微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在中藥中的應(yīng)用

馬 莎 李桂香 郎 茜 楊本壽

中藥是我國的民族瑰寶，在國內(nèi)及國際市場上受到了越來越多的關(guān)注。中藥活性成分種類繁雜，主要包括糖和苷、生物堿、黃酮類、萜類等[1]。這些活性成分在中藥中往往存在含量低、不良反應(yīng)大、有效成分水溶性差等缺點(diǎn)，限制了其在臨床中的應(yīng)用。因此，“增效減毒”逐漸成為了中藥研發(fā)的重要方向。微生物轉(zhuǎn)化在提高有效成分含量的同時(shí)還可以產(chǎn)生新的化合物、降低毒性成分，通過研究中藥材的微生物轉(zhuǎn)化過程來研究其在體內(nèi)的代謝過程及中藥的作用機(jī)制等[2-3]。

微生物繁殖速度快、擁有大量的酶系，常被用于中藥成分的生物轉(zhuǎn)化。其轉(zhuǎn)化本質(zhì)是外源性中藥底物通過微生物體系產(chǎn)生的酶對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾及改造的生物化學(xué)過程[4-5]。目前，可用于催化各種化學(xué)反應(yīng)的酶有糖化酶、β-糖苷酶、脫氫酶、羥化酶等。微生物轉(zhuǎn)化中藥具有以下特點(diǎn)：微生物資源豐富，具有生物多樣性，為轉(zhuǎn)化提供了強(qiáng)大的物質(zhì)基礎(chǔ)；反應(yīng)條件溫和；酶對底物的催化具有較高的專一性和選擇性；微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率快；優(yōu)化條件可使轉(zhuǎn)化率提高[6-8]。

1 微生物轉(zhuǎn)化類型

大部分菌種如霉菌、酵母菌和細(xì)菌都能使多種化合物發(fā)生不同的反應(yīng)。其中利用霉菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化的研究報(bào)道較多。微生物轉(zhuǎn)化包括糖基化、羥基化、環(huán)氧化、脫氫、水解等各類化學(xué)反應(yīng)[9-10]。人們可以利用微生物對化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，不僅能發(fā)現(xiàn)大量促使反應(yīng)發(fā)生的酶，還能獲得更多的衍生物利于工業(yè)化的生產(chǎn)。

1.1 羥基化反應(yīng)

羥基化是指向有機(jī)化合物分子上引入羥基的反應(yīng)，傳統(tǒng)的化學(xué)合成很難在結(jié)構(gòu)復(fù)雜且不活潑的C原子上引入羥基。馬媛等[11]的研究發(fā)現(xiàn)甘草次酸經(jīng)過短刺小克銀漢霉轉(zhuǎn)化后得到了3-酮基-7β,15α-二羥基-18β-甘草次酸、7β-羥基-18β-甘草次酸和15α-二羥基-18β-甘草次酸等6個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中3-酮基-15β-二羥基-18β-甘草次酸為新化合物。該轉(zhuǎn)化過程表現(xiàn)出短刺小克銀漢霉對甘草次酸的羥基化作用。Deng等[12]的研究發(fā)現(xiàn)去氫穿心蓮內(nèi)酯可以被短刺小克銀漢霉轉(zhuǎn)化為1-羥基、7-羥基、9-羥基代謝產(chǎn)物。

1.2 糖基化反應(yīng)

糖基化反應(yīng)通常是在化合物糖鏈上定向或不定向引入一個(gè)或多個(gè)糖基，微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的生物活性經(jīng)糖基化修飾后會(huì)得到優(yōu)化，從而進(jìn)一步提高其生物利用度。

人參皂苷C-K、Rg3、Rh1、Rh2由于在人參中的含量較低，且不易在自然界中直接獲得，因此常被稱為稀有人參皂苷，但與常見的人參皂苷比較卻表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力和清除自由基等作用[13-14]。武倫鵬等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，人參主要皂苷Rb1，能夠被真菌GH26高效地轉(zhuǎn)化為藥理活性更強(qiáng)的稀有人參皂苷C-K，轉(zhuǎn)化率高達(dá)76.6%。陳賀等[16]通過巴氏醋酸桿菌轉(zhuǎn)化了人參中的主要皂苷Rb1、Rb2、Rd和Rg1，從而獲得人參稀有皂苷C-K，其含量達(dá)到0.11 mg/g。

1.3 環(huán)氧化反應(yīng)

環(huán)氧化反應(yīng)常見于萜類化合物，多發(fā)生在化合物的雙鍵部位，可提高化合物活性。周麗娜[17]的研究表明莪術(shù)二酮經(jīng)雅致小克銀漢霉AS3.2028轉(zhuǎn)化后，得到（1S,10S）-1,10-環(huán)氧莪術(shù)二酮和（1R,10R）-1,10-環(huán)氧莪術(shù)二酮兩種十碳環(huán)外碳碳雙鍵發(fā)生環(huán)氧化的產(chǎn)物。而莪術(shù)醇經(jīng)轉(zhuǎn)化后得到了一種七元環(huán)外碳碳雙鍵被環(huán)氧化的產(chǎn)物10S,14-環(huán)氧莪術(shù)醇。

1.4 脫氫或脫水反應(yīng)

脫氫或脫水反應(yīng)主要指化合物脫氫或脫水生成雙鍵。盧燈翠等[18]的研究發(fā)現(xiàn)左旋四氫巴馬汀和四氫小檗堿能夠被輪枝霉菌（Verticillium sp.WJ-03）轉(zhuǎn)化生成產(chǎn)物巴馬汀以及小檗堿。并得出結(jié)論該生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型為脫氫反應(yīng)，且與原小檗堿類生物堿的生物合成途徑一致。李合平等[19]利用變形斑沙雷菌對穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化可以得到脫水穿心蓮內(nèi)酯，收率為70.1%。

1.5 水解反應(yīng)

近年來，利用微生物及其酶對外源化合物進(jìn)行糖水解研究較多，通常見于苷類物質(zhì)的糖水解。胡宏秀[9]利用橄欖色毛殼菌和灰葡萄孢菌，分別對原薯蕷皂苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，前者得到4個(gè)已知轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。后者轉(zhuǎn)化得到1個(gè)糖水解產(chǎn)物薯蕷次級(jí)皂B。李粟琳等[20]應(yīng)用保加利亞乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等菌種成功水解了三七、人參和西洋參中的糖苷鍵，使藥材中所含的常見人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷Rh1及C-K等。為今后進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)化菌種的選育和轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化提供了條件。

2 微生物轉(zhuǎn)化在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1 產(chǎn)生新的化合物

青蒿素具有抗瘧、抗腫瘤、抗炎等多種生理活性。但青蒿素的水溶性差、生物利用度低。Zhan等[21]研究了雅致小克銀漢霉對青蒿素的微生物轉(zhuǎn)化，分別得到4種產(chǎn)物，其中6β，7α-二羥基青蒿素為新化合物，且該化合物由于親水基團(tuán)羥基的引入，相較于青蒿素具有更高的抗瘧活性及水溶性。王照華[22]利用刺孢小克銀漢霉和日根霉分別轉(zhuǎn)化厚樸中的主要藥效成分厚樸酚與和厚樸酚，獲得了17個(gè)新化合物，為新藥的研發(fā)提供了有利依據(jù)。

2.2 提高有效成分含量或增強(qiáng)中藥療效

中藥中的天然有效成分包括苷類、萜類、生物堿及黃酮類等，然而其含量往往不高。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，中藥經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化后有效成分發(fā)生變化，可增加其活性組分含量或高活性化合物生成，從而提高了藥效，為新藥的開發(fā)提供新思路[23-24]。

董建偉[25]利用燕麥廉孢菌（Fusariumavenaceum-YIM3065）和尖刀廉孢菌（Fusariumoxysporum-YIM3068）發(fā)酵白及，能夠明顯提高白及的總酚含量、抗菌活性及抗氧化活性；天麻的抗菌活性經(jīng)過接骨木鐮孢菌轉(zhuǎn)化后也得到了顯著提高。Xing等[26]通過地絲霉發(fā)酵丹參，在提高丹酚酸B含量的同時(shí)也增強(qiáng)了丹參的抗氧化活性。

2.3 降低中藥不良反應(yīng)

在中藥的臨床使用過程中，難免會(huì)存在一些不良反應(yīng)較大的藥材，從而限制了其在臨床上的應(yīng)用范圍。研究表明，中藥中的毒性成分可以利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾或分解，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為低毒或無毒成分[27-29]。

潘自皓等[30]利用短刺小克銀漢霉對馬錢子堿硫酸鹽和士的寧硝酸鹽進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，使得馬錢子的毒性得到了大幅度下降，2種底物的平均轉(zhuǎn)化率接近78%。

2.4 作為研究藥物代謝機(jī)制的輔助手段

部分中藥在動(dòng)物體內(nèi)的藥物代謝機(jī)制與微生物體內(nèi)的代謝過程類似，因此利用微生物轉(zhuǎn)化得到的代謝產(chǎn)物不僅可預(yù)測藥物在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的代謝情況，還可為體內(nèi)代謝提供對照產(chǎn)物。同時(shí)其有助于中藥代謝產(chǎn)物的微量甚至痕量分析，以便充分了解藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過程[31]。

2.5 去除中藥中的大分子雜質(zhì)

中藥中的雜質(zhì)成分不僅會(huì)干擾有效成分的提取，降低中藥藥效，而且還會(huì)增大制劑的服用量。研究發(fā)現(xiàn)，利用微生物轉(zhuǎn)化可以較好地除去部分大分子雜質(zhì)[32]。實(shí)驗(yàn)證明，利用菌株產(chǎn)生的糖苷水解酶和蛋白酶能分別去除多肽和蛋白類藥物中的高分子糖類雜質(zhì)以及多糖類藥物中的蛋白類雜質(zhì)，使低分子活性成分易通過血腦屏障，提高療效，還能提高多糖的提取率[33]。

中藥進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化是在化學(xué)、中藥學(xué)和微生物學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型學(xué)科，具有強(qiáng)大的生命力。在提高中藥療效、增加有效成分含量、降低不良反應(yīng)、改善水溶性和生物利用度等方面呈現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢，在很大程度上加快了中藥新藥的開發(fā)和中藥現(xiàn)代化進(jìn)程。它將現(xiàn)代生物技術(shù)融入了中藥的研究，必將引領(lǐng)中藥新藥的研發(fā)方向，提高中藥行業(yè)的國際競爭力，為中藥走向世界做出新的貢獻(xiàn)。