基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討葛根芩連湯治療放射性腸炎的作用機(jī)制

朱 旭 張 博 張思萌 夏曉萌 吳登斌*

2017年中國(guó)惡性腫瘤流行病學(xué)分析，每年至少49.9萬(wàn)例新發(fā)盆腔惡性腫瘤[1]，其中20%～60%需要放射治療[2]。由于小腸上皮細(xì)胞對(duì)放療高度敏感，放射性腸炎是放射治療過(guò)程中的主要并發(fā)癥，是小腸和大腸在接受放射治療過(guò)程中出現(xiàn)的放射性損傷炎癥反應(yīng)[3]。其表現(xiàn)為急性或慢性腹瀉、便血和里急后重，嚴(yán)重影響腫瘤患者的生命質(zhì)量。放射性腸炎成為直腸癌等腹部腫瘤放射劑量增加的限制性因素。漢代名醫(yī)張仲景在《傷寒雜病論》中對(duì)葛根芩連湯進(jìn)行了詳細(xì)描述，方劑由葛根、黃芩、黃連及甘草4味中藥組成，主治太陽(yáng)表證、協(xié)熱下利，是治療濕熱所致腹瀉和痢疾的經(jīng)典方。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其治療放射性腸炎腸道濕熱證療效較好[4-7]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法就葛根芩連湯治療放射性腸炎的作用機(jī)制進(jìn)行分析。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 收集葛根芩連湯活性成分、作用靶點(diǎn)等信息

以“葛根、黃芩、黃連、甘草”為關(guān)鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）進(jìn)行檢索，以每味中草藥的化學(xué)成分、類(lèi)藥性（DL）≥0.18、口服生物利用度（OB）≥30%為篩選依據(jù)，對(duì)藥物的有效成分進(jìn)行篩選。然后在數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)以有效成分為依據(jù)進(jìn)行檢索，對(duì)其作用靶點(diǎn)進(jìn)行確定。然后在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)導(dǎo)入作用靶點(diǎn)，進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 方法

1.2.1 葛根芩連湯共同作用靶點(diǎn)的篩選 將葛根芩連湯通過(guò)基因標(biāo)準(zhǔn)化處理得到的基因名稱(chēng)全部導(dǎo)入Excel表格中，取交集函數(shù)，篩出葛根芩連湯共同作用靶點(diǎn)，并對(duì)“葛根芩連湯潛在作用靶點(diǎn)”用imageGP工具繪制韋恩圖。

1.2.2 收集放射性腸炎靶點(diǎn)信息 以放射性腸炎相關(guān)的靶點(diǎn)、"radiation enteritis" "radiation enteropathy"為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)進(jìn)行檢索，然后合并兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出的靶點(diǎn)，再在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)導(dǎo)入作用靶點(diǎn)，進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2.3 收集葛根芩連湯治療放射性腸炎靶點(diǎn)及分析 在Excel表格中導(dǎo)入放射性腸炎背景網(wǎng)絡(luò)及葛根芩連湯的作用靶點(diǎn)，取交集，得到葛根芩連湯治療放射性腸炎的共同潛在基因靶點(diǎn)。再將共同作用的靶點(diǎn)、靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的葛根芩連湯活性成分、葛根芩連湯分別導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中，構(gòu)建“葛根芩連湯-治療成分-靶點(diǎn)-放射性腸炎網(wǎng)絡(luò)圖”，對(duì)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的重要性通過(guò)Cytoscape3.7.2中“NetworkAnalyzer”功能對(duì)自由度（Degree）等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析。

1.2.4 構(gòu)建靶蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)及擴(kuò)充靶蛋白

在String數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)輸入獲得的放射性腸炎治療的作用靶點(diǎn)，物種選擇“Home sapiens”，模式選擇“multiple proteins”，在默認(rèn)設(shè)置下，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)Cytoscape 3.7.2中“NetworkAnalyzer”功能對(duì)所獲取數(shù)據(jù)進(jìn)行Degree等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析。

1.2.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析

在DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)輸入擴(kuò)充靶點(diǎn)及葛根芩連湯治療放射性腸炎的共同作用靶點(diǎn)，分別進(jìn)行GO富集分析、KEGG通路富集分析，將所獲得的結(jié)果導(dǎo)入Excel表格，篩選設(shè)定P≤0.05，根據(jù)P值將GO生物過(guò)程和KEGG 通路由小到大排序，選取前10位的GO生物過(guò)程和KEGG通路，利用imageGP工具繪制葛根芩連湯治療放射性腸炎主要GO生物過(guò)程氣泡圖和葛根芩連湯治療放射性腸炎的KEGG通路氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 葛根芩連湯作用靶點(diǎn)信息收集

共篩選出128個(gè)有效活性成分，其中葛根、黃芩、黃連、甘草分別為3個(gè)、31個(gè)、9個(gè)、88個(gè)，葛根芩連湯的主要活性成分見(jiàn)表1。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)輸入128個(gè)有效成分，得到潛在作用靶點(diǎn)2 191個(gè)。通過(guò)Excel刪除重復(fù)值，得到261個(gè)基因靶點(diǎn)是葛根芩連湯共同的潛在作用靶點(diǎn)。

表1 葛根芩連湯主要活性成分

2.2 葛根芩連湯治療放射性腸炎靶點(diǎn)的收集及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

獲得人類(lèi)放射性腸炎相關(guān)靶點(diǎn)共41個(gè)。取交集后得到相關(guān)靶點(diǎn)基因8個(gè)，分別為T(mén)GFB1，NOS2，EGF，IL-6，MMP1，THBD，SERPINE1，MPO（圖1）。

圖1 葛根芩連湯與人類(lèi)放射性腸炎共作用靶點(diǎn)

2.3 靶PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

PPI網(wǎng)絡(luò)包含78個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 196條邊(節(jié)點(diǎn)間的相互作用關(guān)系)，平均Degree值為30.7。此網(wǎng)絡(luò)中Degree 值大于等于30的從高到低排序依次為IL-6，VEGFA，EGF，TNF，IGF1，CXCL8，SRC，EGFR，MMP9，SERPINE1，TGFB1，TIMP1，STAT3，IL-10，ERBB2，IL-4，PLG，CCL2，HRAS（圖2）。

圖2 葛根芩連湯關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO和KEGG通路分析結(jié)果

得到20個(gè)生物過(guò)程（GO）前10位的分別為細(xì)胞遷移的正向調(diào)控，MAPK信號(hào)通路，細(xì)胞黏附，上皮細(xì)胞的增殖，白細(xì)胞遷移，蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的正向調(diào)節(jié)，信號(hào)受體活動(dòng)的正向調(diào)節(jié)，miRNA基因沉默機(jī)制中的產(chǎn)物，調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)組織（圖3）。得到16條KEGG通路，前5位的分別為細(xì)胞分化的負(fù)向調(diào)控，凋亡信號(hào)通路，RNA聚合酶Ⅱ正向調(diào)控pri-miRNA轉(zhuǎn)錄，多細(xì)胞生物的體內(nèi)平衡，上皮細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)（圖4）。

圖3 GO生物過(guò)程

圖4 KEGG通路氣泡圖

通過(guò)GO富集分析顯示黏附斑激酶（FAK）及其信號(hào)通路，人巨細(xì)胞病毒感染，感染性腸道疾病，Th17細(xì)胞分化，胃癌，Rap1信號(hào)通路，relaxin信號(hào)通路，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用，MAPK信號(hào)通路，胰腺癌，PI3K-Akt信號(hào)通路，foxo信號(hào)通路，乙型肝炎病毒，HIF-1信號(hào)通路，膀胱癌，AGE-RAGE信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中，腫瘤蛋白多糖，EGFR酪氨酸激酶抑制劑等，是葛根芩連湯治療放射性腸炎的作用機(jī)制（圖5）。

圖5 GO富集分析

3 討論

近年的研究認(rèn)為放射性腸炎的發(fā)生與腸上皮細(xì)胞的直接損傷，腸道微生物黏膜屏障破壞，輻射誘發(fā)細(xì)胞因子介導(dǎo)的腸道炎癥等機(jī)制有關(guān)[8]。多年的臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯對(duì)于預(yù)防和治療腸道炎癥能夠起到一定的作用[9-10]。現(xiàn)代藥理研究表明葛根芩連湯能降低血清IL-6、TNF-α的表達(dá)，減輕腸道炎癥反應(yīng)[11]，調(diào)控MMP-9/P38MARK途徑減輕腸道黏膜損傷，修復(fù)腸道黏膜上皮屏障等[12]。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度對(duì)葛根芩連湯治療放射性腸炎的作用機(jī)制進(jìn)行探討，網(wǎng)絡(luò)分析顯示葛根芩連湯共有活性成分128種，GO富集分析以及KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，葛根芩連湯對(duì)放射性腸炎損傷修復(fù)可能的機(jī)制最主要的首先包括FAK及其信號(hào)通路，F(xiàn)AK是一種酪氨酸激酶，可以通過(guò)刺激胞內(nèi)PI3K-Akt信號(hào)通路影響下游foxo信號(hào)通路，調(diào)節(jié)HIF-1信號(hào)通路以及影響Ras/MAPK等信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)。其次是MAPK信號(hào)通路，通過(guò)促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的凋亡、遷移，結(jié)合惡性腫瘤的臨床分析推測(cè)，葛根芩連湯治療放射性腸炎的機(jī)制首先與FAK及其信號(hào)通路、MAPK通路相關(guān)的促進(jìn)上皮細(xì)胞的損傷修復(fù)有關(guān)。再次，葛根芩連湯對(duì)炎癥反應(yīng)的影響，通過(guò)調(diào)控Th17細(xì)胞分化實(shí)現(xiàn)，Th17細(xì)胞與Th1/Th2細(xì)胞同屬免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，參與腸道炎癥反應(yīng)，具有促炎癥、致炎作用。基于目前的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析認(rèn)為葛根芩連湯可能通過(guò)促進(jìn)上皮細(xì)胞的修復(fù)，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化，治療放射性腸炎。近年來(lái)研究表明，腸道微環(huán)境中，腸上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞與腸道菌群是3個(gè)相互影響、密切相關(guān)的群體[13]，腸道微生物群維持上皮屏障的完整性并構(gòu)建黏膜免疫系統(tǒng)，上皮細(xì)胞通過(guò)構(gòu)建化學(xué)和物理屏障將腸道微生物與腸壁分離，從而構(gòu)建宿主共生關(guān)系，腸道免疫細(xì)胞參與維持健康的微生物群和加強(qiáng)上皮屏障功能，因此推斷，葛根芩連湯在影響了上皮細(xì)胞的修復(fù)和免疫細(xì)胞的分化同時(shí)，會(huì)對(duì)腸道菌群產(chǎn)生影響。作為一種治療腹瀉的經(jīng)典方劑，研究表明葛根芩連湯可以通過(guò)改變腸道內(nèi)有益菌數(shù)量發(fā)揮治療疾病的作用[14]。但對(duì)于治療放射性腸炎是否有影響，還知之甚少，也是未來(lái)可以研究的方向。