油冷凍管保藏發(fā)是在實驗室中一種非常常用的保藏手段，該方法的具體操作方法是使用無菌接種環(huán)對菌種表面的菌苔進行刮取，然后利用接種環(huán)接觸試管的方式使細菌通過與試管壁的輕度摩擦向事先準備好的放置于試管內(nèi)部的無菌蒸餾水中傳輸，或直接將菌放置于培養(yǎng)基當(dāng)中，同時還要對菌液的濃度進行調(diào)節(jié)，然后在調(diào)配完成后的菌懸液中添加體積相等、濃度標準是30%的無菌甘油，從而得出15%的甘油菌懸液。在操作過程中要保證所使用的甘油濃度保持在一個較低的程度，如果甘油濃度高于實驗標準將會造成細菌細胞滲透壓力產(chǎn)生變化，最終導(dǎo)致細菌發(fā)生死亡的問題。在細菌傳導(dǎo)完成后需要對試管進行振動和搖蕩，在搖時要注意對力度的控制，讓試管內(nèi)的各種物質(zhì)達到充分融合，再將融合后的溶液分別放置于無菌小試管中，最后將制作完成的甘油冷凍管放入-20℃的低溫環(huán)境中進行預(yù)凍處理，并將其放在低于-80℃的超低溫環(huán)境中存放，且要保證冰箱的溫度至少為-30℃，其在這種冷凍環(huán)境下通常能夠保留的時長為2a，而乙型溶血性鏈球菌對保存溫度的要求較高，在超低溫環(huán)境下該菌種的可保存時長為3個月。

4.3 斜面低溫保藏法

斜面低溫保藏法是一種過渡性較強的保藏方法，其保藏時間較短，該方法是通過將菌種轉(zhuǎn)移至條件合適的試管培養(yǎng)基上，或?qū)⑵滢D(zhuǎn)接在茄子瓶的固體培養(yǎng)基斜面上進行培養(yǎng)，在菌種成長到一定程度之后再將其放入2-8℃的溫度環(huán)境中進行保存。而微生物菌種的類型不同，其保存時間長短也會有所差別。然而，這種保藏方法有一個非常突出的劣勢特點，就是采用這種方式進行保存的菌種極易發(fā)生狀態(tài)改變，如果菌種發(fā)生變異會對其后期傳代效果造成影響，使菌種受到污染。所以，這種方法只能在需要保藏時間較短的菌種類型的保藏工作中使用，并且還要對菌種的保藏狀態(tài)進行隨時檢查。

4.4 液氮超低溫保藏法

4.4.1 制備菌懸液

將需要保藏的菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，適宜溫度培養(yǎng)，當(dāng)菌落健壯地長滿斜面時取出。配制30%的甘油溶液進行121℃下高壓火菌30min，將生長良好的菌種斜面用生理鹽水制成菌懸液，菌濃度控制在107左右，然后加入等體積甘油水溶液混勻后制成15%的甘油菌懸液。

4.4.2 分裝菌懸液

把購買的1.5ml的塑料凍存管擰松管帽置一燒杯中，外扎紗布、牛皮紙包扎好進行121℃高壓火菌30min。然后將制備好的菌懸液分裝至1.5mL的塑料凍存管中，每支凍存管加入1mL菌懸液，擰緊管帽，并用膠布封口，分別在膠布和凍存管上做好菌種標記。

4.4.3 液氮保藏

將菌液保持在0攝氏度的狀態(tài)，然后將有關(guān)設(shè)備放置到零下70攝氏度左右的冰柜立面，然后進行降溫。接著將相應(yīng)的凍存管放入到液氮罐妥善的保存，并且在罐的外面做好詳細的標記工作，為以后使用菌種帶來方便。當(dāng)液氮中所存在的菌種需要復(fù)蘇時，這時操作人員就應(yīng)當(dāng)將菌種提出來，放置到大約35-40攝氏度的環(huán)境里面進行充分的攪拌，從而達到解凍的目的。為了避免菌種出現(xiàn)污染的情況，操作人員需要用75%的酒精進行擦拭，當(dāng)表面完全干燥以后就可以使用相應(yīng)的容器將菌液按種到相應(yīng)的培養(yǎng)基上做好培養(yǎng)工作。

結(jié)束語

綜上所述，對微生物實驗室中的菌種進行保存的方法有很多種，這些方法的正確使用對菌種的保存質(zhì)量的提高具有積極作用。然而，若方法使用不合理使菌種的保存質(zhì)量嚴重降低，不但無法達到有效提高菌種保存效果的目的，還會造成適得其反的結(jié)果，因此一定要建立起科學(xué)規(guī)范的菌種復(fù)蘇、傳代和保存體系，這樣才能有效提高菌種保藏的科學(xué)性和規(guī)范性，以促進微生物實驗室檢驗效率的提高，增強實驗結(jié)果的精確性，為微生物實驗工作的完善奠定基礎(chǔ)，從而推動該行業(yè)在我國快速發(fā)展。

參考文獻

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[2]陳曉燕，林光.微生物實驗菌種保存方式探討[J].臨床合理用藥雜志，2014（29）：129-130.