牦牛高原適應研究進展

楊柏高，郝海生，杜衛(wèi)華，朱化彬，趙學明

(中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

牦牛廣泛分布于海拔3 000～5 000 m的高原地區(qū)，是高原地區(qū)的特有牛種，也是唯一生活在高寒地區(qū)的大型反芻家畜動物。我國擁有豐富的牦牛品種資源，2021年有20個地方牦牛品種，存欄數達1 600余萬頭，是世界上擁有牦牛數量和品種類群最多的國家。牦牛是高原地區(qū)孕育的寶貴資源，為當地居民提供肉、奶、毛皮、燃料等生活資料，也可作為農耕役畜和交通運輸工具，是當地畜牧業(yè)經濟發(fā)展的重要畜種。

牦牛分為家牦牛(Bosgrunniens)和野牦牛(Bosmutus)，約7 300年前，人們將相對溫和的野牦牛逐漸馴化成家牦牛[1]。經過長期適應性進化，牦牛對高原低氧、高寒、強紫外輻射等極端環(huán)境具有極強的適應性，被稱為“高原之舟”。近年來，隨著基因組、轉錄組、蛋白質組等組學技術的進一步應用，牦牛高原適應機制研究取得新進展。本文就近年來牦牛高原低氧、高寒環(huán)境適應以及高原抗病機制和繁殖規(guī)律的相關研究進展進行綜述，以期為揭示牦牛高原適應機制提供思考。

1 牦牛高原低氧適應

1.1 牦牛高原低氧適應的生理學特征

高原地區(qū)海拔高、大氣壓低、空氣稀薄且含氧量低。牦牛長期生活在高原低氧環(huán)境，在軀體結構、器官組織上表現出低氧適應性形態(tài)及功能特征。

牦牛獨特的呼吸系統(tǒng)結構使其適應高原低氧大氣環(huán)境。牦牛體型壯碩而前胸開闊，有14或15對肋骨，肺體積大、容量高[2]；其氣管短而粗，呼吸肌發(fā)達，能維持頻速呼吸；肺中豐富的肺泡和毛細血管，以及較薄的氣-血屏障，使其能高效率進行氣體交換[3]。據報道，牦牛肺泡間隔厚度和間隔內的微血管密度隨牦牛年齡的增長而逐漸增加，而氣-血屏障隨年齡增長而變薄，反映牦牛肺對高原低氧的適應性發(fā)育特點[4]。牦牛的血氧運輸能力強，其心發(fā)達，血液循環(huán)快，血液容量大且紅細胞數量多、血紅蛋白含量高[5]。據報道，牦牛心臟中心肌纖維密度隨海拔升高而增加[6]，心肌線粒體數量少而體積增大[7]。

1.2 牦牛高原低氧適應的遺傳機制研究

基因組、轉錄組和蛋白質組等組學技術的廣泛應用進一步揭示了牦牛高原低氧適應的分子機制。此外，HIF-1α、HIF-2α、VEGFA、EPO、GLN1等在牦牛低氧適應中的遺傳機制得到進一步闡明。

1.2.1 牦牛高原低氧適應的基因組研究 高質量參考基因組為牦牛高原適應的全基因組水平研究提供了重要參考。2012年，Qiu等[8]通過Illumina高通量測序技術組裝了第一個雌性牦牛參考基因組，發(fā)現牦?；蚪M中與能量代謝(CAMK2B、GCNT3、HSD17B12等)和缺氧應激(ADAM17、ARG2、HIF-1α等)相關的基因受到正向選擇。2020年，Ji等[9]利用長讀測序和染色質相互作用技術將牦牛參考基因組質量進一步提高至染色體水平，發(fā)現牦牛基因組中存在許多與鐵離子功能相關的特異性基因，這可能有助于牦牛在低氧環(huán)境下的紅細胞生成調節(jié)。在2022年，Gao等[10]利用Nanopore測序和HI-C組裝獲得家牦牛和野牦牛的高質量染色體級別參考基因組，為揭示牦牛高原適應機制提供了更為精準的參考。

研究表明，牦牛基因組變異與海拔高度具有相關性。E等[11]利用全基因組重測序技術對15只高海拔地區(qū)牦牛和14只低海拔地區(qū)牦牛的基因組進行單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析，通過選擇信號分析篩選到21個與牦牛高海拔適應相關的候選基因，如ITPR1、KLHL29、PDE4D等與低氧調控相關。Wang等[12]從16個牦牛群體基因組中鑒定到31個CNVs，注釋到了DCC、MRPS28、GSTCD、MOGAT2、DEXI、CIITA、SMYD1等與低氧適應相關的基因。Zhang等[13]對牦?；蚪M結構變異(structural variants, SVs)研究發(fā)現，牦牛基因組中能量代謝相關基因受到正向選擇。

1.2.2 牦牛高原低氧適應的轉錄組研究 研究人員通過轉錄組測序技術，如信使RNA(messenger RNA, mRNA)測序、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)測序、環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)測序和微小RNA(microRNA, miRNA)測序等對牦牛肺、心組織轉錄組進行了廣泛研究，表明牦牛通過調節(jié)基因表達水平以適應高原低氧。

在高海拔低氧條件下，牦牛通過改變肺組織中的基因表達以適應低氧環(huán)境。Xin等[14]對牦牛肺組織的mRNA測序研究顯示，與低海拔牛相比，牦牛肺中血細胞增殖調控基因CD36，以及花生四烯酸代謝和卵巢類固醇生成途徑基因表達上調，這有助于牦牛低氧轉錄調控。Ge等[15]利用mRNA、miRNA和circRNA測序對不同海拔高度牦牛的肺進行轉錄組分析，結果發(fā)現分別有756個mRNAs、64個circRNAs和83個miRNAs與牦牛所處海拔相關，其中PRKCSH的mRNA轉錄水平下調，有助于減輕缺氧誘導的內質網應激。Ge等[3]對生活在3個不同海拔高度(3 400、4 200和5 000 m)的9頭牦牛肺組織進行mRNA、lncRNA和miRNA測序，結果發(fā)現許多差異表達RNA來源基因參與免疫應答和細胞周期，篩選到3個與牦牛低氧適應密切相關的基因(PDIA4、BAX和CAPN1)。最近，Gao等[10]利用單細胞轉錄組測序技術揭示了牦牛肺細胞圖譜，發(fā)現一類特異的內皮細胞亞型，篩選到攜帶SVs的低氧調控相關基因(ARNT、GATA1、MAFG、KLF5、HOXB5)。

牦牛心組織發(fā)育、功能調節(jié)相關基因參與低氧調控。Wang等[16]對牦牛和普通牛的心組織進行轉錄組測序，結果篩選到6個與牦牛心低氧適應調控相關的基因(MAPKAPK3、PXN、NFATC2、ATP7A、DISPH1和F2R)以及與之具有靶向關系的8個miRNAs(miR-195、miR1843、miR3615等)和15個circRNAs(novel-circ-017096、novel-circ-018073、novel-circ-010096等)。Ma等[17]通過分析大額牛、牦牛和牛的心mRNA轉錄組，篩選到與牦牛心發(fā)育與調節(jié)相關的重要基因(HAND2、EDRNA、ZFPM2、CHRM2)，這有助于牦牛低氧環(huán)境中心功能調節(jié)。

1.2.3 牦牛高原低氧適應的蛋白質組研究 研究人員通過蛋白質組學技術揭示了高海拔低氧環(huán)境下，牦牛腦、心、肌肉組織的低氧適應性蛋白質組變化。

腦組織易受缺氧損傷，Ma等[18]利用同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)法對牦牛和普通牛的腦組織蛋白質組進行分析，發(fā)現牦牛腦組織中與缺氧環(huán)境生物能量代謝相關的蛋白增多(ALDH4A1、ALDH2)，這可能增強了牦牛腦組織的低氧耐受性。而牦牛心中與心血管生成發(fā)育(ASB4、STAT、HRG、RHO和TSP4)、線粒體功能(ACAD8、GPDH-M、PIPMT1和ALDH2)相關的蛋白表達上調，有助于心肌功能維持和能量調節(jié)[19]。

肌肉組織是氧代謝的重要部位，Long等[20]通過分析牦牛和普通牛骨骼肌蛋白質組圖譜，發(fā)現NRDP1和COQ8A蛋白在牦牛中的表達水平高于普通牛，進一步分析鑒定到與機體能量代謝相關的樞紐蛋白，如ATP50、MTHFD1、MDH2、SDHB等。Wen等[21]采用iTRAQ法分析牦牛和牛胸部最長肌差異表達蛋白，鑒定到24種核心蛋白質，如鈣螯合素1、前列腺素還原酶、ATP合成酶O亞基等與牦牛對高海拔適應有關。Xin等[22]通過無標記定量法分析了牦牛與中低海拔牛的臀肌蛋白質組，發(fā)現牦牛體內與能量代謝(NDUFA11、NDUFB4、COX6A2、NDUFA4)、抗氧化(TXNRDs)和葡糖糖攝取(PIK3CA、CAV1)相關的蛋白表達上調。這些研究表明，牦?？赡芡ㄟ^調節(jié)與能量代謝相關的蛋白表達水平以適應高原低氧環(huán)境。

1.2.4 牦牛低氧調控基因的表達

1.2.4.1HIF-1α：缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factors 1 alpha，HIF-1α)是一種保守的氧敏感轉錄激活調控因子，是組成缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)復合物的活性亞基。HIF-1α在機體組織的缺氧生理調控中具有重要作用[23-24]，常氧條件下HIF-1α蛋白在合成后經泛素化-蛋白酶途徑快速降解，缺氧時HIF-1α蛋白的降解受到阻遏而在細胞質內積聚，隨后進入細胞核與HIF-1β二聚化形成HIF-1復合體，HIF-1通過招募共激活因子、與DNA結合等方式誘導HIF靶基因的轉錄，進而參與調節(jié)機體生理過程，如糖酵解[25]、血管生成[26]、細胞凋亡[27]等。

牦牛高原低氧適應與其機體內廣泛表達的HIF-1α密切相關。研究發(fā)現，高山放牧牦牛肝、心、肺、腎等器官組織的HIF-1α表達水平顯著高于低海拔飼養(yǎng)牦牛(P<0.05)[28]。牦牛肺組織如肺泡、終末細支氣管的環(huán)形平滑肌具有較高的HIF-1α蛋白水平[29]。HIF-1α在牦牛腦組織中的廣泛表達對腦細胞缺氧損傷具有保護作用。后腦組織中，牦牛小腦蚓前葉具有較高的HIF-1α表達水平，主要分布于延髓、腦橋神經元、小腦半球等神經元[30]。間腦組織中，HIF-1α蛋白水平在垂體中較高，主要分布于垂體神經元、多形細胞、嗜酸細胞等細胞的胞質中[31]。而在牦牛端腦組織中，HIF-1α在頂葉組織中的表達水平最高[32]。此外，HIF-1α在牦牛腦組織中的表達分布呈現年齡差異，成年牦牛的小腦皮質、梨狀葉、髓質和胼胝體具有較高的HIF-1α表達水平，而青年牦牛的小腦白質、松果腺、胼胝體和小腦皮質中HIF-1α表達水平相對較高[33]。

1.2.4.2HIF-2α：低氧誘導因子2α(hpoxia inducible factors 2 alpha，HIF-2α)，也稱為內皮PAS結構域蛋白1(endothelial PAS domain-containing protein 1，EPAS1)，與HIF-1α同屬低氧誘導因子α亞基的不同亞型，兩者具有48%的氨基酸序列同源性和相似的蛋白質結構，功能相似，HIF-2α也受機體氧濃度調節(jié)。HIF-2α主要參與調控機體慢性缺氧，輕度或生理性缺氧時HIF-2α的表達可持續(xù)48 ～ 72 h[34]。

HIF-2α基因在高原哺乳動物中受到正向選擇，包括牦牛[35]。Guan等[36]對來自18個不同海拔地區(qū)的303個牦牛個體的HIF-2α基因進行分型，鑒定到單核苷酸多態(tài)位點rs382449952的TT基因型頻率與海拔高度顯著相關(P<0.05)。此外，HIF-2α在牦牛腦垂體、輸卵管組織中的表達水平比黃牛高[37]，其在肺中的表達水平與年齡呈正相關[38]。

1.2.4.3VEGFA：血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)是血管內皮生長因子家族的成員之一，VEGFA參與調控血管發(fā)生和再生過程，如血管內皮細胞增殖、遷移、凋亡和血管通透性等[39]。

VEGFA在牦牛肺中的表達水平隨年齡增長而變化，有助于不同年齡牦牛的低氧適應。Wan等[4]對青海省鹽縣牦牛1、30、180日齡和成年牦牛肺膈葉VEGFA蛋白水平進行分析，結果顯示30日齡牦牛肺膈葉VEGFA蛋白水平最高，180日齡次之，成年牦牛最低。而周娟等[40]對大通牦牛的研究顯示，1日齡牦牛VEGFA蛋白水平高于30日齡，隨后在180日齡和成年牦牛中升高且高于1日齡。因此，不同品種牦牛在長期自然適應過程中，因其遺傳背景、生存環(huán)境等的不同而在高原低氧的適應性發(fā)育規(guī)律上存在區(qū)別。

1.2.4.4EPO：促紅細胞生成素(Erythropoietin,EPO)是一種循環(huán)糖蛋白激素，通過激活促紅細胞生成素受體來促進紅細胞的增殖和抗凋亡[41]。缺氧誘導EPO的表達，EPO通過氧敏感反饋回路參與機體缺氧生理調控[42]。研究表明，當平原居民進入高原時，EPO的表達在48 h內迅速達到峰值，刺激紅細胞的代償性生成以緩解機體缺氧[43]。

牦牛EPO基因具有遺傳多態(tài)性，且具有顯著的海拔高度相關性。趙麗玲等[44]對分布在不同海拔高度的中甸牦牛、麥洼牦牛、斯布牦牛、類烏齊牦牛、帕里牦牛和申扎牦牛的EPO基因序列進行分析，鑒定到3個SNPs位點：rs527G→A、rs1031A→T、rs1192T→C，通過單倍型分析，EPO基因ATC單倍型在牦牛中的分布頻率隨海拔升高而升高，表明EPO基因與牦牛高原低氧適應密切相關。此前的一項研究顯示，九龍牦牛EPO基因外顯子3、4、5區(qū)段存在5個突變位點，包含一個錯義突，導致編碼氨基酸由亮氨酸變?yōu)楣劝滨０穂45]，EPO的多態(tài)性可能促進牦牛低氧適應。

1.2.4.5EGLN1：GL-9家族缺氧誘導因子1(egl-9 family hypoxia inducible factor 1,EGLN1)編碼一種脯氨酸羥基化酶，該酶在細胞正氧環(huán)境中發(fā)生自氧化活化，促進HIF-1α蛋白的脯氨酸羥基化途徑降解；而在缺氧環(huán)境中失去活性[46]。

EGLN1是牦牛高原低氧調控途徑的重要候選基因[47-48]。牦牛EGLN1基因具有遺傳多態(tài)性，Zeng等[49]從牦牛EGLN1基因上鑒定到突變位點c.482A→G，該突變位點GG基因型僅在牦牛中出現，基因型頻率高達0.893。Liu等[50]的研究顯示，EGLN1突變位點rs1769793的T等位基因與EGLN1在牦牛骨骼肌和海馬組織中的轉錄水平下降顯著相關，這可能有助于牦牛長期適應高海拔低氧環(huán)境。

2 牦牛高寒環(huán)境適應

2.1 牦牛高寒環(huán)境適應的生理學特征

牦牛長期面臨低溫、飼草短缺的生境挑戰(zhàn)，如青藏高原夏季平均溫度不足10 ℃，冬季時間長，約為每年的11月至次年的5月[51]。經過長期適應和自然選擇，牦牛在生理表型和機體生理調控上表現出高原高寒環(huán)境適應性特征。

1.戰(zhàn)略決定組織機構。戰(zhàn)略對于組織機構的決定性影響是由戰(zhàn)略的前導性與結構的滯后性所決定的。當企業(yè)意識到外部環(huán)境和內部條件的改變?yōu)槠涮峁┝诵碌臋C會和市場需求時，為謀求經濟效益增長，企業(yè)首先會對戰(zhàn)略目標進行變革，以便企業(yè)適應新的市場環(huán)境和形勢。而企業(yè)組織機構的改變往往在戰(zhàn)略的變革之后發(fā)生。因此，新的企業(yè)戰(zhàn)略制定出來之后，企業(yè)才能根據新戰(zhàn)略的要求制定改變企業(yè)舊的組織結構，來保證戰(zhàn)略的執(zhí)行效率。如果舊的組織機構管理人員不執(zhí)行改革的決定，組織機構就不能適應新的戰(zhàn)略要求，從而影響企業(yè)的長期發(fā)展。由此可見，戰(zhàn)略總是先于組織機構進行變革，組織機構隨后做出反應，這決定了企業(yè)戰(zhàn)略對于組織機構的決定性作用。

牦牛被毛生長具有高寒適應性特點。牦牛被毛色雜多為黑色，毛型在暖季以粗毛為主，冷季期間絨毛生長增加，以增加保暖性。濃密的被毛有助于牦牛在高原低溫、大風、大雪等高寒環(huán)境中維持軀體溫度[52]。此外，牦牛皮脂腺發(fā)達，皮脂分泌旺盛而排汗較少，皮膚分泌的皮脂有助于減少體表熱量的散失，增強牦牛在低溫環(huán)境的生存力。脂肪沉積和代謝是牦牛適應高寒環(huán)境的重要能量保障。牦牛體重隨季節(jié)變化明顯，有“夏肥-秋壯-冬瘦-春乏”之說，體重增減幅度可達30%[53]。暖季期間植被茂盛，營養(yǎng)水平高，牦牛攝食后快速將多余能量轉化為脂肪；至冬季飼草短缺時，牦牛依賴于體內脂肪以維持機體能量平衡。

牦牛瘤胃微生物組成的季節(jié)性變化也有利于維持牦牛機體能量平衡。據報道，牦牛在低能量水平攝入時，其瘤胃微生物組成有利于提高營養(yǎng)物質的消化率，以獲取更多的能量，進而增強牦牛在冷季牧草短缺的生存力[54]。此外，牦牛瘤胃微生物組成有利于牦牛適應不同生長期牧草的營養(yǎng)水平變化，Ma等[55]利用基因組測序方法對牦牛瘤胃微生物組成在不同牧草生長期的變化進行研究，結果顯示牧草再綠期微生物組成以類桿菌(51.82%)為主，這有利于牦牛對飼草粗蛋白的消化吸收和身體恢復；而枯草期牧草纖維含量高時，疣狀芽胞桿菌、豆狀芽胞桿菌、藍藻和纖維桿菌等數量增多，以幫助牦牛提高能量吸收率。Zou等[56]的研究顯示，牦牛處于饑餓狀態(tài)時，瘤胃蛋白質降解細菌數量減少，反硝化細菌增多，這些變化在一定程度上提高了牦牛對饑餓的耐受力。

2.2 牦牛高寒環(huán)境適應的遺傳機制研究

2.2.1 牦牛被毛周期性發(fā)育調控機制研究 牦牛毛發(fā)的周期循環(huán)生長有助于牦牛適應高原不同季節(jié)的氣候溫度變化[57]。Bao等[58]采用mRNA轉錄組測序技術對牦牛毛發(fā)生長周期不同時間點的毛囊細胞基因表達模式進行研究，結果顯示，牦牛毛囊細胞的基因表達模式分為生長期、退行期和休止期3個階段。在生長期，WNT、FGF通路中等參與激活毛囊生長的基因高度表達；在退行期BMP4、Wise等抑制分化和促進毛囊細胞凋亡的基因高度表達；在休止期DKK1、BMP1等抑制毛囊活動的基因高度表達。Zhang等[59]利用mRNA和lncRNA測序對牦牛生長毛發(fā)進行轉錄組研究，發(fā)現FER、ELMO1、PCOLCE、HOXC13、CPEB1等基因參與牦牛毛發(fā)周期調控。通過研究牦牛毛發(fā)周期生長的基因表達調控模式，不僅有助于揭示牦牛高原高寒適應的毛發(fā)生長機制，還可為調控牦牛毛絨生長提供理論依據，以促進牦牛毛絨產業(yè)發(fā)展。

2.2.2 牦牛脂肪沉積及代謝機制研究 牦牛體內脂肪沉積受營養(yǎng)水平、性別、年齡影響。暖季牧草營養(yǎng)價值高，牦牛體內升高的不飽和脂肪酸水平激活氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors, PPAR)信號，促進脂肪組織的沉積，牦牛肌肉脂肪和內臟脂肪逐漸增加[60]。與雌性牦牛相比，雄性牦牛肌肉多不飽和脂肪酸相對含量較低，進一步發(fā)現兩者的脂肪合成相關基因(ME1、SCD、ACSL5、LPL、FABP1、PLIN4和PLIN2等)表達水平存在差異[61]。成年牦牛較幼年牦牛具有較高的肌內脂肪含量，使其具有更強的耐寒性。Wang等[62]的研究顯示，隨年齡增長，牦牛肌內脂肪增多，這與不同年齡牦牛脂肪細胞中脂肪代謝相關基因(SREBF1、ACADL)差異表達有關。Zhang等[63]的研究顯示，circRNA(novel_circ_0009127、novel_circ_0000628、novel_circ_0011513、novel_circ_0010775、novel_circ_0006981 和 novel_circ_0001494)參與牦牛脂肪細胞分化過程。此外，有研究顯示，牦牛脂肪細胞與前脂肪細胞的N6-腺苷酸甲基化(m6A)水平存在差異，m6A可能通過調節(jié)脂肪代謝相關基因(KLF9、FOXO1、ZNF395、UHRF1)的表達參與調節(jié)牦牛脂肪細胞分化[64]。

在冷季牧草短缺時期，牦牛通過脂代謝、糖異生等途徑獲得穩(wěn)定的能量來源。Xiong等[65]對不同季節(jié)放牧牦牛的脂代謝進行研究，結果顯示枯草期放牧的牦牛皮下脂肪中飽和脂肪酸的比例低于牧草旺盛期放牧牦牛，但多不飽和脂肪酸比例更高。同時檢測到牦牛皮下脂肪中與甘油轉運和多不飽和脂肪酸合成相關基因(AQP7、ACSL、ELOVL、FADS1)表達上調，與脂肪分解代謝、脂肪合成代謝和脂肪酸氧化相關基因(GPAT4、HSL、PNPLA2、ACAD、ACOT8、GLUT4、OXSM、HSD17B8、ACSF3)表達下調。Zheng等[66]利用轉錄組學和代謝組學技術研究冷季牦牛肝的能量代謝機制，結果顯示，冷季期牦牛體內代謝物變化明顯，213種代謝產物上調，93種代謝產物下調；血液中的葡萄糖、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、脂蛋白脂肪酶、胰島素和胰島素樣生長因子1均顯著降低(P<0.05)。與此同時，PPAR和PI3K-Akt信號通路相關基因(LDLR、HMGCR、IGF1R等)和脂質合成(SCD、FASN、FADS2和SLC27A2)、脂肪酸氧化(ACC-β)和脂質分解代謝(FABP4)相關基因表達下調，糖異生代謝增強。

牦牛通過負反饋調節(jié)的方式調控機體脂質代謝穩(wěn)態(tài)，避免機體能量的過度消耗。β-羥基丁酸酯(β-hydroxybutyrate, BHBA)是脂質分解產生的主要酮體，與GPR109A蛋白受體結合參與調節(jié)脂質代謝穩(wěn)態(tài)。Zou等[67]通過BHBA注射對斷食牦牛脂質代謝的影響機制進行研究，結果顯示，對饑餓牦牛注射BHBA后，牦牛皮下脂肪組織中GPR109A基因的mRNA表達上調，AC和PKA的mRNA表達下調，CREB1的磷酸化蛋白豐度降低，脂肪細胞的直徑和面積均顯著增加(P<0.05)，表明BHBA對牦牛饑餓時期的脂質代謝穩(wěn)態(tài)具有調節(jié)作用，通過調節(jié)GPR109A表達及AMP/PKA/CREB信號途徑來實現。

3 牦牛高原抗病機制

近期的組學研究顯示，牦牛體內免疫相關基因的表達水平較高。Xin等[14]通過mRNA測序比較牦牛、臧牛、三江牛和荷斯坦牛的臀肌轉錄組，發(fā)現牦牛體內IL3、IL6等免疫相關基因表達上調。Ma等[17]通過mRNA測序比較牦牛和普通牛脾轉錄組差異，牦牛體內免疫相關基因CXCR4、CD40LG、CXCL14等表達上調。Zheng等[73]利用串聯質譜標記(TMT)定量方法對3個發(fā)育階段(1日齡、15月齡和5歲齡)的牦牛脾進行蛋白質組學分析，結果顯示年齡較大的牦牛脾中具有較高的免疫功能相關蛋白水平，如TRAF1、TCR、FcR、GGT等。

4 牦牛高原繁殖規(guī)律

4.1 雄性牦牛的生殖基礎

雄性牦牛性成熟較晚，2歲齡時產生成熟精子，牦牛精子頭部較短，尾部較長，精子活力高，6～7歲是牦牛生殖力旺盛階段[74]。牦牛在高原低氧、高寒、飼料短缺等極端環(huán)境下仍可保持較好的繁殖力。目前，較多研究集中在牦牛睪丸、附睪的組學研究以及生殖基因表達等方面。

牦牛睪丸蛋白質組隨年齡增長而變化。Ruan等[75]利用雙向電泳法對1、2、4和8歲齡牦牛睪丸的蛋白質表達譜進行測定，結果檢測到29個差異表達蛋白，這些蛋白參與分子結合、催化、抗氧化等功能，其中血清蛋白前體和肝癌衍生生長因子1在睪丸中的水平隨牦牛年齡增長而增加，而谷胱甘肽過氧化酶Ⅰ、內質網蛋白29、過氧化物酶氧還蛋白6、過氧化物酶氧還蛋白2和黃素還原酶1的水平則隨年齡增長降低。Zhao等[76]利用RNA測序技術對牦牛附睪不同區(qū)域的miRNA表達模式進行研究，結果鑒定到683個差異表達的已知miRNAs，這些差異表達miRNAs參與調控內質網、吞噬體、剪接體中的蛋白質加工，氨基酸生物合成等。其中miR-34c在牦牛附睪頭具有較高的表達水平，這可能與附睪頭、附睪體和附睪尾功能差異有關。

青年期后牦牛隨年齡增大而生殖力降低，可能與其生殖基因表達水平的降低有關。過渡蛋白2(transition protein 2,TNP2)參與調節(jié)精子發(fā)生[77]，其在牦牛睪丸中的蛋白水平從初生期到老年期先增加后降低，性成熟初期時表達量最高，主要表達于圓形精子細胞和長形精子細胞[78]。組蛋白脫乙酰酶2(histone deacetylase 2，HDAC2)參與調節(jié)精子減數分裂[79]，其在睪丸中的蛋白水平從幼年期到老年期不斷降低[80]。水通道蛋白1(aquaporin 1，AQP1)參與調節(jié)精子運動，AQP1在青年牦牛睪丸中的轉錄本和蛋白表達水平顯著高于初生、中年和老年時期牦牛[81]。

4.2 雌性牦牛的生殖基礎

雌性牦牛性成熟時間很大程度上受其體重影響，一般在2～2.5歲產生成熟卵子。雌性牦牛呈季節(jié)性發(fā)情，發(fā)情時間主要為6～10月，發(fā)情周期約為20 d，妊娠期約為255 d，一般兩年一胎或三年兩胎[82]。雌性牦牛的繁殖水平受天氣、營養(yǎng)、年齡、體況等多種因素的影響[83]。營養(yǎng)充足的雌性牦牛體況更好，卵母細胞和胚胎質量更優(yōu)[84]，通過補飼可有效提高雌性牦牛身體狀況評分、發(fā)情率、受胎率、產犢重及產后體況恢復速度[85]。

牦牛發(fā)情受激素調節(jié)，發(fā)情牦牛的黃體生成素(luteotropic hormone，LH)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)水平顯著高于未發(fā)情牦牛，卵泡數量更多[86]。此外，氣候影響牦牛激素水平，夏季牦牛血液中褪黑素含量明顯高于冬季，卵巢質量更大。另外，基因表達水平的變化影響牦牛發(fā)情。Chen等[87]通過mRNA轉錄組和蛋白質組分測序技術分析妊娠牦牛和產后牦牛乏情卵巢分子調控機制，結果顯示BHLHE40、SF1IX1、FBPX1、HSPCA、LHCGR、BMP15和ET-1R是調控牦牛產后發(fā)情的關鍵基因。而在牦牛成熟卵泡蛋白質組研究中，卵泡發(fā)育相關蛋白(RPL3、RPL5、EIF3J、EIF4G2、DEP、DDX1等)的發(fā)現也有助于牦牛產后發(fā)情調控。

牦牛卵母細胞體內發(fā)育受基因表達水平的調節(jié)。如GPR50、KAT8、ENPP2、TGF-β1等。G蛋白偶聯受體50(G protein-coupled receptor 50,GPR50)參與調節(jié)牦牛卵母細胞的體外成熟過程，敲除GPR50后，牦牛卵母細胞第一極體排出率和成熟率均顯著降低(P<0.05)[88]。蛋白乙酰化酶8(K (lysine) acetyltransferase 8,KAT8)是卵母細胞發(fā)育的關鍵抗氧化調節(jié)基因，KAT8在牦牛卵母細胞成熟過程中持續(xù)表達[89]。胞外焦磷酸酶/磷酸酯酶2(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 2,ENPP2)參與卵母細胞成熟過程[90]，其在牦牛卵巢、輸卵管和子宮組織廣泛表達[91]。轉化生長因子β1(transforming growth factor beta1,TGF-β1)是卵母細胞成熟調節(jié)基因，王楠等[92]的研究顯示，與普通牛相比，牦牛TGF-β1基因存在錯義突變1168.A→G，編碼丙氨酸突變?yōu)楦拾彼?，TGF-β1在雌性牦牛發(fā)情期和妊娠期卵巢中差異表達。

牦牛卵母細胞體外發(fā)育受空氣氧濃度、基因甲基化水平及添加因子影響。適當的空氣氧濃度促進卵母細胞體外成熟及胚胎發(fā)育，與20%、10%和1%氧濃度相比，5%氧濃度培養(yǎng)環(huán)境下的卵母細胞具有更高的成熟率、卵裂率和囊胚率以及囊胚細胞數[93]。基因組甲基化參與調節(jié)牦牛卵母細胞和胚胎發(fā)育，Xiong等[94]的研究顯示，miR-342-3p通過靶向DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)調控基因組甲基化水平參與卵母細胞減數分裂。Li等[95]利用50 μg·mL-1抗壞血酸處理胚胎后，DNMT1、DNMT3a和TET3甲基化水平降低，mRNA轉錄豐度上調，胚胎細胞數量增多。外源補充添加因子促進牦牛卵母細胞體外成熟，Pan等[96]的研究顯示，在牦牛卵母細胞體外成熟過程中添加5 ng·mL-1FGF10可以調節(jié)DNA甲基化及CD9、CD81、DNMT1、DNMT3B表達水平，進而提高牦牛卵母細胞受精能力和隨后的囊胚質量。此外，在體外成熟液中補充β-雌二醇(E2)也可以促進卵丘擴張和卵母細胞的發(fā)育，其對HAS2、PTGS2、PTX3和OSFs等與卵母細胞發(fā)育相關基因的表達具有上調作用[97]。

5 展 望

牦牛馴化至今已有數千年，自古以來，牦牛對于高原地區(qū)的歷史文化傳承和畜牧經濟發(fā)展均具有重要意義。探究牦牛高原適應機制，不僅有利于加深人們對牦牛品種特性的了解，也有助于推進高原地區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展和種質資源保存。近年來，組學技術的廣泛應用，不僅加深了人們對牦牛高原低氧、高寒適應生理結構特征的認識，還進一步揭示了牦牛高原適應的分子機制，挖掘到許多重要功能基因，也為牦?？共∮N和繁殖調控提供了重要理論依據。但現有研究還不足以闡明牦牛高原適應機制，隨著技術的發(fā)展和研究的深入，有望對牦牛高原適應生理基礎和分子調控機制作出更為明確的闡釋。