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      N乙酰L纈氨酸的合成與分析

      2023-02-24 00:00:00姚小平劉勛王艷領(lǐng)
      現(xiàn)代鹽化工 2023年6期
      關(guān)鍵詞:乙酸酐纈氨酸母液

      摘要:建立高效液相色譜紫外檢測(cè)分離測(cè)定L纈氨酸和N乙酰L纈氨酸的方法,以此為手段對(duì)N乙酰L纈氨酸的制備過程進(jìn)行監(jiān)控。研究了以L纈氨酸為原料,乙酸酐為乙?;噭┲苽銷乙酰L纈氨酸的工藝。確定了乙酰化反應(yīng)條件、中和結(jié)晶條件等,獲得的優(yōu)化工藝條件為:100 gL纈氨酸,500 mL水,90 mL乙酸酐,溫度35 ℃,pH 8.0,反應(yīng)時(shí)間2 h。隨后用37%濃鹽酸中和至pH 1.5,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),冷卻結(jié)晶12 h,得N乙酰L纈氨酸產(chǎn)品。母液濃縮回收利用。產(chǎn)品總收率為122%,通過FTIR,HNMR和HPLC對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證,質(zhì)量達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

      關(guān)鍵詞:N乙酰L纈氨酸;乙?;?;L纈氨酸L纈氨酸是組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸之一,屬于支鏈氨基酸,也是人體必需的8種氨基酸和生糖氨基酸,與異亮氨酸和亮氨酸一起作用可以促進(jìn)身體正常生長(zhǎng),修復(fù)組織,調(diào)節(jié)血糖,并提供機(jī)體所需要的能量[1]。N乙酰L纈氨酸為重要的精細(xì)有機(jī)化工中間體,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、化學(xué)工業(yè)等領(lǐng)域[2]。氨基酸均有一個(gè)aNH2,可以與適當(dāng)?shù)囊阴;噭┓磻?yīng),常用的乙?;噭┯幸宜?、乙酰氯和乙酸酐。使用乙酸進(jìn)行乙酰化需在高溫下反應(yīng),易導(dǎo)致氨基酸消旋;乙酰氯的反應(yīng)活性過強(qiáng),容易水解,不宜在水溶液中進(jìn)行反應(yīng)。因此最常用的乙酰化試劑是乙酸酐,在微堿性的水溶液中與氨基酸反應(yīng)生成乙酰氨基酸[35]。

      已有N乙酰L酪氨酸、N乙酰L半胱氨酸、N乙酰L亮氨酸、N乙酰L谷氨酸、N乙酰L蘇氨酸等乙酰氨基酸制備的報(bào)道[611]?;竟に囀牵簩被崛芙庠谌鯄A性水溶液中,加入乙酸酐進(jìn)行乙?;磻?yīng),再?gòu)姆磻?yīng)液中分離提取目標(biāo)產(chǎn)物。由于各種氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)不同,物理、化學(xué)性質(zhì)有很大差異,因此制備各種乙酰氨基酸的工藝方法和工藝參數(shù)都有所不同。尚未報(bào)道N乙酰L纈氨酸的制備。

      高效液相色譜結(jié)合紫外檢測(cè)已被用于酪氨酸等氨基酸的分離測(cè)定[1214],也被用于某些乙酰氨基酸的分離測(cè)定,如乙酰半胱氨酸,乙酰酪氨酸等[1520]。但未見分離測(cè)定L纈氨酸和N乙酰L纈氨酸的報(bào)道。

      本文首先建立了一種高效液相色譜紫外檢測(cè)分離測(cè)定L纈氨酸和N乙酰L纈氨酸的方法。以此為手段對(duì)制備N乙酰L纈氨酸的工藝過程進(jìn)行監(jiān)控,研究了乙酸酐用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等對(duì)乙酰化反應(yīng)的影響,研究了產(chǎn)品的優(yōu)化結(jié)晶條件,由此確定優(yōu)化的制備工藝參數(shù)。

      1實(shí)驗(yàn)部分

      1.1儀器與試劑

      LabTECH高效液相色譜儀:北京萊伯泰科儀器有限公司,配備紫外檢測(cè)器;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-301E):上?;ゼ褍x器設(shè)備有限公司);酸度計(jì)(PHS-25):杭州雷磁分析儀器廠;集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-10S):天津華鑫儀器有限公司;蠕動(dòng)泵(BT-100):重慶杰恒蠕動(dòng)泵有限公司;循環(huán)水式多用真空泵(SHZ-D140)、傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet iS50):賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;500 MHz核磁共振譜儀:AVANCE,美國(guó)布魯克科技有限公司。

      L纈氨酸:工業(yè)級(jí),江蘇漢菱生物工程有限公司提供;L纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)品:采用工業(yè)級(jí)L纈氨酸精制;N乙酰L纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)品:自制N乙酰L纈氨酸再精制;乙酸酐: 分析純;氫氧化鈉:工業(yè)級(jí)片堿,重慶天原化工公司;濃鹽酸:37%,分析純;甲醇為色譜純?cè)噭?。其他試劑為分析純以上?/p>

      1.2實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1高效液相色譜分離測(cè)定L纈氨酸和N乙酰L纈氨酸1.2.1.1標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液的制備

      分別稱取0.250 g L纈氨酸、N乙酰L纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,混合后加水溶解,轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中以水定容,得質(zhì)量濃度為1.00 g/L的L纈氨酸、N乙酰L纈氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。試驗(yàn)時(shí)根據(jù)需要,準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,稀釋至一定體積,制備一定質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液。

      1.2.1.2供試液的制備方法

      準(zhǔn)確移取或稱取適量的樣品,用水溶解后轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中定容。

      1.2.1.3色譜條件

      色譜柱(C18,5 μm,250×4.6 mm id),流速0.8 mL/min,柱溫35 ℃,進(jìn)樣體積20 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

      流動(dòng)相:40/60甲醇/10 mmol/L磷酸鹽,pH 3.0。其中10 mmol/L磷酸鹽溶液:稱取1.36 g磷酸二氫鉀,加水約900 mL溶解,用10%稀磷酸調(diào)pH至3.0,再加水至1 000 mL。

      1.2.2N乙酰L纈氨酸的制備方法

      1.2.2.1L纈氨酸的乙?;?/p>

      將250 mL三口瓶置于磁力攪拌恒溫水浴鍋中,加入10 g L纈氨酸、100 mL水,將酸度計(jì)的pH電極插入瓶中監(jiān)控物料pH。調(diào)節(jié)水浴鍋溫度至規(guī)定值,滴加30%NaOH至規(guī)定的pH。此時(shí)為乙酸酐加入零點(diǎn),開始滴加規(guī)定量乙酸酐,同時(shí)滴加30%NaOH維持在規(guī)定的pH,滴加乙酸酐總耗時(shí)2 h,滴加完乙酸酐后再反應(yīng)0.5 h。

      1.2.2.2中和結(jié)晶

      加37%濃鹽酸中和至pH 1.5。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至70 mL,降溫,攪拌結(jié)晶,12 h后抽濾,用水洗3次,80 ℃烘干得N乙酰L纈氨酸精品。母液另行處理。

      1.2.2.3回收母液中N乙酰L纈氨酸

      母液與洗水合并,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至出現(xiàn)結(jié)晶,緩緩降溫,攪拌結(jié)晶,12 h后抽濾,得N乙酰L纈氨酸粗品,可用于下一批乙?;瘯r(shí)配料。

      2結(jié)果與討論

      2.1分析方法的建立

      通過實(shí)驗(yàn)研究,建立了高效液相色譜分離測(cè)定L纈氨酸和N乙酰L纈氨酸的方法。典型色譜圖見圖1。

      2.2乙酰化反應(yīng)的影響因素

      乙酸酐是氨基進(jìn)行乙?;某S迷噭?,其反應(yīng)活性適中,反應(yīng)條件易控制??稍谒芤褐信c氨基酸的氨基反應(yīng)生成N乙酰氨基酸。本研究選擇乙酸酐對(duì)L纈氨酸進(jìn)行乙酰化,反應(yīng)式見圖2。

      在水溶液中,乙酸酐還會(huì)發(fā)生水解副反應(yīng),導(dǎo)致參與主反應(yīng)的乙酸酐減少,需要增加乙酸酐用量。在乙?;磻?yīng)和乙酸酐水解過程中都會(huì)生成大量乙酸,為維持反應(yīng)體系的pH,需加堿中和反應(yīng)中產(chǎn)生的乙酸。

      2.2.1乙酸酐用量對(duì)乙?;磻?yīng)的影響

      采用1.2.2.1的方法,控制乙?;磻?yīng)pH在8.0左右,水浴溫度為35 ℃,在滴加乙酸酐反應(yīng)階段,每滴加一定量乙酸酐,暫停滴加乙酸酐,但繼續(xù)滴加30%NaOH維持pH,至pH不再降低為止。按1.2.1的方法對(duì)反應(yīng)液取樣,進(jìn)行液相色譜分析,測(cè)定其中L纈氨酸和N乙酰L纈氨酸的含量,根據(jù)測(cè)定結(jié)果及取樣時(shí)物料總質(zhì)量,計(jì)算L纈氨酸和N乙酰L纈氨酸在反應(yīng)液中的質(zhì)量。結(jié)果見圖3。

      實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),反應(yīng)初期,溶液中的L纈氨酸與滴入的乙酸酐反應(yīng),導(dǎo)致其質(zhì)量逐漸降低;生成N乙酰L纈氨酸的質(zhì)量逐漸升高。直至乙酸酐用量達(dá)到9 mL以后N乙酰L纈氨酸曲線逐漸走平,殘留在反應(yīng)液中的L纈氨酸趨近于0 g。

      表明L纈氨酸已被全部乙?;辉儆行碌腘乙酰L纈氨酸生成。

      理論上10 g L纈氨酸(0.085 4 mol)乙?;柘囊宜狒?.1 mL。實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)乙酸酐加入量為9 mL,即理論加入量的111%時(shí), 溶液中已無L纈氨酸存在。為保證L纈氨酸反應(yīng)完全,本研究選擇乙酸酐加入量為9 mL。

      2.2.2反應(yīng)pH對(duì)乙酰化反應(yīng)的影響

      乙酸酐對(duì)氨基酸乙?;话阋嗽谖A性水溶液中進(jìn)行,為考察反應(yīng)pH對(duì)乙?;磻?yīng)的影響,按1.2.2.1的方法,控制乙酰化反應(yīng)pH為不同值,水浴溫度為35 ℃,均滴加9 mL乙酸酐,反應(yīng)終止后取樣分析,計(jì)算反應(yīng)液中L纈氨酸和N乙酰L纈氨酸的質(zhì)量,結(jié)果見圖4。

      實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在pH 8~9的條件下乙?;伎梢詫纈氨酸全部轉(zhuǎn)化為N乙酰L纈氨酸;在pH 7的條件下乙酰化,會(huì)有少量L纈氨酸殘留;在pH 10的條件下乙?;?,也有少量L纈氨酸殘留。后面兩種情況下如果繼續(xù)滴加乙酸酐,仍然可以將所有L纈氨酸全部乙?;偟男Ч褪窃龃罅艘宜狒南牧?。本研究選擇在pH 8.0的條件下進(jìn)行乙?;磻?yīng)。

      2.2.3反應(yīng)溫度對(duì)乙酰化反應(yīng)的影響

      為考察反應(yīng)溫度對(duì)乙?;磻?yīng)的影響,按1.2.2.1的方法,控制乙?;磻?yīng)pH為8.0,控制水浴溫度為規(guī)定值,均滴加9 mL乙酸酐,反應(yīng)終止后取樣分析,計(jì)算反應(yīng)液中L纈氨酸和N乙酰L纈氨酸的質(zhì)量。

      實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 在25~55 ℃范圍內(nèi),反應(yīng)溫度對(duì)乙?;磻?yīng)沒有明顯的影響,在55 ℃下乙酰化,反應(yīng)液中殘留少量L纈氨酸,僅占總量的1%左右。25~45 ℃條件下乙?;蠰纈氨酸全部乙?;?。本研究選擇在35 ℃下進(jìn)行乙酰化反應(yīng)。

      2.2.4反應(yīng)時(shí)間對(duì)乙?;磻?yīng)的影響

      由于可能存在乙酸酐水解的副反應(yīng),因此在乙?;磻?yīng)過程中,采用滴加乙酸酐的方式,而不是一次性加入全部乙酸酐。滴加乙酸酐的速度可能影響乙?;磻?yīng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),乙酰化反應(yīng)速度較快,滴加速度對(duì)乙酰化反應(yīng)沒有太大的影響,1 h滴完與3 h滴完乙酸酐,測(cè)定反應(yīng)液中各組分質(zhì)量,發(fā)現(xiàn)乙?;从车那闆r沒有明顯區(qū)別??紤]到滴入的乙酸酐在溶液中的攪拌分散情況,以及乙酸酐水解影響,滴入乙酸酐不應(yīng)太快。本研究選擇在2 h內(nèi)滴完乙酸酐。

      2.3N乙酰L纈氨酸的中和結(jié)晶

      水解后的反應(yīng)液中含有目標(biāo)產(chǎn)物N乙酰L纈氨酸,還含有高質(zhì)量濃度的乙酸鈉及少量其他副產(chǎn)物。需將目標(biāo)產(chǎn)物從反應(yīng)液中結(jié)晶分離出來。

      N乙酰L纈氨酸有一個(gè)游離羧基,其酸堿性質(zhì)類似于乙酸,在較高pH下部分離解生成帶負(fù)電荷的離子。只有在較低的pH條件下才會(huì)以不帶凈電荷的中性分子形式存在,此時(shí)其溶解度最低。因此實(shí)驗(yàn)中加入鹽酸中和至pH 1.5。

      由于N乙酰L纈氨酸在溶液中的溶解度較大,需將中和液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至70 mL,取下冷卻結(jié)晶,20 ℃條件下過濾分離,洗滌,干燥得到N乙酰L纈氨酸精品10.6 g。得母液52 mL, 其中N乙酰L纈氨酸質(zhì)量濃度為19 g/L,質(zhì)量為0.98 g。洗水30 mL,其中N乙酰L纈氨酸質(zhì)量濃度為50.5 g/L,質(zhì)量為1.52 g。

      經(jīng)檢測(cè),N乙酰L纈氨酸產(chǎn)品質(zhì)量符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(見表1)。

      2.4母液處理

      產(chǎn)品結(jié)晶母液及洗水中還含有一定量的N乙酰L纈氨酸,如果能部分回收,則產(chǎn)品收率可進(jìn)一步提高。此母液中還含有高濃度的乙酸鈉和氯化鈉。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),N乙酰L纈氨酸在純水中的溶解度較大,在含有乙酸鈉和氯化鈉的溶液中溶解度較小。在飽和鹽溶液中溶解度最小。因此,將結(jié)晶母液及洗水合并,再旋蒸至鹽結(jié)晶剛剛出現(xiàn),冷卻,使N乙酰L纈氨酸結(jié)晶析出,過濾,不洗,可得N乙酰L纈氨酸粗品2.3 g(干重),經(jīng)HPLC測(cè)定其中含N乙酰L纈氨酸70%,總量為1.6 g。此粗品在下一批次乙?;瘯r(shí)加入反應(yīng)液中。

      2.5原料消耗定額及產(chǎn)品收率

      按照本研究選定的工藝條件進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn),每次固定投料量為100 g L纈氨酸,并投入上一批次母液中回收的N乙酰L纈氨酸粗品,連續(xù)運(yùn)行4批。得到制備N乙酰L纈氨酸工藝的原料消耗定額和產(chǎn)品收率,結(jié)果見表2。

      3產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征

      3.1FTIR

      主要官能團(tuán)的吸收頻率為:υ(O—H),3 303 cm-1,υ(N—H),3 101 cm-1,2 968 cm-1,υas(COO),1 604 cm-1,υs(COO),1 396 cm-1,υ(C—O),1 205 cm-1,由此可以確定該譜圖為N乙酰L纈氨酸的紅外吸收光譜圖(見圖5)。

      3.2HNMR

      圖6為產(chǎn)物HNMR。由圖6可見:d=12.50處為—COOH中氫原子的共振峰,是受氨基吸電子效應(yīng)影響的氫。d=8.00處為QSChNa中氫原子的共振峰;d=4.13處為—NH中氫原子的共振峰;d=1.87~2.06處為—CH2中氫原子的共振峰;d=0.87處為產(chǎn)物以甲基封端的—CH3的氫原子共振峰。

      綜合FT-IR和HNMR表征結(jié)果,證明產(chǎn)品為N乙酰L纈氨酸。

      4結(jié)論

      在微堿性水溶液中,用乙酸酐乙?;疞纈氨酸可制備N乙酰L纈氨酸。工藝條件溫和,操作簡(jiǎn)便。優(yōu)化工藝條件為:

      (1) 乙酰化:100 g L纈氨酸,1 000 mL水,35 ℃,滴加90 mL乙酸酐,滴加30%NaOH保持pH 8.0。滴加乙酸酐時(shí)間2 h。

      (2) 中和結(jié)晶:加37%濃鹽酸中和至pH 1.5。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至溶液體積700 mL,冷卻結(jié)晶12 h,抽濾,洗滌,80 ℃烘干得N乙酰L纈氨酸精品。

      (3) 母液處理:旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至出現(xiàn)結(jié)晶,冷卻結(jié)晶12 h,抽濾,得N乙酰L纈氨酸粗品,可用于下一批乙酰化時(shí)配料。產(chǎn)品總收率為122%,產(chǎn)品質(zhì)量符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

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