甘肅板藍(lán)根品質(zhì)與產(chǎn)區(qū)氣候因子相關(guān)性研究

李曉琴 ，馬棟 ，晉玲， ，溫雅 ，薛幸嬪 ，田怡 ，馬毅，

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； 2.西北中藏藥省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730000

板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigoticaFort.的干燥根，其性寒，味苦，歸心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、涼血利咽功效，主要含生物堿類、氨基酸類、有機(jī)酸類、木脂素類、核苷類等成分[1]。關(guān)于板藍(lán)根藥材品質(zhì)，《中華本草》指出“以條長(zhǎng)、粗大、體實(shí)者為佳”[2]。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，一般將板藍(lán)根主根粗長(zhǎng)者列為上品[3]。1984年頒布的《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》以“根呈圓柱形，長(zhǎng)17 cm以上，蘆下2 cm，外直徑1 cm以上為一等品；根呈圓柱形，蘆下直徑0.5 cm以上為二等品”[4]劃分板藍(lán)根商品規(guī)格等級(jí)。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）明確規(guī)定板藍(lán)根醇溶性浸出物不得少于25.0%、(R,S)-告依春不得少于0.020%[5]。在同一商品規(guī)格下，用于區(qū)分交易品種質(zhì)量?jī)?yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)為商品等級(jí)，而不同等級(jí)之間的板藍(lán)根存在著一定的質(zhì)量差異[6]。在自然條件下，植物生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成及次生代謝產(chǎn)物積累與氣候因子密切相關(guān)[7]，不同氣候下生長(zhǎng)的藥材其品質(zhì)會(huì)有差異[8]。因此，明確藥用植物次生代謝產(chǎn)物合成和積累的主導(dǎo)氣候因子是保證藥材良好品質(zhì)的關(guān)鍵。板藍(lán)根作為甘肅省大宗藥材之一，不同產(chǎn)地藥材外觀性狀與化學(xué)成分存在一定差異，然而鮮有其形、質(zhì)與綜合環(huán)境因素相關(guān)性研究的報(bào)道。為此，本研究采用最大熵模型及Pearson相關(guān)性分析方法對(duì)不同產(chǎn)地板藍(lán)根表型性狀和活性成分與氣候因子的相關(guān)性進(jìn)行研究，為板藍(lán)根的規(guī)范化種植及品質(zhì)提升提供依據(jù)。

1 儀器、試藥與數(shù)據(jù)

LC-2040C 3D系列高效液相色譜儀，島津制作所；HH-4型水浴鍋，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；EX2202ZH/E型萬(wàn)分之一分析天平、EX2202ZH/E型百分之一電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；RHP-100型多功能粉碎機(jī)，浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司。

(R,S)-告依春對(duì)照品（批號(hào)AF21050951，純度98%），成都埃法生物科技有限公司；磷酸、甲醇均為色譜純，無(wú)水乙醇為分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。板藍(lán)根藥材，于甘肅省36個(gè)不同產(chǎn)地采集，以“中國(guó)板藍(lán)根之鄉(xiāng)”民樂(lè)縣為重點(diǎn)采集地區(qū)。經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)馬毅副教授鑒定，為十字花科菘藍(lán)Isatis indigoticaFort.的干燥根。2020年秋季采挖，除去泥沙，曬干保存。樣品產(chǎn)地見(jiàn)表1，樣點(diǎn)分布見(jiàn)圖1。

表1 板藍(lán)根藥材樣品產(chǎn)地

圖1 甘肅省板藍(lán)根樣點(diǎn)分布

綜合考慮板藍(lán)根種植情況，一般在每年4月栽播、10月底采收，故剔除11月至次年3月的氣候指標(biāo)[9]，利用地理信息系統(tǒng)軟件ArcGIS10.2從全球氣候數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.worldclim.org/）提取并下載4－10月均溫（tavg）、降水量（prec）、輻射（srad）、水汽壓（vapr）共28個(gè)氣候因子數(shù)據(jù)。

2 方法與結(jié)果

2.1 根系性狀測(cè)定

每個(gè)樣地隨機(jī)選取處理好的10株健康樣株，測(cè)量并記錄其根長(zhǎng)、根系直徑、根干質(zhì)量。數(shù)值型數(shù)據(jù)取10株樣株的平均值。其中，根長(zhǎng)為最長(zhǎng)根長(zhǎng)，根系直徑為根部最粗處直徑；根長(zhǎng)均用直尺測(cè)量，根系直徑用游標(biāo)卡尺測(cè)量，根干質(zhì)量用百分之一電子天平稱量。

2.2 浸出物含量測(cè)定

參照2020年版《中國(guó)藥典》通則2201水溶性浸出物測(cè)定法的熱浸法測(cè)定。

2.3 (R,S)-告依春含量測(cè)定

參照2020年版《中國(guó)藥典》板藍(lán)根項(xiàng)下含量測(cè)定項(xiàng)規(guī)定方法測(cè)定。

2.3.1 色譜條件

采用Agilent HC-C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.02%磷酸水溶液（7∶93），流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm，柱溫30 ℃。理論塔板數(shù)按(R,S)-告依春計(jì)不小于5 000。在此色譜條件下對(duì)照品有穩(wěn)定的指標(biāo)成分峰且樣品峰分離度理想。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取(R,S)-告依春對(duì)照品1.00 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成濃度為40.0 μg/mL的(R,S)-告依春對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備

精密稱定板藍(lán)根藥材粉末（過(guò)4號(hào)篩）約1 g，置錐形瓶中，加水50 mL，稱定質(zhì)量，煎煮2 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置5 min，吸取上清液，16 000 r/min離心6 min，取上清液，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取40 μg/mL(R,S)-告依春對(duì)照品溶液0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，注入高效液相色譜儀，以進(jìn)樣量（μg）為自變量、峰面積（mAU）為因變量建立回歸方程：Y=3×106X+2 766.1（R2=0.999 8）。結(jié)果表明，(R,S)-告依春進(jìn)樣量在0.02～0.8 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn)

取上述40.0 μg/mL (R,S)-告依春對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得(R,S)-告依春峰面積RSD=1.8%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取板藍(lán)根樣品（B30）粉末（過(guò)4號(hào)篩）1 g，按“2.3.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定，計(jì)算(R,S)-告依春含量RSD=2.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，于0、2、4、6、8、10、12 h分別進(jìn)樣，測(cè)定(R,S)-告依春峰面積，計(jì)算其RSD=0.5%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定已知含量的同一份板藍(lán)根樣品粉末共9份，每3份為一組，分別精密加入相當(dāng)于樣品中含量80%、100%、120%的(R,S)-告依春對(duì)照品。按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果平均加樣回收率為99.24%，RSD=1.13%，見(jiàn)表2。

表2 (R,S)-告依春加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.9 樣品含量測(cè)定

按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定板藍(lán)根樣品中(R,S)-告依春含量。

2.4 復(fù)合常數(shù)構(gòu)建

基于復(fù)合質(zhì)量常數(shù)[10-11]，將36個(gè)產(chǎn)地板藍(lán)根的外觀性狀、浸出物含量及(R,S)-告依春含量相結(jié)合，計(jì)算復(fù)合質(zhì)量常數(shù)，用于板藍(lán)根藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)。質(zhì)量常數(shù)相對(duì)質(zhì)量常數(shù)復(fù)合常數(shù)A+=式中，h為根長(zhǎng)，c為待測(cè)含量，m為根干質(zhì)量，L1為2020年版《中國(guó)藥典》含量測(cè)定指標(biāo)性成分規(guī)定限量值，L2為2020年版《中國(guó)藥典》浸出物規(guī)定限量值。計(jì)算結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 36個(gè)不同產(chǎn)地板藍(lán)根樣品評(píng)價(jià)參數(shù)

由圖2可知，36個(gè)產(chǎn)地板藍(lán)根藥材樣品根長(zhǎng)為11.89～24.00 cm、根干質(zhì)量為3.93～22.56 g、根系直徑為0.74～1.33 cm；醇浸出物平均含量為34.90%～56.44%；(R,S)-告依春含量為0.023 6%～0.122 5%，各組參數(shù)差異較大，表明不同產(chǎn)地氣候因子影響板藍(lán)根藥材品質(zhì)?；趶?fù)合質(zhì)量常數(shù)，板藍(lán)根樣品質(zhì)量以B15質(zhì)量最佳，B25、B24、B12次之。

2.5 氣候因子提取與篩選

利用ArcGIS10.2軟件的空間分析模塊功能將28個(gè)氣候因子值提取至板藍(lán)根采集點(diǎn)，轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)；應(yīng)用MaxEnt3.4.4軟件，使用刀切法（Jackknife）評(píng)價(jià)氣候因子的權(quán)重，隨機(jī)選取75%數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，通過(guò)25%數(shù)據(jù)作為測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)2次運(yùn)算去除貢獻(xiàn)率為0的變量，板藍(lán)根生態(tài)分布模型均AUC>0.9，數(shù)據(jù)AUC=0.998，驗(yàn)證數(shù)據(jù)AUC=0.998，表明模型精確度極好，可信度高。選取累計(jì)貢獻(xiàn)率>95%的生態(tài)因子，初步篩選出12個(gè)生態(tài)因子，見(jiàn)表3。

表3 影響板藍(lán)根品質(zhì)的氣候因子貢獻(xiàn)率（%）

2.6 藥材品質(zhì)與氣候因子相關(guān)性分析

采用雙變量相關(guān)性分析方法，以氣候因子參數(shù)作為自變量，化學(xué)成分含量為因變量。采用SPSS25.0軟件對(duì)其進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，明確與板藍(lán)根品質(zhì)具有相關(guān)性的氣候因子，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 氣候因子與板藍(lán)根樣品評(píng)價(jià)參數(shù)Pearson相關(guān)性分析

在性狀方面，(R,S)-告依春含量與主根直徑呈極顯著負(fù)相關(guān)，與根干質(zhì)量呈顯著負(fù)相關(guān)。氣候因子方面，根系直徑與10月輻射呈顯著正相關(guān)，與4、10月降水量呈顯著負(fù)相關(guān)；醇浸出物含量與4、10月均溫，7月水汽壓呈正相關(guān)；(R,S)-告依春含量與4、6、10月降水量及7月水汽壓呈顯著正相關(guān)，與8、9月降水量呈極顯著正相關(guān)，與8、9月輻射呈顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論

本研究在可控范圍內(nèi)盡量保持樣品一致性，對(duì)甘肅省36個(gè)產(chǎn)地的板藍(lán)根根長(zhǎng)、根系直徑、根干質(zhì)量、醇浸出物含量、(R,S)-告依春含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地氣候因子下每組參數(shù)差異較大。其中以民樂(lè)縣順化鎮(zhèn)板藍(lán)根藥材復(fù)合質(zhì)量常數(shù)最大，質(zhì)量最佳，最適宜板藍(lán)根種植。但民樂(lè)縣13個(gè)樣地復(fù)合質(zhì)量常數(shù)參差不齊（6.77～26.67），考慮板藍(lán)根肉質(zhì)根的生長(zhǎng)、成熟及(R,S)-告依春作為次生代謝產(chǎn)物對(duì)遺傳特性的影響外，很大程度上受生長(zhǎng)環(huán)境、氣候、土壤等因素直接或間接影響。在經(jīng)緯度等地理因子，光照[12]、溫度[13]、水分[14]等氣候因子和土壤肥力[15]等生態(tài)因子的綜合作用下，板藍(lán)根的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程受到調(diào)節(jié)，表現(xiàn)出各產(chǎn)地間藥材外觀性狀、活性成分含量均出現(xiàn)較大差異性。氣候因子是生態(tài)環(huán)境中的重要因子[16]，因此，深入探討氣候因子對(duì)藥用植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響，對(duì)于提高藥材品質(zhì)及藥用植物生產(chǎn)規(guī)范化、現(xiàn)代化、規(guī)?；哂兄匾饬x。

MaxEnt3.4.4軟件基于最大熵原理，以物種分布和環(huán)境變量為基礎(chǔ)，利用數(shù)學(xué)模型統(tǒng)計(jì)分析熵最大時(shí)物種的分布狀態(tài)，在分布數(shù)據(jù)較少時(shí)，最大熵模型的預(yù)測(cè)結(jié)果比同類預(yù)測(cè)模型更精確[17]。本研究基于最大熵模型從28個(gè)氣候因子數(shù)據(jù)中提取對(duì)板藍(lán)根具有貢獻(xiàn)率的12個(gè)氣候因子，再對(duì)其與板藍(lán)根根部參數(shù)及活性成分進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示輻射及降水量是影響板藍(lán)根品質(zhì)的關(guān)鍵因素。

板藍(lán)根的生長(zhǎng)期可分為4個(gè)階段，依次是苗期（5－6月）、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期（6－7月）、肉質(zhì)根生長(zhǎng)期（7－9月）、肉質(zhì)根成熟期（9－10月）[18]。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期是板藍(lán)根扎根生長(zhǎng)的關(guān)鍵時(shí)期，這一時(shí)期太陽(yáng)輻射量逐漸升高，地上部分快速增長(zhǎng)，密度增大遮蓋地表，一定程度上減弱了地表蒸發(fā)，但該時(shí)期植株葉片蒸騰作用逐漸增強(qiáng)，同時(shí)大氣溫度較高，蒸發(fā)量大，需要足夠的水分來(lái)保證下一階段肉質(zhì)根的正常生長(zhǎng)，而8、9月降雨量達(dá)到全年最高，充分保證了肉質(zhì)根的生長(zhǎng)與成熟；根系進(jìn)入肉質(zhì)根成熟期后，根部開(kāi)始迅速膨大，蒸騰作用也隨氣溫逐漸降低而逐漸減弱，植株的生長(zhǎng)中心轉(zhuǎn)移，地上部將養(yǎng)分輸送到地下開(kāi)始進(jìn)行有效成分的積累，需水量也表現(xiàn)下降趨勢(shì)，降水量減少恰好符合這一需求；這一時(shí)期也是地下部分有效成分積累的關(guān)鍵時(shí)期，有效成分產(chǎn)量主要來(lái)自光合作用，太陽(yáng)輻射卻在逐漸減少，不利于有效成分的積累，故表現(xiàn)出8、9月太陽(yáng)輻射與(R,S)-告依春含量呈顯著負(fù)相關(guān)。此外，在地理因素上，本次調(diào)研區(qū)域內(nèi)隨著地區(qū)的變化年均太陽(yáng)輻射總量降低和降水量增加可以促進(jìn)(R,S)-告依春含量的積累，表現(xiàn)為從西向東由河西地區(qū)向隴東地區(qū)推進(jìn)，板藍(lán)根中(R,S)-告依春含量升高，從南向由隴南地區(qū)向隴中地區(qū)推進(jìn)，板藍(lán)根中(R,S)-告依春含量升高；但河西地區(qū)的板藍(lán)根(R,S)-告依春含量相對(duì)較低，具體原因還需進(jìn)一步實(shí)地調(diào)研和分析。

綜上所述，板藍(lán)根品質(zhì)的形成與氣候因子密切相關(guān)。7－10月太陽(yáng)輻射和降水量對(duì)板藍(lán)根的栽培有顯著影響，這與板藍(lán)根喜溫暖、怕水澇[19]的習(xí)性一致。此外，在實(shí)現(xiàn)板藍(lán)根藥材“優(yōu)形”和“優(yōu)質(zhì)”的雙重條件下，還要關(guān)注其他栽培條件，有研究分析播種期與板藍(lán)根形態(tài)學(xué)特征、產(chǎn)量及質(zhì)量均呈負(fù)相關(guān)[20]，提示在板藍(lán)根規(guī)范化種植過(guò)程中不僅要考慮選址，還要綜合考慮播種期等其他因素，以提高藥材品質(zhì)。