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    γ—氨基丁酸對內(nèi)在膽堿能神經(jīng)興奮引發(fā)的離體胰臟外分泌的影響

    2017-03-04 00:34權(quán)赫然姜成哲崔正云
    科學(xué)與財富 2016年32期
    關(guān)鍵詞:胰臟氨基丁酸

    權(quán)赫然+姜成哲+崔正云

    摘 要:本實驗的目的在于觀察外源性GABA對胰臟內(nèi)膽堿能神經(jīng)調(diào)節(jié)的胰臟外分泌的影響。在灌流摘除的大鼠胰臟模型中觀察了GABA對電場刺激喚起的胰臟外分泌作用的影響。GABA的實施在電場刺激六十分鐘前開始到實驗結(jié)束。胰液被收集后檢測其總分泌量和淀粉酶產(chǎn)量。河豚毒素和阿托品對胰臟外分泌的影響也被記錄。實驗結(jié)果強烈地提示GABA的實施不影響胰臟內(nèi)膽堿能神經(jīng)的功能,但增強膽堿能神經(jīng)興奮引起的胰臟外分泌。GABA對胰臟外分泌的作用雖然接受迷走膽堿能神經(jīng)的興奮程度的影響,但并不改變膽堿能神經(jīng)的興奮度。

    關(guān)鍵詞:胰臟;γ-氨基丁酸;電場刺激

    Abstract: The present study was undertaken to see an effect of GABA on an action of intrapancreatic cholinergic neuron playing a stimulatory role in pancreatic exocrine secretion. In the isolated, perfused rat pancreas, an influence of the vagal cholinergic nerve on a GABA action in EFS-evoked pancreatic exocrine secretion was observed. GABA was intravenously infused from 60min before the EFS to the end of experiment. Pancreatic juice was collected and then volume flow and amylase output were determined. TTX was administrated prior to the experiment. Atropine was administrated from 60 min before the EFS to the end of experiment. The results strongly suggest that GABA does not modify the activity of intra-pancreatic cholinergic neurons but enhances pancreatic exocrine secretion evoked by activation of the cholinergic neurons. The action of GABA on pancreatic exocrine secretion is under an influence of the vagal cholinergic tone but GABA does not modify the cholinergic tone.

    Keywords:Pancreatic; gamma-aminobutyric acid; electrical field stimulation

    前言

    胰臟是分泌胰島素等的內(nèi)分泌部散在分泌胰蛋白酶等消化酶及重碳酸離子(HCO3-)、水份的外分泌部的混合腺體器官。流入胰臟的血液大部分都流入外分泌部,大約10%的血液經(jīng)過在內(nèi)分泌部形成毛細血管網(wǎng)后再經(jīng)過外分泌部形成毛細血管網(wǎng),即先后流過所謂的胰島腺泡門脈體系[1]。

    γ-氨基丁酸(GABA)最初被從哺乳類的腦組織中發(fā)現(xiàn),之后也從心血管系統(tǒng)、胃腸管系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)等神經(jīng)系統(tǒng)以外的臟器中被發(fā)現(xiàn)[2]。特別是在胰臟胰島的β-細胞中也存在相當于腦組織中存在量的高濃度GABA,而且胰臟胰島的β-細胞中還發(fā)現(xiàn)參與GABA生物合成的合成酶和參與其代謝過程的代謝酶[3]。因此,GABA可能在β-細胞中合成并代謝,但迄今為止GABA是否由胰臟的胰島分泌出來的問題,還沒找到直接證據(jù)。但GABA由胰島分泌的可能性很大。并且胰小葉內(nèi)胰管細胞和腺泡中心細胞中都觀察到了GABA的高親和性結(jié)合部位[4]。如果GABA真的由胰島分泌,可以推測它將經(jīng)過胰島-腺泡門脈系統(tǒng),影響胰臟外分泌功能的可能性極高。

    之前有文章發(fā)表了利用白鼠灌流摘出的胰臟觀察的外源性GABA對胰臟外分泌的影響。根據(jù)這份報告外源性GABA對自發(fā)性胰臟外分泌或secretin誘發(fā)的胰臟外分泌沒有影響,但是大幅上升由主要促進酶分泌的GRP或CCK誘發(fā)的胰臟外分泌或由電場刺激誘發(fā)的胰臟外分泌。電場刺激激活胰臟的內(nèi)在神經(jīng)促進外分泌[5],從上述實驗結(jié)果來看,GABA對內(nèi)在神經(jīng)對胰臟外分泌的作用有可能起到上升作用。胰臟中存在的神經(jīng)中最多的是膽堿能神經(jīng),這對胰臟外分泌起到促進作用是眾所周知的。因此,在本研究中作為闡明GABA對胰臟外分泌的影響機制的一環(huán),利用白鼠灌流摘出的胰臟想要證明對胰臟外分泌有促進性作用的胰臟內(nèi)在膽堿能神經(jīng)作用的GABA的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    本實驗中使用了體重在250-300g的Sprague-Dawley系的雄性大鼠,在開始實驗前24小時起只供應(yīng)水實施禁食。通過腹腔注射20%烏拉坦溶液麻醉實驗動物,用量為每公斤體重7ml。在麻醉的狀態(tài)下結(jié)束實驗或摘出胰臟后靜脈輸注過量的烏拉坦殺死實驗動物。每組實驗動物為六只。

    1.2 灌流摘出大鼠胰臟中GABA對電刺激誘發(fā)的胰臟外分泌的影響

    1.2.1 白鼠的灌流摘出胰臟模型的制備。胰臟的摘出按已經(jīng)發(fā)表的方法[5]進行。

    1.2.2 對灌流摘出的胰臟進行電刺激術(shù)。為激活灌流摘出的胰臟內(nèi)在神經(jīng)進行了以下的電場刺激術(shù)。在裝有灌流摘出的胰臟的實驗箱中放置間隔5cm的兩根螺線形鉑線,然后將胰臟放置在兩根鉑線之間,利用電刺激器(BioScience.UK)加以15V,2msec,8Hz的直流電流。

    1.2.3 GABA對電場刺激誘發(fā)的胰臟外分泌的影響。記錄白鼠的灌流摘出的胰臟在基礎(chǔ)狀態(tài)下的胰液分泌量及淀粉酶的量。然后對灌流摘出胰臟加以電場刺激,間隔15min,測量一次胰液及淀粉酶的含量。在電場刺激一小時前起,將GABA以10?的濃度對動脈進行給藥,并施加電場刺激,觀察胰液分泌量。每隔15min記錄數(shù)據(jù)。

    1.2.4 在GABA作用下,阿托品對在電場刺激下誘發(fā)的胰臟外分泌的影響。在電場刺激1小時前開始向灌流摘出的胰臟動脈給藥10μM濃度的GABA,觀察GABA對電場刺激誘發(fā)的胰臟外分泌的影響。為了確認電場刺激是否激活胰臟內(nèi)在神經(jīng),邊給藥1μM濃度的抑制神經(jīng)活性的河豚毒素,觀察由電刺激誘發(fā)的胰臟外分泌的GABA的效果。并且為了確認電場刺激是否激活胰臟內(nèi)在神經(jīng)中的膽堿能神經(jīng),以2μM的濃度給藥阿托品,觀察GABA對電場刺激的效果。阿托品從電場刺激1小時前開始與GABA一起一直給藥。下面的圖1簡要展示了實驗的過程。

    1.3 GABA對乙酰膽堿誘發(fā)的胰臟外分泌的影響

    為觀察GABA對Choline能神經(jīng)傳達物質(zhì)誘發(fā)的胰臟外分泌的影響對灌流摘出的胰臟給藥10,30,100μM濃度的GABA,并于1小時后以5μM的嘗試給藥乙酰膽堿1小時。

    1.4 測定胰液中的α-淀粉酶活性

    胰液中的α-淀粉酶活性是按已經(jīng)發(fā)表的方法[5]測定的。

    1.5 測試值的統(tǒng)計處理

    本實驗中得到的所有測定值按平均±標準偏差給出。平均差用Student's t test進行了統(tǒng)計學(xué)驗證,顯著性水平為5%。

    2結(jié)果

    2.1 灌流摘出的白鼠胰臟中,GABA對內(nèi)在神經(jīng)的活性化誘發(fā)的胰臟外分泌的影響

    2.1.1 GABA對電場刺激誘發(fā)的胰臟外分泌的影響。白鼠的灌流摘出胰臟在基礎(chǔ)狀態(tài)下各分泌胰液及淀粉酶的量為0.38±0.05 /15min和3.91±1.16U/15min。如加電場刺激則胰液分泌量增加,在電場刺激后15分鐘時為4.72±0.37 /15min,30分鐘時為4.66±0.29 /15min,45分鐘時為3.80±0.32 /15min,amylase分泌量也有所增加,在電場刺激后15分鐘時為69.42±7.84U/15min,30分鐘時為70.14±6.74U/15min,45分鐘時為57.22±4.46U/15min。

    在開始電場刺激一小時前起,將GABA以10μM的濃度給藥到動脈內(nèi),并施加電場刺激,則胰液分泌量增加,在電場刺激后15分鐘時為6.38±0.26 /15min,30分鐘時為5.55±0.27 /15min,45分鐘時為4.71±0.30 /15min,amylase分泌量也有所增加,在電場刺激后15分鐘時為139.03±11.24U/15min,30分鐘時為108.74±11.25U/15min,45分鐘時為97.28±7.91U/15min。

    在給藥GABA時加電場刺激的情況下胰液分泌量在15分鐘時較不給藥GABA只加電場刺激時所得的相應(yīng)值相比有顯著的增加(P<0.05),在其他時間段胰液分泌量只顯示為增加的傾向,但amylase分泌量在所有時間段都比不給藥GABA,只加電場刺激時所得的相應(yīng)值有顯著的增加(P<0.05)。另外GABA對自發(fā)的胰液分泌量及淀粉酶分泌沒有任何影響。

    2.1.2 河豚毒素和阿托品對GABA作用的影響。如圖3所示,白鼠灌流摘出的胰臟加以45分中電場刺激,胰液分泌量和淀粉酶分泌量各達到13.17±1.04 /45min和196.78±16.88U/45min。電場刺激誘發(fā)的胰液分泌量和淀粉酶分泌量因河豚毒素的加入各顯著減少為4.32±0.64 /45min和62.28±4.36U/45min(P<0.01),因阿托品的加入也各顯著抑制到6.47±0.77 /45min和92.13±5.96U/45min(P<0.01)。

    如圖4所示,白鼠灌流摘出的胰臟邊給藥GABA邊施加45分鐘的電場刺激,胰液分泌量和amylase分泌量各為16.91±0.71 /45min和345.05±28.04U/45min。在給藥GABA的情況下,由電場刺激誘發(fā)的胰液分泌量和淀粉酶分泌量因加入河豚毒素各顯著減少為6.56±0.52 /45min和78.61±7.71U/45min(P<0.01),因加入阿托品也各顯著抑制到8.16±0.78 /45min和108.07±5.40U/45min(P<0.01)。

    給阿托品的情況下,在邊給藥GABA,邊施加電場刺激所得到的胰液分泌量比只施加電場刺激所得到的胰液分泌量雖不顯著但顯示增高的傾向(P<0.1),淀粉酶分泌量則比只加電場刺激所得到的量都顯著增高(P<0.05)。

    2.1.3 GABA對乙酰膽堿誘發(fā)的胰臟外分泌的影響

    圖5所示的是GABA對白鼠灌流摘出的胰臟由乙酰膽堿誘發(fā)的胰臟外分泌的影響。白鼠灌流摘出的胰臟給藥5μM的乙酰膽堿則胰液分泌量和淀粉酶分泌量都比基礎(chǔ)狀態(tài)各顯著增加到17.60±2.12 /60min和310.01±25.51U/60min(P<0.01)。

    以10,30及100μM的濃度動脈給藥GABA并給藥乙酰膽堿,胰液分泌量隨GABA的濃度各顯著增加到28.89±4.58 /60min,43.34±5.24 /60min和39.31±6.34 /60min(P<0.01),淀粉酶分泌量各顯著增加到569.86±65.13U/60min,704.38±39.15U/60min及601.36±78.39U/60min(P<0.01)。因此GABA濃度依賴性地上升了由乙酰膽堿誘發(fā)的胰臟外分泌。

    3 討論

    這次實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)GABA雖然不影響自發(fā)的胰臟外分泌,但對CCK誘發(fā)的胰臟外分秘有上升作用(5),在本實驗中觀察了GABA對胰臟內(nèi)在的膽堿能神經(jīng)的活性化誘發(fā)的胰臟外分泌的效果。在完全阻斷外界影響的灌流摘出胰臟中,如以電場刺激胰臟內(nèi)在神經(jīng),胰液和淀粉酶的分泌大為增加。GABA(10μM)更是把電場刺激誘發(fā)的胰液和淀粉酶分泌量各上升28.4%和75.3%。河豚毒素則在給藥GABA的情況下對電場刺激誘發(fā)的胰液和淀粉酶分泌量各降低了62%和77%。已知河豚毒素是阻斷電場刺激激活胰臟內(nèi)在神經(jīng)的物質(zhì)[6],上述結(jié)果可能是因為GABA促進激活胰臟內(nèi)在神經(jīng)誘發(fā)的胰臟外分泌。另外用阿托品處理灌流摘出的胰臟來阻斷膽堿能神經(jīng)的傳達后,再給藥GABA時,由電場刺激誘發(fā)的胰液和淀粉酶分泌量各減少52%和69%。因此得出結(jié)果為GABA促進胰臟內(nèi)在膽堿能神經(jīng)活性化誘發(fā)的胰臟外分泌。

    為證明GABA促進胰臟內(nèi)在膽堿能神經(jīng)活性化誘發(fā)的胰臟外分泌的可能性,在本實驗中又觀察了GABA對膽堿神經(jīng)傳遞物質(zhì)作用的效果。白鼠灌流摘出的胰臟給藥5μM嘗試的膽堿能神經(jīng)傳達物質(zhì)乙酰膽堿,則胰液和淀粉酶的分泌量比基礎(chǔ)狀態(tài)時各增加了1000%和1880%。GABA濃度為10,30及100μM時,乙酰膽堿誘發(fā)的胰液和淀粉酶的分泌量出現(xiàn)濃度依賴性的增加。這樣的結(jié)果有力地證明GABA對胰臟內(nèi)在膽堿能神經(jīng)的活性化誘發(fā)的胰臟外分泌有促進作用的可能性。

    本實驗中對白鼠灌流摘出的胰臟進行阿托品處理來阻斷膽堿能神經(jīng)的作用,在給藥GABA的情況下施加電場刺激所誘發(fā)的胰臟外分泌也大于單獨電場刺激誘發(fā)的胰臟外分泌。這樣的結(jié)果認為是GABA對電場刺激的效果有部分殘留,進而電場刺激也激活胰臟內(nèi)在神經(jīng)中的膽堿能神經(jīng)以外的神經(jīng),GABA可能對這個神經(jīng)分泌的傳達物質(zhì)對胰臟外分泌的促進作用增加。胰臟中存在非膽堿能神經(jīng)--GRP能神經(jīng),這一神經(jīng)分泌的GRP對胰臟外分泌已知對胰臟外分泌有促進作用。本研究室已發(fā)表了白鼠的灌流摘出胰臟施加電場刺激,則不僅GRP分泌增加,而且電場刺激誘發(fā)的胰臟外分泌因著抗GRP血清被抑制(7)。并且發(fā)現(xiàn)白鼠灌流摘出的胰臟在加給藥GABA,邊施加電場刺激誘發(fā)的胰臟外分泌在給藥抗GRP的情況下抑制30%[7]。這些結(jié)果和本實驗的結(jié)果,認為電場刺激激活胰臟內(nèi)在的GRP能神經(jīng),GABA對GRP能神經(jīng)的活性化誘發(fā)的胰臟外分泌也有上升作用。

    參考文獻

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    [7]Park HS, Kwon HY, Lee YL, Chey WY and Park HJ. Role of GRPergic neurons in secretin-evoked exocrine secretion in isolated rat pancreas. Am. J. Physiol. 278: G557-G562, 2000.

    通訊作者:崔正云。

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