蓯歸益腎膠囊對(duì)糖尿病腎病大鼠腎纖維化及MEK/ERK信號(hào)通路的影響

阮諾冰，李金菊，林逸軒，王帆競(jìng)，方朝暉

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230038；2.合肥市第一人民醫(yī)院，安徽 合肥 230061；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)藥防治糖尿病研究所，安徽 合肥 230031；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

糖尿病腎病(Diabetes kidney disease,DKD)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，患病率逐年增長(zhǎng)[1]，是導(dǎo)致終末期腎病(End stage renal disease,ESRD)最主要的病因之一[2]。本病病理特征主要為腎小球硬化及間質(zhì)纖維化，致使有效腎單位逐漸減少，進(jìn)而造成不可逆的腎功能受損。現(xiàn)階段該疾病臨床治療手段有限，以飲食調(diào)整為基礎(chǔ)，前期以調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂、穩(wěn)定血壓為主，腎功能?chē)?yán)重衰竭時(shí)，則根據(jù)條件采用腎臟替代療法[3]，對(duì)于降低 DKD 的發(fā)病率及阻止進(jìn)一步發(fā)展作用甚微。因此臨床迫切需要尋找到一種對(duì)延緩 DKD 進(jìn)展穩(wěn)妥有效的治療方法。

近年來(lái)，采用中醫(yī)學(xué)防治DKD受到了愈來(lái)愈多臨床工作者的重視，多項(xiàng)臨床研究均證實(shí)運(yùn)用包括中藥內(nèi)服、針灸、中藥灌腸等在內(nèi)的中醫(yī)手段治療DKD卓有成效[4-6]。DKD早期以陰虛為主，病至后期以腎臟虛損為主，故瘀血貫穿DKD的整個(gè)病程，因此治療上以補(bǔ)腎化瘀通絡(luò)為基本治則。蓯歸益腎膠囊是由導(dǎo)師方朝暉教授研制具有補(bǔ)腎益精、活血化瘀功效的中藥復(fù)方制劑。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用蓯歸益腎膠囊治療DKD療效斐然[7-9]，但其作用機(jī)制尚不明確?；诖?，本研究以DKD大鼠為研究對(duì)象，以MEK/ERK信號(hào)通路及促纖維化因子為切入點(diǎn)，探討蓯歸益腎膠囊作用于DKD的可能機(jī)制，為中醫(yī)藥防治DKD提供數(shù)據(jù)支持與科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 90只6周齡雄性SPF級(jí)大鼠，體重180～220 g，購(gòu)于安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK(皖)2019-001。飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度22.5～24.5 ℃，濕度55%左右，光照與黑暗(12 h/12 h)交替，自由飲食。

1.2 藥物、試劑與儀器 蓯歸益腎膠囊(購(gòu)于安徽省中醫(yī)院藥物制劑中心，皖藥制字：BZ20130034)。厄貝沙坦片(浙江華海藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20030016)。鏈尿佐菌素(STZ，德國(guó)Biofroxx)，RIPA細(xì)胞裂解劑(Beyotime生物)，BUN、Scr檢測(cè)試劑盒(上海信裕生物)，Masson染色試劑盒(Solarbio)，蘇木素染色液、伊紅染色液(Baso生物)，兔抗鼠MEK、p-MEK、兔抗鼠ERK、p-ERK(美國(guó)CST)，兔抗鼠TGF-β1(英國(guó)Abcam)。

全自動(dòng)離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)、電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(上海Tanon)、生化分析儀(美國(guó)BioTek)、酶標(biāo)分析儀(深圳Rayto)、徠卡切片機(jī)、光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)、生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(湖北亞光)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 分組、造模及干預(yù)方式：90只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組 10只，造模組80只，空白組予普通飼料，造模組予高糖高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng)4周后造模。造模組大鼠按35 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射1%鏈尿佐菌素(STZ)，空白組大鼠腹腔注射等劑量檸檬酸鈉緩沖液。3 d后若隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，則DM大鼠造模成功。繼續(xù)飼喂糖高脂飼料2周，若24 hUP>30 mg/24 h則DKD大鼠造模成功。共成功造模65只，隨機(jī)分為模型組、厄貝沙坦組及蓯歸益腎膠囊高、中、低劑量組，每組13只。大鼠等效劑量計(jì)算方法參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[10]，空白組與模型組按5 ml/(kg·d)予0.9%氯化鈉溶液，厄貝沙坦組按15 mg/(kg·d)給藥，蓯歸益腎膠囊高、中、低劑量組分別按1080、540、270 mg/(kg·d)劑量給藥。

至藥物干預(yù)周期結(jié)束，空白組存活10只大鼠；模型組因互相撕咬感染和血糖過(guò)高死亡4只；厄貝沙坦組因灌胃不當(dāng)死亡2只；蓯歸益腎膠囊高劑量組因灌胃不當(dāng)死亡2只，因互相撕咬傷口感染死亡1只；蓯歸益腎膠囊中劑量組因灌胃不當(dāng)死亡1只；蓯歸益腎膠囊低劑量組因灌胃不當(dāng)死亡2只。

1.4 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 血清、尿液、腎臟組織采集：給藥12周后進(jìn)行標(biāo)本采集，留取24 h尿液，以備檢測(cè)24 h尿蛋白定量(24 hUP)。腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血約5 ml， 高速離心機(jī)(3000 r/min)離心20 min，留取上清液，標(biāo)記信息，保存于-80 ℃冰箱以備檢測(cè)?？焖俜蛛x腎臟表面筋膜及脂肪囊后剪下兩個(gè)腎臟，其中1個(gè)分剪為小塊后放入無(wú)菌凍存管，標(biāo)記信息后保存于-80 ℃冰箱以備Western blot檢測(cè)，另1個(gè)腎臟用4%多聚甲醛室溫固定以備HE及Masson染色。

1.4.2 生化指標(biāo)檢測(cè)：給藥前后血糖數(shù)值均為刺破大鼠尾尖用血糖儀測(cè)得。用肌酐(Scr)檢測(cè)試劑盒(肌氨酸氧化酶法)檢測(cè)血清Scr值，用尿素氮(BUN)檢測(cè)試劑盒(脲酶法)檢測(cè)血清BUN值。使用全自動(dòng)生化儀進(jìn)行24 hUP檢測(cè)。

1.4.3 組織病理學(xué)檢測(cè):取出多聚甲醛中的大鼠腎臟，乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(4 μm/片)，一部分切片進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。另一部分切片進(jìn)行Masson染色，根據(jù)顏色可知紅色為肌纖維，藍(lán)綠色為膠原纖維。

1.4.4 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、MEK/ERK通路相關(guān)蛋白的表達(dá):每組取腎臟組織0.1 g，加入1 ml細(xì)胞裂解液，勻漿，離心后提取蛋白，配制BCA工作液測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。制備SDS-PAGE凝膠，上樣后，電泳，轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后常溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗3次，二抗室溫孵育 30 min，洗膜后加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯影。采用Image J軟件進(jìn)行灰度值量化分析，目的蛋白灰度值/ GAPDH灰度值的結(jié)果為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠FPG比較 見(jiàn)表1。藥物干預(yù)前，模型組、厄貝沙坦組與蓯歸益腎膠囊各劑量組FPG比空白組高(P<0.05)。干預(yù)后，模型組、厄貝沙坦組與蓯歸益腎膠囊各劑量組FPG比空白組高(P<0.05)；蓯歸益腎膠囊高、中劑量組比模型組FPG低(P<0.05)。

表1 各組大鼠FPG比較(mmol/L)

2.2 各組大鼠BUN、Scr比較 見(jiàn)表2。藥物干預(yù)12周后，與空白組比較，模型組、厄貝沙坦組與蓯歸益腎膠囊各劑量組BUN、Scr上升(P<0.05)；厄貝沙坦組、蓯歸益腎膠囊各劑量組BUN、Scr比模型組低(P<0.05)；相較厄貝沙坦組，蓯歸益腎膠囊高劑量組BUN降低，Scr升高(P>0.05)，蓯歸益腎膠囊中、低劑量組BUN、Scr上升(P<0.05)。

表2 各組大鼠BUN、Scr 比較

2.3 各組大鼠24 hUP比較 見(jiàn)表3。干預(yù)前，模型組及各藥物干預(yù)組24 hUP比空白組高(P<0.05)。12周后，與空白組比較，模型組、厄貝沙坦組與蓯歸益腎膠囊各劑量組24 hUP升高(P<0.05)，相較于模型組，厄貝沙坦組及蓯歸益腎膠囊各劑量組24 hUP降低(P<0.05)，與厄貝沙坦組比，蓯歸益腎膠囊中、低劑量組24 hUP升高(P<0.05)。

表3 各組大鼠24 hUP比較 (mg)

2.4 各組大鼠HE染色結(jié)果 空白組腎臟組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常，腎小球大小均一，腎小管上皮細(xì)胞整齊排列，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組腎臟組織結(jié)構(gòu)異常，部分腎小球系膜高度增生，毛細(xì)血管基底膜增厚，腎小管大量萎縮，部分上皮細(xì)胞空泡化，只見(jiàn)裸核，部分腎小管?chē)?yán)重?cái)U(kuò)張，管腔可見(jiàn)蛋白黏液。相較于模型組，經(jīng)藥物干預(yù)的各組腎組織結(jié)構(gòu)、腎小球系膜增生，基底膜增厚、腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、炎性浸潤(rùn)等情況減輕(圖1)。

A：空白組；B：模型組；C：厄貝沙坦組；D：蓯歸益腎膠囊高劑量組；E：蓯歸益腎膠囊中劑量組；F：蓯歸益腎膠囊低劑量組

2.5 各組大鼠Masson染色結(jié)果 空白組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)膠原纖維增殖，呈均勻的紅染狀態(tài)。模型組腎小管間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大范圍藍(lán)染區(qū)域，分布不均勻，提示大量膠原纖維沉積。與模型組比較，厄貝沙坦組與蓯歸益腎膠囊各劑量組膠原纖維增殖狀況有不同程度的改善(圖2)。

A：空白組；B：模型組；C：厄貝沙坦組；D：蓯歸益腎膠囊高劑量組；E：蓯歸益腎膠囊中劑量組；F：蓯歸益腎膠囊低劑量組

2.6 各組大鼠TGF-β1、MEK/ERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 模型組及各藥物干預(yù)組TGF-β1表達(dá)量及p-MEK/MEK、p-ERK/ERK比值比空白組高(P<0.05)，與模型組比較，厄貝沙坦組及蓯歸益腎膠囊高、中劑量組TGF-β1表達(dá)量及p-MEK/MEK、p-ERK/ERK比值降低(P<0.05)，蓯歸益腎膠囊低劑量組TGF-β1表達(dá)量及p-MEK/MEK、p-ERK/ERK比值降低(P>0.05)。見(jiàn)表4(圖3)。

表4 各組大鼠 TGF-β1、MEK/ERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

A：空白組；B：模型組；C：厄貝沙坦組；D：蓯歸益腎膠囊高劑

3 討 論

DKD雖然在古籍中并無(wú)記載，但根據(jù)其癥狀及臨床表現(xiàn)，其應(yīng)屬“下消”“關(guān)格”“水腫”等范疇。DKD由糖尿病發(fā)展而來(lái)，早期以陰虛為主，陰虛陽(yáng)亢，耗氣傷津，日久陰損及陽(yáng)，陰陽(yáng)俱虛，病至后期以腎臟虛損為主，久病入絡(luò)，血脈瘀阻，故瘀血貫穿DKD的整個(gè)病程，因此治療上以補(bǔ)腎化瘀通絡(luò)為基本治則。本實(shí)驗(yàn)研究藥物蓯歸益腎膠囊由肉蓯蓉、當(dāng)歸、山茱萸、澤瀉、桂枝和牡丹皮構(gòu)成。方中肉蓯蓉味甘、咸，入腎經(jīng)，甘能除熱補(bǔ)中，咸能滋腎，既可補(bǔ)腎陽(yáng)、腎精之不足，又可制約燥熱太過(guò)。山茱萸味酸、澀，能收能斂，入肝、腎兩經(jīng)，故能補(bǔ)益肝腎，腎虛失于固澀，則精微物質(zhì)從小便漏出，蛋白質(zhì)屬人體精微物質(zhì)，故肉蓯蓉和山茱萸合用，補(bǔ)腎之不足，澀精止遺。當(dāng)歸補(bǔ)血活血，桂枝助陽(yáng)化氣，血為氣之母，氣為血之帥，二者合用則新血生，瘀血祛，血運(yùn)通暢。澤瀉性寒，功能利水濕，泄?jié)駸幔瘽嶂?。丹皮性微寒，能清熱涼血、活血化瘀，二者合用可制約藥物之溫?zé)?，使全方溫而不燥，補(bǔ)而不滯。諸藥合用補(bǔ)腎益精，活血化瘀，與DKD的病機(jī)相契合。本研究發(fā)現(xiàn)蓯歸益腎膠囊可降低血糖，消減蛋白尿，改善腎功能，與團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果一致[7]。

腎纖維化的程度是反映腎臟疾病預(yù)后的重要因素之一[11]。因此，早期干預(yù)、抑制致纖維因子的表達(dá)，對(duì)延緩DKD進(jìn)展的意義深遠(yuǎn)。TGF-β是最重要的調(diào)節(jié)因子之一，與多種原因引起的腎損傷高度相關(guān)[12]。TGF-β1是TGF-β家族中推動(dòng)腎臟纖維化最重要的亞型[13]，可通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)腎臟纖維化。TGF-β1可誘導(dǎo)多種膠原、蛋白多糖等物質(zhì)的合成，使細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)與細(xì)胞粘連增加，影響ECM代謝過(guò)程，增加堆積，抑制降解，ECM過(guò)度堆積可加速DKD的進(jìn)展[14]。TGF-β1還可以通過(guò)促進(jìn)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化影響腎臟纖維化[15]。間質(zhì)纖維化(RIF)是DKD進(jìn)展為ESRD的必經(jīng)之路[16]。研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸具有下調(diào) TGF-β1表達(dá)，抑制炎癥狀態(tài)下系膜細(xì)胞增殖的作用，是腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊治療RIF的核心成分之一[17]。

TGF-β1介導(dǎo)腎臟纖維化主要通過(guò)兩條通路， Smads通路與MEK/ERK信號(hào)通路[18-19]。MEK/ERK信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、凋亡等生理過(guò)程[20]，多項(xiàng)研究證實(shí)，MEK/ERK信號(hào)通路在DKD的發(fā)病過(guò)程中起重要作用，在腎臟纖維化過(guò)程中處于活化狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎纖維化大鼠腎組織中TGF-β1蛋白水平及p-MEK/MEK、p-ERK/ERK比值明顯升高，即TGF-β1介導(dǎo)的MEK/ERK信號(hào)通路被激活，蓯歸益腎膠囊可下調(diào)TGF-β1水平和MEK/ERK信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮其對(duì)腎纖維化的干預(yù)作用。

綜上所述，蓯歸益腎膠囊對(duì)DKD大鼠腎臟纖維化程度和腎臟功能具有較好的干預(yù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制TGF-β1介導(dǎo)的MEK/ERK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，該結(jié)果可以為蓯歸益腎膠囊在防治糖尿病腎病及延緩腎纖維化方面的深入開(kāi)發(fā)利用提供新的證據(jù)支持。