雞骨骼肌中天然反義lncRNA VGLL2-AS的鑒定及其與VGLL2的關(guān)系研究

李文雅，牛欣然，任團(tuán)輝，蔡含芳，韓瑞麗，田亞東，劉小軍，康相濤，李轉(zhuǎn)見

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，鄭州 450046)

生物體內(nèi)在自然狀態(tài)下形成的，能夠與其正義鏈RNA互補(bǔ)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物叫做自然反義鏈轉(zhuǎn)錄本(NATs)。以往對(duì)NATs的研究結(jié)果表明，NATs大多分布在其正義鏈基因的啟動(dòng)子區(qū)域與外顯子區(qū)域，既包含了具有編碼功能的mRNA，也包含了非編碼RNA(如lncRNA)，根據(jù)轉(zhuǎn)錄的方向不同，又可以分為cis-NATs和trans-NATs[1]。

早期有研究者認(rèn)為NATs屬于一種轉(zhuǎn)錄異常副產(chǎn)物，因而其本身沒有調(diào)控任何基因表達(dá)的功能[2]，近年來的研究則推翻了這一觀點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，NATs能通過與其正義鏈轉(zhuǎn)錄本序列以重疊或互補(bǔ)配對(duì)，以此而實(shí)現(xiàn)可以在包括轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄后等多個(gè)水平參與到對(duì)正義鏈轉(zhuǎn)錄本基因的表達(dá)調(diào)控[2-3]。已逐步證實(shí)NATs廣泛的存在于人類[4-5]、小鼠[6]、豬[7]、雞[8]等多個(gè)常見物種的轉(zhuǎn)錄組中，暗示著它們可能在參與這些物種的基因表達(dá)以及在調(diào)控功能等方面具有重要的作用。而與人類和小鼠NATs的研究相比，在家禽中相關(guān)的研究相對(duì)滯后。

雞的VGLL2基因(vestigial like family member 2,VGLL2)位于3號(hào)染色體，在GenBank數(shù)據(jù)庫中，雞VGLL2 mRNA有4個(gè)外顯子，而X1、X2和X3均因內(nèi)含子3的部分滯留而多形成一個(gè)外顯子。在分析的所有脊椎動(dòng)物物種中，VGLL2表達(dá)主要定位在早期胚胎及以后的骨骼肌的體細(xì)胞分裂中，這與在C2C12成肌細(xì)胞的肌肉分化期間觀察到VGLL2表達(dá)的上調(diào)相一致[9-10]。這些數(shù)據(jù)表明，VGLL2在骨骼肌生長發(fā)育過程中可能發(fā)揮著非常重要的作用，但VGLL2在家禽中的表達(dá)和調(diào)控還尚不清楚。

本課題組基于前期對(duì)6 周齡地方雞(固始雞)和商業(yè)肉雞(AA雞)肌肉組織的轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)鑒定出一個(gè)在雞肌肉組織中特異性表達(dá)，由VGLL2基因序列逆向轉(zhuǎn)錄而來的lncRNA，命名為VGLL2-AS(GenBank登錄號(hào): KY126094)，猜測VGLL2-AS可能在雞的肌肉發(fā)育中發(fā)揮重要作用，但具體機(jī)制尚不清楚[11]。為此，本研究對(duì)VGLL2-AS的生物學(xué)功能展開進(jìn)一步的探索，以期為NATs調(diào)控家禽骨骼肌生長提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用動(dòng)物均來自于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽種質(zhì)資源場，包括11胚齡固始雞胚蛋若干枚、1日齡(1 d)、6周齡(6 W)、16周齡(16 W)、22周齡(22 W)、30周齡(30 W)固始雞各6只。

本試驗(yàn)所用的核酸染料(DNA Green)以及2×Taq PCR Master Mix分別購自TIANDZ公司和CWBIO公司；試驗(yàn)用到的DNA Marker，包括Ladder 100 和D2000，分別購自上海萊楓以及北京中科瑞泰生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、Trizol、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix和DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購自日本TaKaRa公司；試驗(yàn)中用到的有機(jī)溶劑包括無水乙醇、三氯甲烷等均購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；PBS、PRMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基和質(zhì)粒小提試劑盒購自Promega公司；細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中用到的細(xì)胞消化液(0.25% EDTA)、青鏈霉素混合液和胎牛血清(FBS)購自于Gibco公司；放線菌素D和PARISTM Kit分別購自于Sigma和Invitrogen公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI在線網(wǎng)站所提供的基因序列，利用NCBI在線設(shè)計(jì)引物網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Sangon Biotech公司分別設(shè)計(jì)和合成表1所示的引物序列。

表1 本研究所使用的引物Table 1 The primers used in this study

1.3 RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用組織(細(xì)胞)裂解液Trizol來提取不同時(shí)期固始雞不同組織樣品(包括肺、心、腎、肝、皮脂、腹脂、腿肌、胸肌和下丘腦)或者細(xì)胞樣品的RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書對(duì)質(zhì)量合格的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄而來的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)，具體操作及分析參考任團(tuán)輝[11]的方法。

1.4 RT-PCR驗(yàn)證VGLL2-AS與VGLL2基因的雙向轉(zhuǎn)錄

分別以VGLL2的正義鏈第3個(gè)外顯子設(shè)計(jì)引物GF1和GR1，以VGLL2-AS的反義鏈第1個(gè)外顯子設(shè)計(jì)引物DL-F和DL-R，GAPDH作為內(nèi)參基因。引物序列見表1。

用于特異基因逆轉(zhuǎn)錄cDNA的合成步驟如下：以固始雞胸肌總RNA(1 μg)為模板，去除模板中的基因組DNA污染后，于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中分別以DL-R和GAPDH-R或GR1和GAPDH-R特異引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的鏈特異cDNA為接下來Touchdown PCR擴(kuò)增的模板。反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL、ddH2O 3 μL，2×SYBR Green Mix 5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，退火65 ℃～50 ℃(-1 ℃/cycle) 30 s，72 ℃ 40 s；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，分別為15和26個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增所得產(chǎn)物于核酸染料預(yù)染的1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳(120 V，110 mA，30 min)，最后在凝膠成像系統(tǒng)下成像。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

雞原代成肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)詳見戴巍等[12]的研究。

1.6 核酸酶保護(hù)試驗(yàn)

向固始雞胸肌總RNA(1 μg)中加入2 μL DNase Ⅰ和1 μL RNase A以消除基因組的DNA及單鏈RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將消化產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進(jìn)行下一步的PCR檢測。反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL、ddH2O 3 μL，2×Taq PCR Master Mix 5 μL，反應(yīng)條件同RT-qPCR。

1.7 放線菌素D添加試驗(yàn)分析VGLL2-AS與VGLL2半衰期

將雞原代成肌細(xì)胞接種至12孔板中，待其細(xì)胞匯合度達(dá)到70%左右時(shí)，收取3個(gè)孔的細(xì)胞培養(yǎng)品，設(shè)置為0 h樣品；將最終濃度為2 μg·mL-1的放線菌素D加入細(xì)胞中，之后每1 h收集3個(gè)孔細(xì)胞樣品，提取細(xì)胞RNA后檢測靶基因的表達(dá)。

1.8 雞原代成肌細(xì)胞VGLL2和 VGLL2-AS 亞細(xì)胞定位

雞成肌細(xì)胞細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的分離使用PARISTM Kit試劑盒進(jìn)行，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的內(nèi)參基因分別為GAPDH和U6基因，通過RT-qPCR方法檢測成肌細(xì)胞中VGLL2-AS和VGLL2基因的表達(dá)，進(jìn)而確定兩者的細(xì)胞定位。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析與作圖

本試驗(yàn)采用相對(duì)定量2-ΔΔCt計(jì)算方法對(duì)所得qRT-PCR的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以2-ΔΔCt值來代表不同基因在不同樣品中的相對(duì)表達(dá)水平。2-ΔΔCt方法具體計(jì)算過程如下：

ΔCt= Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)；

ΔΔCt=ΔCt-ΔCt(對(duì)照組均值)；

目的基因在某一樣品中的相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。

本研究所有的定量數(shù)據(jù)均是通過羅氏實(shí)時(shí)熒光定量軟件LightCycler 96進(jìn)行收集，再經(jīng)Excel等軟件進(jìn)行整理；用SPSS 20.0對(duì)整理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，多重比較采用新復(fù)極差法(SSR)，設(shè)置顯著性水平為0.05。最后用作圖軟件GraphPad Prism 6進(jìn)行制圖，數(shù)據(jù)表示的形式為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”[10]。

2 結(jié) 果

2.1 雞肌肉組織中VGLL2-AS的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證VGLL2-AS是否真實(shí)存在，在VGLL2-AS的特異區(qū)(與VGLL2相比，VGLL2-AS缺少第3外顯子，故選取VGLL2-AS跨第2外顯子與第4外顯子區(qū)域作為VGLL2-AS特異區(qū))設(shè)計(jì)引物F1/R1并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序檢測。結(jié)果如圖1所示，特異區(qū)PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與目的基因VGLL2-AS序列完全一致，證明VGLL2-AS在雞的轉(zhuǎn)錄組中真實(shí)存在。

A. VGLL2-AS的瓊脂糖凝膠電泳圖；B. VGLL2-AS的測序圖A. Agarose gel electrophoresis of VGLL2-AS; B. DNA sequencing map of VGLL2-AS圖1 VGLL2-AS的驗(yàn)證Fig.1 Verification of VGLL2-AS

2.2 VGLL2與VGLL2-AS均在肌肉中特異表達(dá)

為了驗(yàn)證VGLL2與VGLL2-AS是否在肌肉中高表達(dá)，qRT-PCR檢測VGLL2與VGLL2-AS在固始雞不同時(shí)期的肺、心、腎、肝、皮脂、腹脂、腿肌、胸肌和下丘腦組織之間的表達(dá)差異。結(jié)果如圖2所示，可以看出VGLL2與VGLL2-AS表達(dá)趨勢一致，即均在肌肉組織中特異高表達(dá)，而在其余組織中幾乎不表達(dá)。且在6 w和16 w肌肉組織中的表達(dá)量與1 d相比，表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，說明VGLL2和VGLL2-AS參與了雞的肌肉發(fā)育進(jìn)程。

A. VGLL2時(shí)空表達(dá)譜；B. VGLL2-AS的時(shí)空表達(dá)譜。經(jīng)單因素方差分析檢驗(yàn)，*表示差異顯著(P<0.05)A. The spatio-temporal expression pattern of VGLL2; B. The spatio-temporal expression pattern of VGLL2-AS. Tested by one-way analysis of variance, * means significant difference(P<0.05)圖2 VGLL2與VGLL2-AS的表達(dá)規(guī)律Fig.2 Expression patterns of VGLL2 and VGLL2-AS

2.3 VGLL2-AS與VGLL2可以進(jìn)行雙向轉(zhuǎn)錄

為了驗(yàn)證VGLL2-AS與VGLL2是否可以進(jìn)行雙向轉(zhuǎn)錄，通過設(shè)計(jì)特異引物，以胸肌cDNA進(jìn)行Touchdown PCR檢測。結(jié)果如圖3所示，VGLL2和VGLL2-AS都可以擴(kuò)增出目的條帶，表明VGLL2-AS與VGLL2均可以進(jìn)行雙向轉(zhuǎn)錄。

圖3 鏈特異引物鑒定雞VGLL2-AS與VGLL2雙向轉(zhuǎn)錄Fig.3 Identification of bidirectional transcription of chicken VGLL2-AS and VGLL2 by strand specific primers

2.4 VGLL2-AS與VGLL2可以形成雙鏈RNA

為了探究VGLL2-AS的作用機(jī)制，利用核酸酶保護(hù)試驗(yàn)在VGLL2-AS與VGLL2的重疊區(qū)(第二外顯子)設(shè)計(jì)了引物F2/R2(圖4A)，之后擴(kuò)增重疊區(qū)的目的片段以檢測VGLL2-AS與VGLL2之間是否形成了RNA二聚體。如圖4B所示，可以看到在F2與R2之間可以擴(kuò)增到大小132 bp的目的片段，證明VGLL2-AS與VGLL2間形成了RNA二聚體。

A. VGLL2和VGLL2-AS之間重疊和非重疊區(qū)域的引物示意圖；B. 消化產(chǎn)物擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳A. Schematic illustration of primers in overlapping and non-overlapping region between VGLL2 and VGLL2-AS; B. Agarose gel electrophoresis of amplification of digestion products圖4 核酸酶保護(hù)試驗(yàn)Fig.4 Ribonuclease protection assay

2.5 VGLL2-AS與VGLL2的半衰期檢測

既然VGLL2-AS與VGLL2可以形成 RNA雙鏈，而兩者之間形成的雙鏈?zhǔn)欠窨梢栽黾悠湓陔u原代成肌細(xì)胞增殖過程中的穩(wěn)定性還不可知。為此，本研究進(jìn)行了放線菌素D處理成肌細(xì)胞試驗(yàn)。結(jié)果如圖5所示，與VGLL2的2 h左右的半衰期相比較，VGLL2-AS的半衰期可以達(dá)到5 h左右，表明VGLL2-AS半衰期較VGLL2長，證明其穩(wěn)定性高于VGLL2基因。

A. VGLL2半衰期檢測; B. VGLL2-AS半衰期檢測A. The stability assay of VGLL2; B. The stability assay of VGLL2-AS圖5 VGLL2和VGLL2-AS的半衰期檢測Fig.5 The stability assay of VGLL2 and VGLL2-AS

2.6 VGLL2及其反義鏈轉(zhuǎn)錄本VGLL2-AS亞細(xì)胞定位

為了更進(jìn)一步探究VGLL2-AS的作用機(jī)制，對(duì)VGLL2-AS和VGLL2進(jìn)行亞細(xì)胞定位。分離的RNA產(chǎn)物用GAPDH(細(xì)胞質(zhì)內(nèi)參基因)和U6(細(xì)胞核內(nèi)參基因)進(jìn)行RT-qPCR檢測，確定核質(zhì)分離是否成功。如圖6所示，VGLL2-AS和VGLL2基因都主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，說明在成肌細(xì)胞中，VGLL2-AS和VGLL2主要定位于雞成肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。

GAPDH和U6分別為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)參基因。經(jīng)單因素方差分析檢驗(yàn)，***表示差異極顯著(P<0.001)GAPDH and U6 are cytoplasmic and nuclear reference genes, respectively. Tested by one-way analysis of variance, *** means extremely significant difference (P<0.001)圖6 雞原代成肌細(xì)胞中VGLL2-AS與VGLL2亞細(xì)胞定位Fig.6 Subcellular localization of hepatic VGLL2-AS and VGLL2

2.7 VGLL2-AS與VGLL2各轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)分析

利用NCBI在線網(wǎng)站查詢VGLL2基因發(fā)現(xiàn)，VGLL2具有4個(gè)轉(zhuǎn)錄本，分別為：VGLL2-mRNA、VGLL2-X1、VGLL2-X2和VGLL2-X3。為了闡明VGLL2-AS與VGLL2各轉(zhuǎn)錄本的異同，首先利用PCR擴(kuò)增及單克隆測序?qū)GLL2的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行驗(yàn)證。如圖7所示，利用VGLL2各轉(zhuǎn)錄本的共有引物VBF和VBR進(jìn)行擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)胸肌組織中VGLL2實(shí)際不存在VGLL2-X1轉(zhuǎn)錄本，只存在VGLL2-mRNA、VGLL2-X2和VGLL2-X3轉(zhuǎn)錄本。

圖7 VGLL2不同轉(zhuǎn)錄本的凝膠電泳Fig.7 The agarose gel electrophoresis of VGLL2 transcripts

通過NCBI和USCS(http://genome.ucsc.edu/)數(shù)據(jù)庫以及驗(yàn)證得到的各轉(zhuǎn)錄本序列信息，對(duì)VGLL2各轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行分析。結(jié)果如圖8所示，VGLL2-X2和VGLL2-X3均含有5個(gè)外顯子，而VGLL2-mRNA和VGLL2-AS分別含有4個(gè)和3個(gè)外顯子；觀察各個(gè)轉(zhuǎn)錄本之間的序列信息發(fā)現(xiàn)，與VGLL2的3種形式轉(zhuǎn)錄本相比，VGLL2-AS缺少外顯子E3；此外，相比于VGLL2-X2和VGLL2-X3轉(zhuǎn)錄本，VGLL2-AS缺少VGLL2-X2的外顯子I3a和VGLL2-X3的外顯子I3b。

雙斜線代表起始和終止密碼子The double diagonal represents the initial and terminal codons圖8 VGLL2-AS與VGLL2各剪切體結(jié)構(gòu)分析Fig.8 Schematic comparison of transcripts of the VGLL2-AS and VGLL2 genes

2.8 VGLL2-AS與VGLL2在胸肌中的時(shí)序表達(dá)特征

前面的試驗(yàn)證明VGLL2-AS與VGLL2都在肌肉組織中高表達(dá)，但兩者之間的相關(guān)性尚不清楚。為此，本研究利用RT-qPCR檢測了它們?cè)诠淌茧u胸肌組織中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律(由于VGLL2-X2的表達(dá)量在各個(gè)組織中均較低且在其序列中沒有找到合適的引物進(jìn)行檢測，因此本試驗(yàn)中只對(duì)VGLL2-mRNA和VGLL2-X3進(jìn)行了檢測)。結(jié)果如圖9所示，VGLL2-mRNA和VGLL2-X3與VGLL2-AS表達(dá)趨勢一致，且VGLL2-mRNA、VGLL2-X3和VGLL2-AS的表達(dá)呈現(xiàn)極強(qiáng)的正相關(guān)(r分別為0.943和0.935)，且差異極顯著(P<0.01)。

圖9 VGLL2-AS和VGLL2-mRNA (A)、VGLL2-X3 (B)在胸肌中的表達(dá)Fig.9 Expression patterns of VGLL2-AS, VGLL2-mRNA (A) and VGLL2-X3 (B) in breast muscle

3 討 論

NATs可以直接與其正義鏈轉(zhuǎn)錄本相互作用，通過轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳學(xué)水平來調(diào)節(jié)正義鏈基因表達(dá)，從而參與到各種生物學(xué)過程，對(duì)生物體的生長發(fā)育具有重要意義[13-16]。目前，在哺乳動(dòng)物中關(guān)于NATs與其正義鏈轉(zhuǎn)錄本之間的研究較多，如DHRS4-AS[17]、p15AS[18]，而在家禽中的相關(guān)研究較少，如bFGF[19]、IGF-II[20]、Collagen[21]和Pdcd2[22]。因此，對(duì)NATs在家禽肌肉發(fā)育過程中的調(diào)控作用進(jìn)行解析，既能補(bǔ)充lncRNAs在動(dòng)物肌肉中的調(diào)控作用理論，又能為雞肌肉發(fā)育和開發(fā)家禽的分子標(biāo)記提供理論基礎(chǔ)。

研究報(bào)道，半衰期可以衡量NATs的穩(wěn)定性[23-24]。此外，與正義鏈轉(zhuǎn)錄本相比，大部分NATs的半衰期更長，這也意味著大多數(shù)NATs的穩(wěn)定性更高，表明NATs有可能比其正義鏈轉(zhuǎn)錄本承擔(dān)著更多的生物學(xué)功能[25-26]，而VGLL2-AS半衰期較VGLL2長，證明其穩(wěn)定性高于VGLL2基因。同時(shí)，lncRNAs的功能與所處的細(xì)胞定位相關(guān)，而不同細(xì)胞定位的lncRNAs發(fā)揮的調(diào)節(jié)機(jī)制也不一樣。根據(jù)細(xì)胞定位，lncRNAs又可分類為細(xì)胞質(zhì)lncRNAs以及細(xì)胞核lncRNAs[27-30]。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)存在于細(xì)胞質(zhì)中的lncRNAs可以通過與雙鏈RNA之間的相互作用，進(jìn)而參與到對(duì)mRNA穩(wěn)定性和表達(dá)的調(diào)節(jié)。例如，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中的lncRNA MD1可以通過ceRNA的調(diào)控機(jī)制從而參與骨骼肌的分化進(jìn)程[31]。而位于細(xì)胞核內(nèi)的lncRNAs可能通過與靶基因的結(jié)合從而激活或者抑制靶基因表達(dá)，除此之外，還可能通過參與表觀調(diào)控作用介導(dǎo)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)[11, 32-34]。此外，已有研究表明，位于細(xì)胞核內(nèi)的lncRNAs比細(xì)胞質(zhì)中的lncRNAs的穩(wěn)定性弱[35]。VGLL2-AS主要表達(dá)于雞原代成肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，暗示VGLL2-AS可能通過轉(zhuǎn)錄水平以及轉(zhuǎn)錄后水平來調(diào)控VGLL2。

基因的可變剪切能夠改變轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和其編碼的蛋白，同時(shí)也可以使基因產(chǎn)生多種結(jié)構(gòu)不同的mRNA以及多肽序列，是基因表達(dá)多樣性的一種重要的表現(xiàn)形式[36-39]。反義lncRNAs可以通過與其正義鏈轉(zhuǎn)錄本形成雙鏈RNA以覆蓋其順式元件，從而直接調(diào)節(jié)前體mRNA的可變剪切。例如，NATs Zeb2補(bǔ)充了其正義鏈轉(zhuǎn)錄本的剪接位點(diǎn)，并導(dǎo)致其內(nèi)含子的滯留，最終促進(jìn)Zeb2的表達(dá)以及翻譯[40]。內(nèi)含子滯留是基因形成不同剪切體的方式之一，而分析VGLL2不同的剪切體信息，推測可能是VGLL2-AS與VGLL2通過堿基互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈RNA，造成了VGLL2的內(nèi)含子滯留，使之產(chǎn)生了3種剪切體，但VGLL2-AS是否影響VGLL2基因的可變剪切，仍待進(jìn)一步的研究。

轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)之間的距離在1 kb堿基范圍內(nèi)的相鄰的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄方向相反的基因被稱為雙向轉(zhuǎn)錄基因?qū)?，原核生物和真核生物的基因組中都存在雙向轉(zhuǎn)錄基因，它們的表達(dá)大多是正相關(guān)的，并且在進(jìn)化上保守[41-42]。VGLL2-AS和VGLL2-mRNA、VGLL2-X3在不同時(shí)期的胸肌組織中的表達(dá)具有很強(qiáng)的正相關(guān)，這與前期證明VGLL2-AS與VGLL2可以雙向轉(zhuǎn)錄的結(jié)果一致。而VGLL2-AS的表達(dá)水平隨著胸肌的發(fā)育而下調(diào)，這個(gè)基因是否負(fù)向調(diào)控肌肉發(fā)育，或者只在肌肉發(fā)育前期起作用有待進(jìn)一步解析。

4 結(jié) 論

綜上所述，VGLL2-AS作為VGLL2反義鏈編碼的lncRNA定位于細(xì)胞質(zhì)中，可能通過與VGLL2形成的雙鏈RNA之間的相互作用，然后參與調(diào)節(jié)VGLL2的表達(dá)并維持其穩(wěn)定性，最終在雞的早期肌肉發(fā)育中發(fā)揮重要作用。本研究的結(jié)果擴(kuò)展了雞中關(guān)于NATs的研究，并為雞VGLL2基因與其天然反義鏈轉(zhuǎn)錄本VGLL2-AS在雞骨骼肌發(fā)育中的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)，對(duì)于提高禽類的生長性能具有一定的意義。