基于AMPK/SIRT1-FoxO1信號(hào)通路探討葛根芩連湯對(duì)db/db糖尿病小鼠肝臟氧化應(yīng)激的影響

張媛媛 ，朱向東 ，蘇菲 ，關(guān)曉文 ，翟艷會(huì) ，段永強(qiáng) ，梁建慶

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，糖尿病實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種以高血糖為主要癥狀的糖脂代謝紊亂性疾病。T2DM機(jī)制主要涉及胰島β細(xì)胞功能紊亂、胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)[1]。研究表明，氧化應(yīng)激會(huì)引起胰島β細(xì)胞功能損傷及外周組織胰島素抵抗，最終導(dǎo)致糖尿病[2]。肝臟作為胰島素的重要靶器官，對(duì)機(jī)體糖脂代謝平衡有重要作用[3]。目前認(rèn)為，肝臟胰島素抵抗與氧化應(yīng)激相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，葛根芩連湯可有效改善T2DM大鼠胰島素抵抗[4-5]。本研究旨在探究葛根芩連湯對(duì)T2DM小鼠肝臟氧化應(yīng)激的影響，以期為葛根芩連湯防治T2DM提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)db/db小鼠75只、db/m小鼠15只，8周齡，體質(zhì)量（20±5）g，常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（蘇）2016-0010。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障實(shí)驗(yàn)室，溫度21～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h明暗交替，自由攝食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2020-280）。

1.2 藥物及制備

葛根芩連湯（葛根、黃芩、黃連、炙甘草），飲片購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。上述飲片按8∶3∶3∶2比例配伍[6]，葛根先煎30 min，再與其余藥物共煎30 min，紗布過(guò)濾，殘?jiān)?倍量水繼續(xù)煎煮30 min，合并2次濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成含原藥材3.19、1.91、0.69 g/mL濃縮液。鹽酸二甲雙胍片，中美上海施貴寶股份有限公司，0.5 g/片，批號(hào)ABS5857。將藥片粉碎，用蒸餾水配制成濃度為0.02 g/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

BCA試劑盒，北京索萊寶有限科技公司，貨號(hào)20220117；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抗體、p-AMPK抗體，美國(guó)GeneTex公司，批號(hào)GTX103487、GTX109608；沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）抗體、叉頭框蛋白1（FoxO1）抗體、p-FoxO1抗體，英國(guó)Abcam公司，批號(hào)ab189494、ab52857、ab259337；GAPDH抗體、HRP羊抗兔IgG（H+L）抗體，美國(guó)Immunoway公司，批號(hào)ym3215、RS0002；ECL超敏發(fā)光液、PVDF膜，Millpore公司，批號(hào)36208ES60、R6KA9704H；RNA提取液、RT First Strand cDNA Synthesis Kit、2×SYBR Green qPCR Master Mix（None ROX），武漢Servicebio公司，批號(hào)G3013、G333、G3320；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)20220117、20220114、22020117；糖化血紅蛋白（HbA1c）測(cè)定試劑盒，美國(guó)PTS公司，批號(hào)8193302401。Advantage型血糖儀（德國(guó)羅氏公司），Power PacTMBasic垂直電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司），Gelwiew 6000Plus凝膠成像儀（廣州博鷺騰），CFX熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad），NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及給藥

將75只db/db小鼠按血糖隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組和葛根芩連湯高、中、低劑量組，每組15只，另取15只db/m小鼠作為空白組。給藥組根據(jù)臨床成人常用劑量，并參照人與動(dòng)物體表面積計(jì)算小鼠等效劑量，葛根芩連湯高、中、低劑量組分別予31.9、19.1、6.9 g/kg葛根芩連湯藥液灌胃，二甲雙胍組予0.2 g/kg二甲雙胍溶液灌胃，空白組和模型組予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)12周。

2.2 取材

末次給藥后禁食12 h，摘眼球取血，血清常溫靜置1.5 h，4 ℃、3 000×g離心10 min，血清置-20 ℃冰箱保存。冰上分離肝臟，用預(yù)冷生理鹽水清洗，濾紙吸干水分，放于凍存管中，置-80 ℃冰箱保存。

2.3 體質(zhì)量及血糖檢測(cè)

藥物干預(yù)期間，每周同一時(shí)間測(cè)量小鼠體質(zhì)量，禁食6 h后尾靜脈采血，用血糖儀測(cè)定血糖，末次給藥后禁食12 h，取尾靜脈血檢測(cè)空腹血糖（FPG）及糖化血紅蛋白（HbA1c）含量。

2.4 HE染色

將肝組織用甲醛固定，全自動(dòng)脫水機(jī)脫水，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下拍照觀察。

2.5 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

取適量肝組織，預(yù)冷PBS漂洗，稱定質(zhì)量，加入預(yù)冷PBS 5～10 mL，用高通量冷凍組織研磨器（70 Hz/min）冰上研磨，勻漿液4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液，用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)MDA含量和GSH-Px、CAT活性。

2.6 Western blot檢測(cè)

剪取0.05～0.1 g肝臟，預(yù)冷生理鹽水漂洗，加入RIPA裂解液和磷酸酶抑制劑，用高通量冷凍組織研磨器研磨，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量分析后上樣，蛋白經(jīng)電泳分離，300 mA恒流濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉（磷酸化蛋白使用5%BSA），室溫輕搖封閉2 h，TBST洗膜3次，加入AMPK、p-AMPK、SIRT1、FoxO1、p-FoxO1一抗（均為1∶1 000）和GAPDH一抗（1∶5 000），室溫輕搖1 h后放入4 ℃冰箱過(guò)夜。次日復(fù)溫30 min，TBST洗膜8 min×4次，加入二抗，37 ℃輕搖2 h，TBST洗膜8 min×4次，ECL顯色后曝光。采用Image J 1.8.0軟件進(jìn)行分析，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.7 RT-qPCR檢測(cè)

取肝組織100 mg，Trizol法提取總RNA。微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度及濃度。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)cDNA，進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對(duì)各基因mRNA表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物由寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，符合正態(tài)分布組間比較用方差分析，方差不齊用秩和檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 葛根芩連湯對(duì)模型小鼠體質(zhì)量的影響

與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組和葛根芩連湯各劑量組小鼠體質(zhì)量顯著降低（P<0.05，P<0.01）；與二甲雙胍組比較，葛根芩連湯高劑量組小鼠體質(zhì)量顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，g）

表2 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，g）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與二甲雙胍組比較，▽P<0.05

組別空白組模型組二甲雙胍組葛根芩連湯高劑量組葛根芩連湯中劑量組葛根芩連湯低劑量組只數(shù)8 8 8 8 8 8劑量/（g/kg）0.2 31.9 19.1 6.9體質(zhì)量23.81±1.17 44.60±2.00**37.81±3.23##33.09±5.01##▽38.55±3.18##39.80±2.42#

4.2 葛根芩連湯對(duì)模型小鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠FPG和HbA1c含量均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組和葛根芩連湯各劑量組小鼠FPG和HbA1c含量均顯著降低（P<0.05，P<0.01）；與二甲雙胍組比較，葛根芩連湯高劑量組小鼠FPG和HbA1c含量均顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠FPG和HbA1c含量比較（±s）

表3 各組小鼠FPG和HbA1c含量比較（±s）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與二甲雙胍組比較，▽P<0.05

組別空白組模型組二甲雙胍組葛根芩連湯高劑量組葛根芩連湯中劑量組葛根芩連湯低劑量組只數(shù)8 8 8 8 8 8劑量/（g/kg）0.2 31.9 19.1 6.9 FPG/（mmol/L）5.98 ±1.02 30.66±1.17**18.80±5.43##13.70±8.30##▽16.36±4.55##17.15±7.06##HbA1c/（mg/mL）4.31 ±0.06 10.06 ±0.73**7.30 ±1.08##6.29 ±0.86##▽7.24 ±0.35##8.13 ±1.15#

4.3 葛根芩連湯對(duì)模型小鼠肝組織病理變化的影響

空白組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，被膜完整，肝小葉分葉不明顯，肝索排列較整齊。與空白組比較，模型組小鼠可見(jiàn)較多肝細(xì)胞空泡變性，且少量肝細(xì)胞脂肪變性，胞質(zhì)內(nèi)含透明圓形脂滴，肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，胞核固縮崩解。與模型組比較，葛根芩連湯低劑量組小鼠病變程度略減輕，有少量肝細(xì)胞空泡變性，較多肝細(xì)胞脂肪變性，內(nèi)含大小不一脂滴，肝竇輕微淤血；二甲雙胍組和葛根芩連湯中、高劑量組明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肝組織形態(tài)（HE染色，×200）

4.4 葛根芩連湯對(duì)模型小鼠肝組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

與空白組比較，模型組小鼠肝組織MDA含量顯著增加，GSH-Px、CAT活性顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組和葛根芩連湯各劑量組小鼠肝組織MDA含量顯著減少，GSH-Px、CAT活性顯著升高（P<0.05，P<0.01）；與二甲雙胍組比較，葛根芩連湯高、中劑量組小鼠肝組織MDA含量顯著減少，GSH-Px、CAT活性顯著升高（P<0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠肝組織MDA、GSH-Px、CAT水平比較（±s）

表4 各組小鼠肝組織MDA、GSH-Px、CAT水平比較（±s）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與二甲雙胍組比較，▽P<0.05

組別空白組模型組二甲雙胍組葛根芩連湯高劑量組葛根芩連湯中劑量組葛根芩連湯低劑量組只數(shù)3 3 3 3 3 3劑量/（g/kg）0.2 31.9 19.1 6.9 MDA/（nmol/g）14.01 ±0.37 31.79±0.44**25.99±1.29##15.85 ±0.42##▽20.54±1.31##▽21.81±0.47##▽GSH-Px/（mol/L）0.14±0.01 0.03±0.01**0.06±0.01##0.09±0.01##▽0.11±0.01#▽0.06±0.01##CAT/（U/mg）91.71 ±2.02 57.52±1.66**67.91±1.43##84.58±1.05##▽79.98±0.37##▽74.13±2.59##▽

4.5 葛根芩連湯對(duì)模型小鼠肝組織AMPK、SIRT1、FoxO1蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組小鼠肝組織AMPK、p-AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)降低，F(xiàn)oxO1、p-FoxO1蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組和葛根芩連湯高、中劑量組小鼠肝組織AMPK、p-AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)升高，F(xiàn)oxO1、p-FoxO1蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）；與二甲雙胍組比較，葛根芩連湯高劑量組小鼠肝組織AMPK、p-AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)升高，F(xiàn)oxO1、p-FoxO1蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表5、圖2。

圖2 各組小鼠肝組織AMPK、p-AMPK、SIRT1、FoxO1、p-FoxO1蛋白免疫印跡

表5 各組小鼠肝組織AMPK、p-AMPK、SIRT1、FoxO1、p-FoxO1蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 各組小鼠肝組織AMPK、p-AMPK、SIRT1、FoxO1、p-FoxO1蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與二甲雙胍組比較，▽P<0.05

組別空白組模型組二甲雙胍組葛根芩連湯高劑量組葛根芩連湯中劑量組葛根芩連湯低劑量組只數(shù)3 3 3 3 3 3劑量/（g/kg）0.2 31.9 19.1 6.9 AMPK 1.04±0.10 0.57±0.01**0.92±0.05#1.62±0.10#▽1.02±0.02#0.99±0.05#p-AMPK 1.30±0.19 0.39±0.05**0.62±0.01#0.97±0.04##▽0.73±0.05##0.59±0.01 SIRT1 1.42±0.14 0.42±0.01**0.62±0.05#1.17±0.02##▽0.97±0.03##0.61±0.03 FoxO1 0.47±0.06 1.33±0.10**0.87±0.07##0.59±0.08##▽0.66±0.07##▽0.84±0.02##p-FoxO1 0.49±0.03 1.55±0.05**0.84±0.09##0.63±0.03##▽0.68±0.04##▽0.83±0.03##

4.6 葛根芩連湯對(duì)模型小鼠肝組織AMPK、SIRT1、FoxO1 mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組小鼠肝組織AMPK、SIRT1 mRNA表達(dá)顯著降低，F(xiàn)oxO1 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠肝組織AMPK、SIRT1 mRNA表達(dá)顯著升高，F(xiàn)oxO1 mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.05）；與二甲雙胍組比較，葛根芩連湯高劑量組小鼠肝組織AMPK、SIRT1 mRNA表達(dá)顯著升高，F(xiàn)oxO1 mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)表6。

表6 各組小鼠肝組織AMPK、SIRT1、FoxO1 mRNA表達(dá)比較（±s）

表6 各組小鼠肝組織AMPK、SIRT1、FoxO1 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；與二甲雙胍組比較，▽P<0.05，▽▽P<0.01

組別空白組模型組二甲雙胍組葛根芩連湯高劑量組葛根芩連湯中劑量組葛根芩連湯低劑量組只數(shù)3 3 3 3 3 3 AMPK 1.00±0.00 0.33±0.04**0.61±0.57#0.71±0.70#▽0.65±0.01#0.47±0.06#▽SIRT1 1.00±0.00 0.22±0.01**0.52±0.01#0.87±0.04#▽0.74±0.02#▽0.56±0.01#FoxO1 1.00±0.00 3.27±0.03**1.62±0.01#1.04±0.18#▽1.65±0.02#2.16±0.03#▽▽

5 討論

根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)統(tǒng)計(jì)，過(guò)去10年，我國(guó)糖尿病患者人數(shù)由9 000萬(wàn)增加至1.4億，增幅達(dá)56%[7]。《黃帝內(nèi)經(jīng)太素》：“五氣，五谷之氣。液在脾者，五谷液也。肥羹令人熱中，故脾行涎液，出廉泉，入口中，名曰脾癉。內(nèi)熱氣溢，轉(zhuǎn)為消渴，以蘭為湯飲之，可以除陳氣也?！标U述脾癉主要病機(jī)為中滿內(nèi)熱。仝小林院士[8]認(rèn)為，中滿日久化熱是肥胖型糖尿病發(fā)病的關(guān)鍵，也是脾癉轉(zhuǎn)為消渴的主要樞機(jī)，治療當(dāng)大劑消導(dǎo)以消中滿，同時(shí)重用苦寒以清內(nèi)熱，以清為主。

葛根芩連湯源于《傷寒論·太陽(yáng)病脈證并治》“治太陽(yáng)病桂枝證，醫(yī)反下之，利遂不止，脈促者，表未解也；喘而汗出者，葛根芩連湯主之”。全方由葛根、黃連、黃芩、炙甘草4味藥組成，主治協(xié)熱下利，臨床多用于治療濕熱所致腹瀉和痢疾。葛根芩連湯治療T2DM早期，屬古方新用[9]。方中葛根甘、辛，性涼，入陽(yáng)明經(jīng)，善解胃熱之消渴；黃芩、黃連苦寒，清肝胃之熱；炙甘草甘緩和中，調(diào)和諸藥。諸藥相伍，外解表熱，內(nèi)清里熱，清熱燥濕，生津潤(rùn)燥，切中T2DM早期“中滿內(nèi)熱，濕熱內(nèi)阻”病機(jī)。本研究選取db/db小鼠，其表現(xiàn)為肥胖及多飲、多食等癥狀，與人類T2DM表現(xiàn)極為相似，是研究T2DM的理想動(dòng)物模型[10]。氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化作用與抗氧化作用失去平衡，即活性氧簇和活性氮簇生成過(guò)多而抗氧化系統(tǒng)無(wú)法完全清除[11]。氧化應(yīng)激參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，與糖尿病關(guān)系十分密切[12]。在T2DM發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的主要機(jī)制包括葡萄糖自身氧化、蛋白質(zhì)非酶糖化、多元醇途徑激活、蛋白激酶C激活、線粒體氧化磷酸化、抗氧化系統(tǒng)清除能力減弱等[13]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，能反映氧化應(yīng)激受損程度。GSH-Px是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中重要的抗氧化酶，能清除細(xì)胞呼吸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化物和羥自由基，減輕對(duì)機(jī)體的損傷[14]。CAT是過(guò)氧化物酶體系的標(biāo)志酶，存在于動(dòng)物各種組織細(xì)胞內(nèi)，以肝臟中濃度最高[15]。本研究結(jié)果顯示，葛根芩連湯能降低模型小鼠體質(zhì)量、FPG及HbA1c，HE染色可見(jiàn)少量肝細(xì)胞空泡變性，肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死有所改善，肝組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)MDA含量減少，GSH-Px和CAT活性升高，表明葛根芩連湯可有效調(diào)節(jié)小鼠肝臟氧化應(yīng)激水平。AMPK作為動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)能量平衡的主要感受器，主要在肝臟內(nèi)表達(dá)，可調(diào)節(jié)脂肪酸氧化代謝和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)[16-17]。研究表明，AMPK磷酸化后，通過(guò)激活下游SIRT1信號(hào)通路，增強(qiáng)線粒體氧化磷酸化水平[18]。SIRT1作為FoxO1上游分子，通過(guò)抑制FoxO1磷酸化增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)活性，抑制氧化應(yīng)激產(chǎn)生[19-20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，葛根芩連湯能上調(diào)肝組織AMPK、SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)，下調(diào)FoxO1 mRNA和蛋白表達(dá)，改善db/db小鼠肝臟氧化應(yīng)激狀態(tài)，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。

綜上所述，葛根芩連湯可通過(guò)上調(diào)AMPK/SIRT1通路蛋白表達(dá)，下調(diào)FoxO1通路蛋白表達(dá)，提高db/db小鼠抗氧化能力，減少自由基生成，降低肝臟氧化應(yīng)激水平，改善T2DM。本研究進(jìn)一步揭示了葛根芩連湯改善T2DM的可能作用機(jī)制，可為中醫(yī)防治糖尿病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。