不同菌種發(fā)酵對諾麗果酵素的抗氧化性及風(fēng)味物質(zhì)的影響

劉 倩，袁 越，張 杰，趙瑞麗，趙黎明,

（1.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海 200237；2.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心，生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；3.上?；蕽櫴称房萍加邢薰?，上海 201815）

諾麗是茜草科巴戟天屬的一種植物，其果實(shí)稱之為諾麗果，膠狀果肉以及強(qiáng)烈的腐臭氣味是成熟水果的特征，因此，其又稱為“乳酪果”或“嘔吐果”。諾麗果因含有酚類化合物、有機(jī)酸、環(huán)烯醚萜類、蒽醌類和生物堿等生物活性物質(zhì)廣受消費(fèi)者青睞。諾麗果的主要產(chǎn)品有果汁和酵素，發(fā)酵是最為廣泛的一種生產(chǎn)方式[1]。諾麗果酵素有抗氧化[2]、護(hù)肝[3]、抗炎和刺激免疫系統(tǒng)[4]等功能，現(xiàn)市售的諾麗果酵素多采用傳統(tǒng)的自然發(fā)酵方式，自然發(fā)酵屬于混菌共生的發(fā)酵體系，存在參數(shù)變化復(fù)雜、安全質(zhì)量難以控制且發(fā)酵周期長等問題。

目前，酵素行業(yè)中常選擇人工接種乳酸菌和雙歧桿菌進(jìn)行酵素生產(chǎn)，不僅能夠縮短酵素的發(fā)酵周期和改善產(chǎn)品風(fēng)味，還因菌種獨(dú)特的益生功能（抗氧化、提高免疫力和改善腸道屏障功能等）更好地提高酵素活性[5-6]。不同的菌種發(fā)酵相同的原料時(shí)，發(fā)酵過程產(chǎn)生的活性成分和風(fēng)味物質(zhì)具有一定差異，從而對產(chǎn)品的功效及其品質(zhì)產(chǎn)生不同影響。Kwaw等[7]用3種乳酸菌發(fā)酵桑葚汁，確定了植物乳桿菌發(fā)酵液清除自由基的活性最高。王儲炎等[8]比較了3種乳酸菌發(fā)酵藍(lán)莓汁，確定了副干酪乳桿菌比其它兩種乳酸菌發(fā)酵更有利于提高藍(lán)莓多酚的含量和抗氧化活性。Chen等[9]確定了嗜酸乳桿菌對發(fā)酵液揮發(fā)譜的影響大于其它菌株，顯著提高了2-乙基己醇、3-甲基-1-丁醇和乙酸乙酯等的含量。相似的，黃豪等[10]選用6種乳酸菌分別對山楂汁進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)雙歧乳桿菌發(fā)酵山楂汁具有較高的抗氧化性、豐富的香氣物質(zhì)和良好的感官品質(zhì)。目前，諾麗果汁、自然發(fā)酵酵素產(chǎn)品和相關(guān)研究較多，相比于其它果蔬，因成熟的諾麗果風(fēng)味不佳，果汁pH低（3.4～3.7），且含有抑菌成分，導(dǎo)致發(fā)酵很難進(jìn)行，所以市場上接種發(fā)酵的諾麗果酵素產(chǎn)品較少，諾麗果發(fā)酵菌種的篩選以及發(fā)酵對其理化性質(zhì)、功能成分和風(fēng)味物質(zhì)等影響也鮮有研究。在前期研究中，我們將實(shí)驗(yàn)室中的9種乳酸菌和雙歧桿菌分別接種到諾麗果汁中，通過比較發(fā)酵液總酸和還原糖含量的結(jié)果，確定了鼠李糖乳桿菌12（LGG）、植物乳桿菌08（LP-08）、植物乳桿菌K11（LP-K11）、戊糖片球菌03（PP）和乳雙歧桿菌36（BLA）開展不同菌種發(fā)酵對諾麗果酵素的抗氧化活性及風(fēng)味物質(zhì)的影響研究。

因此，本研究以諾麗果為原料，選用LGG、LP-08、LP-K11、PP和BLA進(jìn)行發(fā)酵，研究不同菌種的選擇對發(fā)酵液的理化指標(biāo)、總酚含量、SOD酶活性、抗氧化活性、有機(jī)酸和感官風(fēng)味的影響。以期為諾麗果的高值化利用、諾麗果酵素發(fā)酵菌種的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

諾麗果 海南陵水市；白砂糖（食品級） 沃爾瑪超市；福林-酚、蘆丁、食品級Na2CO3、草酸、酒石酸、乳酸等 分析純，上海泰坦科技股份有限公司；DPPH試劑盒、ABTS試劑盒、FRAP試劑盒 南京建成生物工程研究所；纖維素酶（20000 U/g）、果膠酶（30000 U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；鼠李糖乳桿菌12（Lactobacillus rhamnosus，LGG）、植物乳桿菌08（Lactobacillus plantarum08，LP-08）、植物乳桿菌K11（Lactobacillus plantarumK11，LP-K11）、戊糖片球菌03（Pediococcus pentosaceus，PP）、乳雙歧桿菌36（Bifidobacterium lactis，BLA） 保藏于華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室。

SW-CJ-ID超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；Infinite M200 PRO酶標(biāo)檢測儀 Tecan；LC-20AT液相（配有PDA檢測器） 日本島津；7890B-5977B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；50 μm DVB/CAR/PDMS SPME萃取纖維頭 美國Supelco公司；PHS-3C數(shù)字pH計(jì) 雷磁公司；DHP-9162電熱恒溫干燥培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的活化 BLA所用的培養(yǎng)基為TPY培養(yǎng)基，其余四株菌株為MRS培養(yǎng)基。將保藏于甘油管中的5株菌，分別取20 μL于固體培養(yǎng)基中，挑取長出的單菌落接種于液體培養(yǎng)基中活化。分別取活化液1 mL加入到10 mL培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。然后將各菌懸液加入到100 mL培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)12 h，4 ℃離心收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌3次后制備菌懸液，用于接種發(fā)酵。

1.2.2 諾麗果酵素制備工藝 挑選成熟度統(tǒng)一、無生果、無霉?fàn)€、無異物的諾麗果，清洗、瀝水、破碎入罐，分別加入2.5‰（w/w）果膠酶和纖維素酶，45 ℃酶解6 h，按1:3（v/v）果汁與水的比例進(jìn)行混合，加入5%（w/v）的白砂糖，用食品級Na2CO3調(diào)節(jié)pH至6.0左右，然后進(jìn)行巴氏殺菌（80 ℃，15 min），作為發(fā)酵基質(zhì)，冷卻至室溫后按1%（v/v）的接種量接種，(36±1) ℃恒溫發(fā)酵，分別于發(fā)酵前（第0 d）、第1 d、第3 d、第5 d、第7 d和第9 d同一時(shí)間段取樣。

1.2.3 pH和總酸含量測定 取新鮮諾麗果發(fā)酵液8000 r/min離心10 min后取上清液，采用pH計(jì)測定。參照GB 12456-2021進(jìn)行諾麗果酵素中總酸含量的測定。

1.2.4 還原糖含量的測定 采用DNS（二硝基水楊酸）法[11]，取400 μL樣品加入600 μL DNS中，沸水浴10 min后，于540 nm測定吸光值，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=3.7258x-0.0392，R2=0.9991。

1.2.5 總酚含量測定 采用福林-酚法測定總酚含量[12]，適當(dāng)修改：準(zhǔn)確移取100 μL樣品，加入100 μL去離子水，加入1.0 mL 50%的福林酚，搖勻靜置5 min后加入2.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%（m/v）Na2CO3，避光30 min。于760 nm波長處測定吸光度，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=1.8446x+0.0158，R2=0.9995。

1.2.6 SOD酶活力測定 按照SOD酶檢測試劑盒（WST-1法）進(jìn)行測定。

1.2.7 抗氧化活性的測定 DPPH自由基清除能力（以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0003x-0.0027，R2=0.9996）、ABTS+·清除能力（以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.9264x+0.0605，R2=0.9994）、FRAP還原力（以FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.3485x-0.0054，R2=0.9994）測定采用試劑盒進(jìn)行檢測。

1.2.8 有機(jī)酸含量測定 對諾麗果發(fā)酵前后有機(jī)酸含量進(jìn)行檢測，有機(jī)酸檢測條件[13]：色譜柱HPX-87（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：5 mmol/L硫酸；流速：0.6 mL/min；柱溫：65 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：210 nm；檢測器：DAD檢測器。

1.2.9 感官評價(jià) 采用9點(diǎn)快感標(biāo)度法[14]評價(jià)發(fā)酵前后諾麗果汁的感官性質(zhì)，評定小組由20名經(jīng)過感官訓(xùn)練的學(xué)生（年齡階段：20～30歲，男女比例為1:1）組成，對顏色、酸甜度、香氣、味道、體態(tài)、風(fēng)味和整體接受性七個(gè)性質(zhì)進(jìn)行評價(jià)，評分分為9個(gè)等級對應(yīng)評價(jià)人員的喜好程度，9：極度喜歡；8：很喜歡；7：中等喜歡；6：輕度喜歡；5：無所謂；4：輕度不喜歡；3：中等不喜歡；2：很不喜歡；1：極度不喜歡。

1.2.10 樣品的前處理 頂空固相微萃取參照陳臣等[15]的方法，適當(dāng)修改：稱取3.0 g樣品置于15 mL頂空瓶中，加入40 μL內(nèi)標(biāo)（2-辛醇：22 mg/L）。用聚四氟乙烯硅膠墊密封后于250 r/min、50 ℃水浴中平衡5 min。

1.2.11 色譜條件（GC-MS）

1.2.11.1 GC條件 參照陳臣等[15]的方法，適當(dāng)修改。色譜柱：HP-Inno wax（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：烘箱在初始溫度40 ℃下保持2 min，以5 ℃/min速率升至100 ℃，以8 ℃/min升至230 ℃，保持10 min；載氣（He），流速1 mL/min；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度為250 ℃。

1.2.11.2 MS條件 質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源，電離能量為70 eV；離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，四級桿溫度150 ℃；掃描模式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍m/z 35～450。

1.2.12 GC-MS數(shù)據(jù)分析 所有揮發(fā)性化合物的定性首先采用NIST17質(zhì)譜庫進(jìn)行檢索，根據(jù)匹配度、離子碎片等信息初步確定化合物，并與文獻(xiàn)報(bào)道值進(jìn)行比對。定量分析：揮發(fā)性物質(zhì)含量的測定采用內(nèi)標(biāo)半定量法，根據(jù)化合物與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值進(jìn)行計(jì)算。所用內(nèi)標(biāo)物為40 μL 2-辛醇（22 mg/L），根據(jù)于海燕等[16]的方法，按下式計(jì)算待測物質(zhì)的質(zhì)量濃度及香氣活力值，見式（1）、式（2）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式顯示。采用Origin 2018軟件繪圖；IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種發(fā)酵過程中pH與總酸含量的變化

酸度是衡量發(fā)酵液品質(zhì)的主要指標(biāo)之一，不同菌株發(fā)酵過程中pH和總酸的動態(tài)變化趨勢如圖1所示，兩者含量在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)相反趨勢。由圖1A可知，發(fā)酵結(jié)束后，5株菌種的發(fā)酵液從pH為6.30下降到pH為3.60～3.97。由圖1B可知，發(fā)酵第3 d，發(fā)酵液總酸含量由1.93～2.41 g/L上升到23.73～40.23 g/L，這是因?yàn)榇藭r(shí)發(fā)酵液中碳源充足，乳酸菌可以迅速消耗碳源生成乳酸和乙酸等，導(dǎo)致總酸含量升高。發(fā)酵后期乳酸菌逐漸衰亡，酸度趨于穩(wěn)定[17]。5株菌發(fā)酵后總酸含量為26.28～43.71 g/L，LP-08、LP-K11、BLA發(fā)酵后顯著高于LGG和PP（P＜0.05）。發(fā)酵結(jié)束后，LP-08產(chǎn)酸效果最好，總酸含量為43.71 g/L，較發(fā)酵前（第0 d）提高了19.87倍，可能因?yàn)長P-08糖酵解能力較強(qiáng)[18]，其次是BLA，總酸含量達(dá)到43.49 g/L。

圖1 不同菌種發(fā)酵過程中pH（A）和總酸（B）含量變化Fig.1 Changes in pH （A） and total acid （B） content during fermentation with different strains of bacteria

2.2 不同菌種發(fā)酵過程中還原糖含量及還原糖利用率的變化

糖含量的變化反映了發(fā)酵液中微生物活動情況[19]。由圖2所示，條形圖代表還原糖含量變化，折線圖代表以發(fā)酵第1 d還原糖含量為初始值時(shí)，還原糖的利用率變化圖。還原糖含量僅在發(fā)酵前期呈現(xiàn)上升趨勢，發(fā)酵第1 d后呈下降趨勢。這與王迪等[20]的研究一致，這可能是由于發(fā)酵初期在蔗糖酶的作用或弱酸作用下蔗糖轉(zhuǎn)化為果糖和葡萄糖，使發(fā)酵液中還原糖含量增加。發(fā)酵1～3 d時(shí)，還原糖含量下降，利用率在20%～50%之間，表明該階段大量的葡萄糖和果糖被乳酸菌等用于生長代謝。發(fā)酵第9 d時(shí)各菌種還原糖利用率差距較大，LP-08利用還原糖能力最強(qiáng)，在發(fā)酵結(jié)束后，還原糖含量為6.66 mg/mL，還原糖利用率為60.65%；LP-K11和BLA還原糖利用率相當(dāng)，為54.48%和54.55%；PP利用還原糖的能力較差，發(fā)酵結(jié)束后含有8.60 mg/mL的殘?zhí)橇俊＞C上，5株菌對還原糖的利用能力從大到小依次是LP-08、BLA、LP-K11、LGG和PP。

圖2 不同菌種發(fā)酵過程中還原糖含量及利用率變化Fig.2 Changes in reducing sugar content and utilization rate during fermentation of different strains

2.3 不同菌種發(fā)酵過程中總酚含量變化

由圖3所示，發(fā)酵過程中總酚含量呈先上升后下降的趨勢。PP發(fā)酵第3 d時(shí)，總酚含量是發(fā)酵前的1.02倍；LGG、LP-08、LP-K11和BLA發(fā)酵第5 d總酚含量最高，分別比發(fā)酵前提高12.20%、29.74%、28.54%和24.11%，顯著高于PP發(fā)酵（P＜0.05）。其中，LP-08和LP-K11發(fā)酵后總酚含量較LGG、BLA和PP發(fā)酵均有顯著提高（P＜0.05）?？赡苁且?yàn)長P-08和LP-K11發(fā)酵可產(chǎn)生多種酶（水解酶、脫羧酶和β-糖苷酶等），提高游離態(tài)多酚和釋放結(jié)合態(tài)多酚的能力優(yōu)于其它菌種[21]。發(fā)酵后，LP-08、LP-K11和BLA總酚含量分別為0.251、0.248和0.248 mg/mL，顯著高于發(fā)酵前（P＜0.05），而PP發(fā)酵后，多酚含量顯著下降（P＜0.05）。多酚含量的增加可能是植物細(xì)胞破裂酚類物質(zhì)的溶出或者菌體釋放水解酶水解結(jié)合酚成單體酚[22-23]，下降的原因可能是與生物大分子和金屬離子發(fā)生吸附或沉淀[24]，發(fā)酵后期，較多的酚類物質(zhì)被不斷氧化和降解，也會造成其含量的下降[25-26]。

圖3 不同菌種發(fā)酵過程中總酚含量變化Fig.3 Changes in total phenol contents during fermentation of different strains of bacteria

2.4 不同菌種發(fā)酵過程中SOD酶活力變化

SOD酶的活力常被用來衡量酵素酶活性的高低和發(fā)酵系統(tǒng)的抗氧化活性強(qiáng)弱[27]。由圖4所示，發(fā)酵過程中，PP在發(fā)酵第1 d最先達(dá)到了SOD酶活力最大值，為65.48 U/mL；LP-08和LP-K11在發(fā)酵第5 d時(shí)，SOD酶活性達(dá)到最大值，分別為75.54和72.16 U/mL，較發(fā)酵前分別提高43.58%和34.08%，同時(shí)顯著高于其它菌株發(fā)酵（P＜0.05）。LGG和BLA在發(fā)酵第3 d達(dá)到SOD酶活力最大值，分別是70.06和75.16 U/mL，其中，BLA發(fā)酵后酶活力提高44.59%。發(fā)酵結(jié)束后，不同菌種發(fā)酵液中SOD酶活性從大到小依次為BLA、LP-08、LP-K11、LGG和PP，且都顯著高于發(fā)酵前（P＜0.05）。發(fā)酵初期，SOD作為胞內(nèi)酶，可通過微生物的細(xì)胞裂解而釋放[28]，導(dǎo)致SOD酶活性升高，到發(fā)酵后期，基質(zhì)環(huán)境的酸化以及微生物不斷分泌相應(yīng)的功效酶等因素使得其含量降低[17,29]。

圖4 不同菌種發(fā)酵過程中SOD酶活力變化Fig.4 Changes in SOD enzyme activity during fermentation of different strains of bacteria

2.5 不同菌種發(fā)酵過程中抗氧化活性變化

進(jìn)一步考察了諾麗果酵素發(fā)酵過程中抗氧化活性的變化，如圖5～圖7所示，不同菌株發(fā)酵抗氧化能力有明顯差異。LP-08、LP-K11發(fā)酵第5 d達(dá)到DPPH自由基清除力最大值，分別為347.83和368.80 μmol/L（以Trolox當(dāng)量計(jì)），較發(fā)酵前分別提高13.54%和19.80%，DPPH自由基清除力升高的機(jī)制較為復(fù)雜，Karaman等[30]曾報(bào)道酚類物質(zhì)能很容易地給出1個(gè)氫離子，并通過共振雜化而穩(wěn)定，這是具有高自由基清除力的主要原因。所以，LP-08和LP-K11發(fā)酵時(shí)，DPPH自由基清除力的提高與酚類物質(zhì)的增加具有一定的相關(guān)性。該結(jié)果與周映君等[19]相關(guān)研究一致。BLA于第7 d達(dá)到清除力最大值，為349.44 μmol/L，顯著高于LGG、LP-K11和PP發(fā)酵（P＜0.05）。LGG和PP在發(fā)酵第3 d達(dá)到DPPH自由基清除力最大值，分別為340.02和334.57 μmol/L，與其它菌株發(fā)酵無顯著差異。

圖5 不同菌種發(fā)酵過程中DPPH自由基清除力變化Fig.5 Changes in DPPH radical scavenging rate during fermentation of different strains of bacteria

ABTS+自由基清除能力用Trolox標(biāo)準(zhǔn)品的抗氧化活性表示。PP、LGG和BLA發(fā)酵第1、3和3 d達(dá)到最大ABTS+自由基清除力，抗氧化活性較發(fā)酵前分別提高14.83%、20.97%和21.72%。LP-08和LP-K11在發(fā)酵第5 d抗氧化活性分別相當(dāng)于0.86和0.83 mmol/L Trolox標(biāo)準(zhǔn)品，分別提高33.17%和32.36%，其中LP-08發(fā)酵顯著高于LGG、PP和BLA發(fā)酵（P＜0.05）。發(fā)酵9 d后，除PP外，與發(fā)酵前相比，其它菌株發(fā)酵均提高了ABTS+自由基清除力（P＜0.05）。ABTS+自由基清除能力與高濃度酚類、有機(jī)酸等物質(zhì)的芳香環(huán)數(shù)量、分子數(shù)量和羥基取代基的性質(zhì)密切相關(guān)[20]。

圖6 不同菌種發(fā)酵過程中ABTS+自由基清除力變化Fig.6 Changes in ABTS+ free radical scavenging rate during fermentation of different strains of bacteria

FRAP還原力測定中，以FeSO4標(biāo)準(zhǔn)品作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。PP、LP-08、LGG和LP-K11分別在發(fā)酵第1、3、5和5 d達(dá)到還原力最大值，分別提高13.83%、23.83%、12.64%和15.19%。BLA發(fā)酵在第5 d達(dá)到還原力最大值，增幅為22.22%，顯著高于其它菌株發(fā)酵（P＜0.05）。5株菌株發(fā)酵9 d后，只有LP-08和BLA的發(fā)酵液較發(fā)酵前有所提高（P＜0.05）。發(fā)酵液三種抗氧化活性指標(biāo)整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這與Yang等[31]的研究相一致，可能與諾麗果發(fā)酵過程中活性物質(zhì)的變化和乳酸菌代謝產(chǎn)物作用有關(guān)。LP-08、LP-K11和BLA發(fā)酵3～7 d時(shí)有利于諾麗果酵素抗氧化活性的提升。

2.6 諾麗果酵素發(fā)酵前后有機(jī)酸含量變化

有機(jī)酸會影響諾麗果酵素的穩(wěn)定性、感官品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)等。有機(jī)酸變化的差異除與原料密切相關(guān)外，還源于微生物及各物質(zhì)間的相互轉(zhuǎn)化[32]。由表1可知，諾麗果中有機(jī)酸主要有草酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸和乙酸。

表1 諾麗果發(fā)酵前后有機(jī)酸含量變化（mg/mL）Table 1 Changes in organic acid content before and after fermentation of noni fruit (mg/mL)

5株菌種發(fā)酵后草酸和乳酸含量都顯著提高（P＜0.05），其中，BLA發(fā)酵后乳酸含量最高，為16.18 mg/mL，比發(fā)酵前提高了23.89倍，是其它菌株發(fā)酵的1.36～2.48倍，主要是發(fā)酵菌種通過糖代謝生成乳酸[33]，給發(fā)酵液增添了柔和的酸味。除PP外，其它4株菌株顯著降低了蘋果酸含量（P＜0.05），LGG發(fā)酵后，蘋果酸的利用率為36.25%，蘋果酸作為生物體三羧酸循環(huán)的中間體，參與多個(gè)不同的生化反應(yīng)。另外，蘋果乳酸酶可實(shí)現(xiàn)蘋果酸和乳酸兩者之間的轉(zhuǎn)化，所以其含量處在變化中[34-35]。LGG和PP發(fā)酵大大提高了酒石酸含量，增幅分別為14.13%和11.47%。此外，LGG和BLA顯著提高了琥珀酸含量（P＜0.05），增幅分別為20%和10%。BLA發(fā)酵后，乙酸含量提高了1.03倍，可能是乳酸菌通過代謝丙酮酸產(chǎn)生[34]。

2.7 不同菌種發(fā)酵諾麗果酵素的感官評價(jià)

感官評價(jià)是食品能否獲得消費(fèi)者認(rèn)可的關(guān)鍵指標(biāo)，未發(fā)酵的諾麗果汁呈現(xiàn)暗黃褐色，而發(fā)酵后的諾麗果酵素顏色都呈現(xiàn)紅棕色，更具感官吸引力，平均分高；酸甜方面，由表2可知，在喜好程度評分中得分最高的是LP-08組（7.19±0.98），BLA組酸味明顯，導(dǎo)致得分較低；香氣方面，發(fā)酵組有明顯的諾麗果汁的果香和發(fā)酵味，香味柔和，得分較高；味道方面，發(fā)酵前的諾麗果汁味道寡淡，有苦澀味，發(fā)酵組味道酸甜清爽，但又具有諾麗果果香味；體態(tài)方面，所有樣品在5～6分之間，均有少量細(xì)小果肉沉淀；風(fēng)味方面，發(fā)酵組具有明顯的果香味，得分高于發(fā)酵前；整體包括整體印象和接受度，此項(xiàng)得分較高的是LP-08和LP-K11發(fā)酵。LP-08發(fā)酵在顏色（6.57±1.03）、味道（6.71±1.19）得分處于中上等，酸甜度（7.19±0.98）、香氣（7.24±0.83）、風(fēng)味（7.00±1.05）和整體（7.24±0.77）得分最高。LP-08發(fā)酵在一定程度上改善了諾麗果汁的感官品質(zhì)，使得諾麗果酵素具有更高的可接受度。

表2 不同菌種發(fā)酵諾麗果后感官喜好程度評分結(jié)果Table 2 Sensory preference scores of noni fruit fermented by different strains

2.8 諾麗果酵素發(fā)酵前后風(fēng)味物質(zhì)變化

對LP-08發(fā)酵的諾麗果酵素進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)研究，風(fēng)味物質(zhì)含量及OAV值見表3。發(fā)酵后，發(fā)酵液增加了25種揮發(fā)性香氣成分，包括10種小分子有機(jī)酸、5種醇及其衍生物、4種醛類、3種酯類、2種酮類和1種酚類。酸類物質(zhì)中，發(fā)酵前和發(fā)酵后都以正辛酸和正己酸為主，兩物質(zhì)的OAV值都大于1，屬于諾麗果發(fā)酵后的特征香氣，賦予了發(fā)酵液奶酪味和刺激性酸味，這與Pino等[36]的研究結(jié)果相同，可能跟脂肪分解、蛋白質(zhì)水解等相關(guān)[37]；發(fā)酵后乳酸含量（109.78±20.28）的增加使得發(fā)酵液酸味溫和適中。對照組中存在的三乙酸甘油酯具有苦味，于發(fā)酵后消失，同時(shí)新生成的3-辛基己酸酯和丙位辛內(nèi)酯（OAV為1）不同程度地豐富了酯香。酯類物質(zhì)可能是在乳酸菌復(fù)雜酶系的催化作用下由醇類和有機(jī)酸等生成[38]；醇類物質(zhì)中，發(fā)酵前以有刺激性的3-甲基-3-丁烯-1-醇為主，發(fā)酵后新生成了其它三類醇，少量醇類物質(zhì)的檢出賦予了諾麗果酵素一定的酒香味。在乳酸菌進(jìn)行乳糖、氨基酸、甲基酮等的物質(zhì)代謝時(shí)，某些醇可由相應(yīng)的醛通過脫氫酶還原形成[9]；酮類物質(zhì)在濃度低于閾值時(shí)仍具有較強(qiáng)的香味，2-庚酮（藥香）發(fā)酵后減少，α-異甲基紫羅蘭酮、巰基丙酮和2-壬酮發(fā)酵后消失，又新生成了2-戊酮（5.70±0.36）、苯乙酮（9.68±0.75），發(fā)酵液逐漸由藥香味轉(zhuǎn)化為果香味。發(fā)酵后3,5-二甲基苯甲醛等醛類物質(zhì)的消失可能是被還原成醇或氧化為酸；新生成的苯乙醛（OAV為8-11）屬于諾麗果發(fā)酵后的特征香氣，賦予了發(fā)酵液花香，可通過苯丙氨酸代謝途徑產(chǎn)生[39]。此外，呋喃類、烷類和烯類物質(zhì)也有少量檢出。發(fā)酵前后雖然都以辛酸和己酸為主，但發(fā)酵后酸類、醇類和酯類等物質(zhì)的變化對諾麗風(fēng)味的調(diào)控起到了積極的作用，在一定程度上改善了香氣成分，提高了消費(fèi)者的接受度。

表3 諾麗果發(fā)酵前后風(fēng)味物質(zhì)含量及OAV值Table 3 Contents of flavor substances and OAV values before and after fermentation of noni fruit

3 結(jié)論

本文探究了5株菌發(fā)酵對諾麗果酵素品質(zhì)的影響，研究發(fā)現(xiàn)，不同菌種對諾麗果發(fā)酵的理化性質(zhì)變化趨勢較一致，但對SOD酶活力、抗氧化活性及有機(jī)酸含量的影響差異顯著。不同菌種發(fā)酵時(shí)，LP-08和BLA產(chǎn)酸能力較強(qiáng)；LP-08和LP-K11發(fā)酵使得總酚含量顯著提升（P＜0.05）；另外，LGG、LP-08、LP-K11和BLA發(fā)酵后SOD酶活性均有顯著提高（P＜0.05）。在抗氧化活性比較中，不同菌種達(dá)到最大值的時(shí)間和含量有顯著差異，5株菌中，LP-08、LPK11和BLA在發(fā)酵3～7 d時(shí)有利于諾麗果酵素抗氧化活性的提升（P＜0.05）。BLA發(fā)酵后乳酸含量最高，比發(fā)酵前提高了23.89倍，其次是LP-K11和LP-08。LP-08發(fā)酵后感官評價(jià)得分最高，風(fēng)味物質(zhì)分析表明，發(fā)酵后新增了25種揮發(fā)性成分，包括10種小分子有機(jī)酸、5種醇及其衍生物、4種醛類和3種酯類等，賦予了諾麗果酵素奶酪香、花香和果香，豐富了諾麗果酵素的香氣成分。

綜上，5株菌中，LP-08發(fā)酵諾麗果汁產(chǎn)酸較強(qiáng)，顯著提高了發(fā)酵液的總酚含量和SOD酶活性，具有較高的抗氧化活性、良好的感官品質(zhì)和豐富的香氣物質(zhì)，是適宜發(fā)酵諾麗果汁的菌株，具有潛在的研究和商業(yè)開發(fā)價(jià)值。此外，發(fā)酵菌種的篩選、發(fā)酵工藝調(diào)控和發(fā)酵過程代謝物變化規(guī)律的相關(guān)性仍需要進(jìn)一步研究，以期為果蔬酵素開發(fā)探索平臺技術(shù)和調(diào)控策略，同時(shí)也為高質(zhì)量諾麗果酵素的開發(fā)提供研究依據(jù)。