抑制PERK對(duì)LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞自噬的影響

孟梅娟，汪 艷，霍 然，李雪睿，常廣軍，沈向真

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

牛奶是奶牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)重要的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品，奶牛乳腺健康是奶產(chǎn)量的決定因素。乳腺炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中常見(jiàn)的臨床疾病，嚴(yán)重影響動(dòng)物健康，降低奶產(chǎn)量，增加奶牛淘汰率，給奶業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。與此同時(shí)，乳腺炎的發(fā)生也會(huì)造成乳腺結(jié)構(gòu)的破壞，危害動(dòng)物健康，導(dǎo)致嚴(yán)重的動(dòng)物福利問(wèn)題[2]。因此，闡明乳腺炎發(fā)生的分子機(jī)制對(duì)奶牛業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。乳腺上皮細(xì)胞是奶牛乳腺中最重要的組成成分，負(fù)責(zé)分泌乳汁和抵御病原的入侵[3-4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是乳中蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、糖類(lèi)的合成和加工場(chǎng)所，對(duì)應(yīng)激極為敏感。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為早期應(yīng)激反應(yīng)，能夠敏感地感知外界壓力[5]。當(dāng)乳腺受到外界刺激，可破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的自我平衡，通過(guò)增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白的數(shù)量來(lái)引起Ca2+水平的失衡[6]，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78 kD，GRP78)從蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PRKR-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)是肌醇依賴(lài)酶1(inositolrequiring enzymel，IRE1)和激活轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)中解體，蛋白表達(dá)上調(diào)[7]，從而引發(fā)奶牛內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，是生物體的一種自我保護(hù)機(jī)制。在正常狀態(tài)下，自噬可以保護(hù)細(xì)胞，清除外來(lái)物，為細(xì)胞活動(dòng)提供能量。當(dāng)發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒(subacute rumen acidosis，SARA)時(shí)，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)通過(guò)血液運(yùn)輸?shù)饺橄俳M織，導(dǎo)致奶牛乳腺上皮細(xì)胞損傷。當(dāng)組織或細(xì)胞受損、炎癥、氧化應(yīng)激或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，可促進(jìn)自噬[8]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬信號(hào)的調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)[9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過(guò)調(diào)節(jié)LC3和ATG5的轉(zhuǎn)錄表達(dá)來(lái)影響自噬體的形成[10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的Ca2+在細(xì)胞自噬中也發(fā)揮了重要作用[11-12]。Ca2+可以通過(guò)激活CAMKKβ和AMPK，進(jìn)而抑制mTOR信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生[13]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激受到外界壓力誘導(dǎo)時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可通過(guò)未折疊蛋白反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[14]。然而，目前，關(guān)于在LPS刺激下，奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬之間關(guān)系的研究相對(duì)較少。因此，本文探討抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞自噬的影響。為調(diào)控LPS引起的反芻動(dòng)物乳腺炎，維護(hù)乳腺的正常功能提供依據(jù)。為臨床防控乳腺炎提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)中使用的奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)，購(gòu)自上海通派生物技術(shù)有限公司。參照Z(yǔ)hao等[15]分離、鑒定并構(gòu)建該細(xì)胞系。BMECs在本試驗(yàn)中培養(yǎng)良好，作者課題組已經(jīng)有多篇文章將BMECs作為體外模型進(jìn)行研究[16-19]。細(xì)胞在完全培養(yǎng)基(90%RPMI 1640+10%胎牛血清+5%青霉素-鏈霉素)中進(jìn)行復(fù)蘇、傳代，同時(shí)凍存部分細(xì)胞以備后續(xù)試驗(yàn)。本試驗(yàn)中使用的是第4～7代的細(xì)胞。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)： 1)采用CCK8法篩選LPS和GSK2606414對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的安全濃度。2)為了研究LPS能否引起奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬，試驗(yàn)分為2組：對(duì)照組(CON)和LPS組(LPS)。選用4 μg·mL-1的LPS刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞12 h，測(cè)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達(dá)。3)為了研究抑制PERK是否能緩解LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞自噬，首先，選用PERK的抑制劑GSK2606414(GSK)，用不同濃度的GSK(0、2.5、5、10 μmol·L-1)預(yù)處理細(xì)胞12 h，再用4 μg·mL-1LPS處理細(xì)胞12 h，測(cè)定PERK、ATF4、eIF-2α和CHOP的mRNA表達(dá)，篩選出GSK最佳抑制濃度。然后試驗(yàn)分成4組，對(duì)照組(CON)、LPS組(LPS)、GLPS組(10 μmol·L-1GSK預(yù)處理12 h，接著4 μg·mL-1LPS刺激12 h)和GSK組(10 μmol·L-1GSK孵育12 h)，測(cè)定自噬相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。

1.2 細(xì)胞活力的測(cè)定

將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板中，每孔加入100 μL含有5×103個(gè)BMECs的細(xì)胞懸液，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，在37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%后，分別加入不同濃度的LPS和GSK2606414處理12 h，每孔中加入10 μL CCK-8溶液，孵育1～4 h。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下讀取細(xì)胞OD值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.3 Lyso-Tracker Red 染色

為了檢測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的自噬狀態(tài)，應(yīng)用Lyso-Tracker Red染色來(lái)檢查溶酶體。將奶牛乳腺上皮細(xì)胞接種在12孔板中，每組3個(gè)重復(fù)，4 μg·mL-1的LPS處理12 h后，按照說(shuō)明書(shū)操作步驟對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，最后使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍攝。

1.4 細(xì)胞總RNA提取、cDNA反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)

細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞板中，每組3個(gè)重復(fù)，在相應(yīng)細(xì)胞處理結(jié)束后，吸走培養(yǎng)上清，用預(yù)冷的1×PBS輕柔地清洗2次，加入500 μL的RNA提取試劑RNAiso plus，根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，得到奶牛乳腺上皮細(xì)胞的總RNA。用分光光計(jì)Nano Drop 2000檢測(cè)總RNA的濃度。然后用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(TaKaRa生物科技，大連)。使用ABI 7300快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。選用甘油醛磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因，采用相對(duì)定量方法2-ΔΔCt進(jìn)行定量分析。引物由上海捷瑞生物工程有限公司根據(jù)表1所示的序列合成。每個(gè)結(jié)果重復(fù)3次進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的引物Table 1 Primers used in quantitive real-time PCR analysis

1.5 細(xì)胞總蛋白提取和目的蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞板中，每組3個(gè)重復(fù)，在相應(yīng)細(xì)胞處理結(jié)束后，棄去細(xì)胞上清，用PBS清洗2次，加入150 μL的蛋白提取試劑RIPA(已加入1/100體積的蛋白酶抑制劑PMSF)，靜置3 min后，用細(xì)胞刮刀將裂解細(xì)胞收集至EP管中，4 ℃條件下12 000 r·min-1離心20 min，后吸取上清，即為BMECs總蛋白。采用BCA試劑盒進(jìn)行濃度測(cè)定，通過(guò)計(jì)算將各組的細(xì)胞樣品調(diào)整為相同的蛋白濃度(2 μg·μL-1)。將統(tǒng)一濃度后的蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜(Millipore, Danvers, MA)，在7.5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，最后與指定的一抗(表2)4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST洗滌后，與特定的二抗孵育2 h。再次洗滌蛋白帶后。選用Omni-ECLTMPico光化學(xué)發(fā)光試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行孵育顯影。用ChemiDoc MP成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光并拍照，用Bio-Rad Image Lab 5.2.1軟件進(jìn)行結(jié)果處理和分析。

表2 Western blot檢測(cè)的抗體信息Table 2 Antibody information for Western blot determination

1.6 細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè)

將無(wú)菌的細(xì)胞爬片放置于24孔板中，接種BMECs，每組3個(gè)重復(fù)，經(jīng)過(guò)相應(yīng)細(xì)胞處理后，進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)。具體操作步驟：將處理好的細(xì)胞棄去上清后，用1×PBS清洗3次，每次5 min。加入4%多聚甲醛，固定20 min。棄去4%多聚甲醛后，同上清洗。加入0.3% Triton X-100，通透15 min。棄去通透劑后，同上清洗。加入含5%牛血清白蛋白的封閉液，封閉1 h。棄去封閉液后，加入相應(yīng)的一抗(表2)，4 ℃條件下，孵育過(guò)夜。將一抗回收后，同上清洗。加入相應(yīng)的二抗，37 ℃條件下，暗盒孵育1 h。將二抗回收后，同上清洗。加入DAPI染液，暗盒孵育5 min。棄去DAPI染液后，同上清洗。最后，在干凈的載玻片上滴加熒光防淬滅劑，將細(xì)胞爬片小心摳出，倒扣在載玻片上，4 ℃避光保存。使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍攝，Image J進(jìn)行熒光分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié) 果

2.1 LPS可引起奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，會(huì)啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。因此，介導(dǎo)UPR的3種關(guān)鍵跨膜感應(yīng)蛋白(IRE1α、PERK和ATF6)的上調(diào)是公認(rèn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的指標(biāo)。由圖1可知，0～4 μg·mL-1LPS不影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活力(P>0.05，圖1A)。選擇4 μg·mL-1的LPS進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。與對(duì)照組相比，LPS可顯著升高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白PERK(P<0.01)、IRE1α(P<0.05)、ATF6(P<0.01)、GRP78(P<0.05)和CHOP(P<0.01)的mRNA表達(dá)(圖1B)。Western blot結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，LPS顯著升高PERK(P<0.05)、ATF6(P<0.01)、GRP78(P<0.01)和CHOP(P<0.01)的蛋白表達(dá)(圖1C～H)。免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，與對(duì)照組相比，LPS可升高GRP78的熒光強(qiáng)度(圖1I)。因此，LPS可誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并激活PERK和ATF6信號(hào)通路。

A. LPS的細(xì)胞活力；B. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因；C. Western blot條帶；D～H. GRP78、CHOP、PERK、IRE1α、ATF6灰度值分析；I. GRP78的免疫熒光結(jié)果(比例尺=10 μm)。與對(duì)照組相比，*.P<0.05，**.P<0.01A. The cell viability of LPS; B. The expression of ER stress-related genes; C. Western blot bands; D-H. Gray value analysis of GRP78, CHOP, PERK, IRE1α and ATF6; I. Immunofluorescence results of GRP78 (scale bar=10 μm). Compared with control group, *.P<0.05, **.P<0.01圖1 LPS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因和蛋白的影響Fig.1 Effects of LPS on endoplasmic reticulum stress related genes and proteins in BMECs

2.2 LPS可引起奶牛乳腺上皮細(xì)胞自噬

由圖2可知，與對(duì)照組相比，LPS可極顯著升高LC3、ATG5、ATG14、Beclin1的mRNA表達(dá)(P<0.01，圖2A)，并且LPS可極顯著降低p62的mRNA表達(dá)(P<0.01，圖2A)。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS可極顯著升高ATG5、ATG14、Beclin1以及LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達(dá)(P<0.01，圖2C～E，G、H)，并且LPS可極顯著降低p62的蛋白表達(dá)(P<0.01，圖2C、F)。此外，免疫熒光的結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，LPS可以降低p62的熒光強(qiáng)度(圖2B)。Lyso-Tracker Red是一種溶酶體紅色熒光探針，能通透細(xì)胞膜，可用于活細(xì)胞溶酶體特異性熒光染色。與對(duì)照組相比，LPS增加了溶酶體的形成(圖2B)。由以上結(jié)果可知，LPS可誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生自噬。

A.自噬相關(guān)基因；B. p62和溶酶體的熒光強(qiáng)度(左3列圖，比例尺=10 μm；右1列圖，比例尺=20 μm)；C. Western blot條帶；D～H. ATG14、Beclin1、p62、ATG5、LC3Ⅱ/Ⅰ灰度值分析。與對(duì)照組相比，**.P<0.01A. Autophagy related genes; B. Fluorescence intensity of p62 and lysosomes (left 3 column figures, scale bar=10 μm; right 1 column figures, scale bar=20 μm); C. Western blot bands; D-H. Gray value analysis of ATG14, Beclin1, p62, ATG5 and LC3Ⅱ/Ⅰ. Compared with control group, **.P<0.01圖2 LPS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞自噬相關(guān)基因和蛋白的影響Fig.2 Effects of LPS on autophagy related genes and proteins in BMECs

2.3 抑制PERK可緩解LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞自噬

為了研究PERK是否參與LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞自噬，選用PERK抑制劑GSK2606414(GSK)預(yù)處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞12 h，再用4 μg·mL-1LPS刺激12 h。如圖3所示，0～10 μmol·L-1GSK對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活力無(wú)顯著影響(P>0.05，圖3A)。與對(duì)照組相比，LPS顯著提高了PERK、ATF4、eIF-2α和CHOPmRNA的表達(dá)(P<0.01)，而5和10 μmol·L-1GSK預(yù)處理后顯著降低了PERK、ATF4、eIF-2α和CHOPmRNA的表達(dá)(P<0.01，圖3B)。其中，10 μmol·L-1GSK抑制效果最佳。因此，后續(xù)選擇10 μmol·L-1GSK進(jìn)行試驗(yàn)。Western blot結(jié)果顯示，與LPS組相比，GSK預(yù)處理可顯著降低PERK(P<0.01)、ATF4(P<0.01)、eIF-2α(P<0.05)、CHOP(P<0.05)蛋白表達(dá)(圖3C～G)。以上結(jié)果表明，PERK抑制劑可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的PERK/eIF-2α/CHOP通路的激活。

A. GSK2606414(GSK)的細(xì)胞活力；B. 基因表達(dá)；C. Western blot條帶；D～G. PERK、ATF4、eIF2α、CHOP灰度值分析；H. 自噬相關(guān)基因；I. Western blot條帶；J～N. ATG5、ATG14、Beclin1、p62、LC3Ⅱ/Ⅰ灰度值分析；O. p62的免疫熒光(比例尺=10 μm)；P. 熒光強(qiáng)度相對(duì)定量結(jié)果。與對(duì)照組相比，*.P<0.05，**.P<0.01。與LPS組相比，#.P<0.05，##.P<0.01A. The cell viability of GSK2606414 (GSK); B. mRNA expression; C. Western blot bands; D-G. Gray value analysis of PERK, ATF4, eIF2α and CHOP; H. mRNA expression of autophagy-related genes; I. Western blot bands; J-N. Gray value analysis of ATG5, ATG14, Beclin1, p62 and LC3Ⅱ/Ⅰ; O. Immunofluorescence results of p62; P. Relative quantification of immunofluorescence results (scale bar=10 μm). Compared with control group, *.P<0.05, **.P<0.01; Compared with LPS group, #.P<0.05, ##.P<0.01圖3 抑制PERK對(duì)LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞自噬影響Fig.3 Inhibition of PERK alleviates LPS - induced autophagy in BMECs

接著研究抑制PERK是否可以緩解LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞自噬。由圖3可知，與對(duì)照組相比，LPS可極顯著提高LC3、ATG14、ATG5、Beclin1 mRNA表達(dá)(P<0.01，圖3H)，顯著降低p62 mRNA表達(dá)(P<0.05，圖3H)。而加入PERK抑制劑GSK后，與LPS組相比，GSK預(yù)處理可極顯著降低LC3、ATG14、ATG5、Beclin1 mRNA表達(dá)(P<0.01，圖3H)，以及顯著升高p62 mRNA表達(dá)(P<0.05，圖3H)。Western blot結(jié)果進(jìn)一步表明，與LPS組相比，GSK預(yù)處理可極顯著降低ATG14、ATG5、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達(dá)(P<0.01，圖3I～L、N)，以及極顯著升高p62蛋白表達(dá)(P<0.01，圖3I、M)。免疫熒光結(jié)果顯示，與LPS組相比，GSK預(yù)處理可極顯著增加p62的熒光強(qiáng)度(P<0.01，圖3O、P)。以上結(jié)果表明，抑制PERK可緩解LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞自噬。

3 討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要方式。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)于細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成和正確折疊、鈣穩(wěn)態(tài)以及細(xì)胞自噬等方面具有重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，大量異常折疊蛋白堆積于細(xì)胞內(nèi)，并啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein reaction，UPR)，激活下游3條信號(hào)通路(IRE1α、ATF6和PERK)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[20]。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種分子伴侶，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊和加工。維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，當(dāng)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，GRP78大量表達(dá)[21]。GRP78的高表達(dá)可以作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR激活的標(biāo)志[22]。IRE1α、PERK和ATF6的3種通路共同促進(jìn)C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)的表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[23]。因此，GRP78和CHOP表達(dá)水平的變化是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)記物[24]。季英磊等[25]研究表明，LPS可通過(guò)上調(diào)GRP78的表達(dá)引起肝細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而使肝細(xì)胞活力降低和細(xì)胞凋亡明顯增多，進(jìn)而對(duì)肝細(xì)胞造成損傷。本試驗(yàn)結(jié)果表明，LPS可顯著升高GRP78、CHOP、PERK和ATF6基因和蛋白的表達(dá)，并且免疫熒光結(jié)果也表明，LPS可升高GRP78的熒光強(qiáng)度。這表明，LPS可誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

LC3是檢測(cè)自噬的標(biāo)記蛋白，在自噬過(guò)程中，LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化為激活的LC3Ⅱ。p62是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它是LC3Ⅱ和泛素化底物降解之間的橋梁。因此，細(xì)胞內(nèi)p62的含量可以反映自噬小體的降解程度[26-27]，當(dāng)自噬受到抑制時(shí)，p62的表達(dá)會(huì)升高，而當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，p62的表達(dá)量會(huì)降低。Beclin1被認(rèn)為是調(diào)控細(xì)胞自噬的核心基因，通過(guò)與IP3Rs結(jié)合，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，在細(xì)胞自噬過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，Beclin1通常被認(rèn)為是自噬活性的指標(biāo)之一[28-29]。研究表明，過(guò)表達(dá)Beclin 1可誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞和HT29細(xì)胞自噬[30]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，LPS顯著上調(diào)了奶牛乳腺上皮細(xì)胞中LC3和Beclin1的表達(dá)，提示LPS可增強(qiáng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞自噬活性。與對(duì)照組相比，LPS顯著降低了p62的表達(dá)，增加了自噬體的降解程度。LPS還可上調(diào)自噬相關(guān)蛋白ATG5、ATG14的表達(dá)。由此可見(jiàn)，LPS可誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生自噬。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬是兩個(gè)獨(dú)立的生物過(guò)程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激一方面可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，另一方面自噬可通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)大量錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)來(lái)恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理功能[31]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，LPS刺激通過(guò)上調(diào)奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬。作者探究了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬之間的關(guān)系。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，UPR可以通過(guò)多種分子機(jī)制促進(jìn)自噬[32]。PERK-eIF-2α信號(hào)通路是介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞自噬之間相互作用最重要的調(diào)控通路之一[33-34]。研究表明，NEFA可以通過(guò)PERK信號(hào)通路促進(jìn)牛肝細(xì)胞自噬小體的形成[35]。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，通過(guò)激活PERK-eIF-2α信號(hào)通路，上調(diào)自噬相關(guān)蛋白ATG12和LC3-Ⅱ誘導(dǎo)自噬[36-37]。為了進(jìn)一步闡明PERK/eIF-2α/ATF4信號(hào)通路的激活與LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞自噬之間的關(guān)系。采用PERK抑制劑預(yù)處理細(xì)胞，再用LPS進(jìn)行刺激，檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，PERK抑制劑GSK2606414可通過(guò)降低ATG5、LC3和ATG14以及升高p62的表達(dá)，來(lái)抑制LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞自噬的發(fā)生。因此，PERK/eIF-2α/ATF4信號(hào)通路參與了LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞自噬，通過(guò)抑制PERK可緩解LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞自噬。

4 結(jié) 論

1)LPS通過(guò)上調(diào)GRP78、CHOP、PERK、IREIα和ATF6的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，LPS還可以上調(diào)Beclin1、ATG14、ATG5，LC3Ⅱ/Ⅰ以及下調(diào)p62的表達(dá)誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞自噬。2)抑制PERK/eIF-2α/ATF4信號(hào)通路可緩解LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞自噬。