米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精熱聚集對乳化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性的影響

時家峰 李 航 王振國 蘇 爽 霍金杰 高育哲 肖志剛

（沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧 沈陽 110034）

米糠是生產(chǎn)大米所得的廉價副產(chǎn)物，富含蛋白質(zhì)、油脂、膳食纖維和其他微量植物化學(xué)成分，具有較高的營養(yǎng)價值［1］。米糠中的蛋白質(zhì)含量達(dá)10%～16%。米糠蛋白作為一種優(yōu)質(zhì)谷類蛋白，因其獨(dú)特的低過敏性和抗癌活性而具有廣泛的應(yīng)用前景。米糠蛋白主要由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白以及谷蛋白組成，其質(zhì)量比為37∶36∶5∶22，其中谷蛋白為主要的不溶性成分［2］，這一性質(zhì)限制了其功能性質(zhì)的發(fā)揮。因此，對米糠谷蛋白進(jìn)行復(fù)合熱聚集是提高其功能性質(zhì)的有效途徑。

自上世紀(jì)80年代報道糖與蛋白之間有共價結(jié)合作用以來，有學(xué)者就利用這一結(jié)合特性在體外展開了蛋白質(zhì)糖基化改性方面的研究［3］。越來越多的數(shù)據(jù)表明，蛋白質(zhì)與糖類復(fù)合可以改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，這是一種具有巨大潛力的改性方法［4］。糖基化改性手段是基于Maillard反應(yīng)，將碳水化合物以共價鍵形式結(jié)合到蛋白質(zhì)分子鏈上的一種加工工藝，僅加熱就能夠自發(fā)反應(yīng)，屬于“綠色加工工藝”［5］。β-環(huán)狀糊精（β- cyclodextrin，β-CD）是由7個D-吡喃葡萄糖通過α-1、4糖苷鍵首尾相連而成的環(huán)狀低聚糖，具有高度選擇性、無毒、可食用、不吸濕性、化學(xué)穩(wěn)定性佳及易于分離等優(yōu)點(diǎn)，其空腔內(nèi)部呈疏水性，而外表面為親水性，疏水性空腔通過非極性作用可與其他疏水性分子或其他分子的疏水性側(cè)鏈基團(tuán)形成穩(wěn)定包接復(fù)合物［6］。在食品加工中，β-環(huán)狀糊精常被作為穩(wěn)定劑、乳化劑、發(fā)泡劑等加工助劑添加在食品中。目前，蛋白質(zhì)糖基化相互作用對其復(fù)合物功能性質(zhì)影響的研究已有一些報道。如張波等［7］研究多糖黃原膠與β-伴大豆球蛋白濕熱改性，發(fā)現(xiàn)糖基化β-伴大豆球蛋白的乳化活性與乳化穩(wěn)定性分別為改性蛋白的2.15倍和2.26倍，同時還發(fā)現(xiàn)加熱溫度過高會使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，分子內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，乳化性降低；曾茂茂等［8］研究葡萄糖與麥芽糖對花生分離蛋白改性作用，發(fā)現(xiàn)糖與蛋白通過共價交聯(lián)的方式結(jié)合，糖的親水性使得復(fù)合物表面活性增加，乳化性提高；劉璘等［9］研究發(fā)現(xiàn)，酪蛋白通過與β-環(huán)狀糊精形成包接復(fù)合物明顯改善了其發(fā)泡性能。而對于米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集行為的研究鮮有報道，因此本研究以米糠為原料提取米糠谷蛋白，利用米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合進(jìn)行熱聚集，研究熱處理對米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合物乳化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特性的影響，以期為米糠谷蛋白復(fù)合熱聚集的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠品種為龍粳31號大米米糠，遼寧盛寶天隆米業(yè)有限公司；β-環(huán)狀糊精，遼寧金達(dá)源生物科技有限公司；5，5-二硫代-2-硝基苯甲酸［5，5-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）， DTNB］、乙 二 胺 四 乙 酸（ethylenediaminetetraacetic acid， EDTA）、三羥甲基胺基甲烷［Tris（hydroxymethyl）aminomethane， Tris］，上海源葉科技有限公司；甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate， SDS）、8-苯氨基-1-萘磺酸（8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid， ANS），上海麥克林生化科技股份有限公司；尿素，湖北省三寧化工股份有限公司；巰基乙醇，上海吉至生化科技有限公司；大豆油，購自沈陽大潤發(fā)超市。

1.2 儀器與設(shè)備

DWF-100電動粉碎機(jī)，河北省科研儀器廠；GL-21M高速冷凍離心機(jī)，上海市離心機(jī)械研究所；Nicolet5DXC紅外光譜儀，美國尼高力儀器公司；DELTA320 pH計(jì)，上海市梅特勒-托利多儀器有限公司；1645050伯樂電泳儀，美國伯樂公司；HH-6A恒溫磁力水浴鍋，廣州喬躍電子有限公司；Master sizer 3000激光粒度儀，上海思百吉儀器系統(tǒng)有限公司；F96熒光分光光度計(jì)，上海奧析科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 米糠谷蛋白的提取 米糠谷蛋白的分離提取參考段慶松等［2］的方法。新鮮米糠過50目篩，脫脂，按料液比1∶5加入正己烷磁力攪拌3 h，在浸提過程中更換正己烷3～4次，混合料液于4 000 r·min-1下離心15 min，沉淀攤勻于通風(fēng)櫥中揮發(fā)剩余溶劑，上清液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收正己烷。將脫脂米糠以料液比1∶6溶于5%的NaCl鹽溶液中，經(jīng)700 W破壁處理30 s，在40 ℃下水浴攪拌1 h，4 000 r·min-1離心15 min，將沉淀繼續(xù)以料液比1∶6溶于5%的NaCl鹽溶液中，在40 ℃下水浴攪拌1 h，4 000 r·min-1離心15 min，沉淀以料液比1∶6溶于0.1% NaOH堿溶液中，在40 ℃下水浴攪拌1 h，4 000 r·min-1離心15 min，水洗沉淀3次，蛋白沉淀分散于去離子水中，并用1 mol·L-1NaOH調(diào)pH值至7.0，攪拌30 min，于4 ℃、8 000 r·min-1條件下離心10 min，除去少量雜質(zhì)。冷凍干燥即得米糠谷蛋白。

1.3.2 米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合聚集體的制備 稱取一定量的米糠谷蛋白分散于水中，調(diào)pH值為9，使米糠谷蛋白溶于水，配置成質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的米糠谷蛋白溶液，按照10∶1的比例混入β-環(huán)狀糊精，充分混合，室溫下攪拌2 h，密封于帶塞錐形瓶中，置于水浴鍋進(jìn)行加熱處理（溫度60、70、80、90、99 ℃，時間40、80、120、160、200 min）。熱處理后的樣品迅速冰浴冷卻，凍干備用。

1.3.3 濁度測定 取米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合聚集物溶液稀釋至米糠谷蛋白質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1，以去離子水為空白對照，通過紫外-可見分光光度計(jì)在600 nm波長處測定吸光度［10］，以吸光度來反映濁度。每次測定進(jìn)行3次，取3次結(jié)果的平均值。

1.3.4 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 參考Hayta等［11］的方法，分析天然米糠谷蛋白和米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精在60、80、99 ℃條件下復(fù)合200 min后得到的熱聚集體的蛋白質(zhì)分子量條帶分布。分別使用濃度為5%和12%的聚丙烯酰胺濃縮膠和分離膠進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）電泳，凝膠電泳的蛋白上樣量為10 μL， 濃縮膠的電壓和時間設(shè)置為80 V、35 min，分離膠的電壓設(shè)置為120 V，藍(lán)色條帶距底部1 cm時，停止電泳。待條帶跑完，先用固定液固定30 min，再用染色液染色30 min，最后用脫色液脫色3～4次，每次30 min，直到蛋白條帶清晰，將處理后的凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行成像。

1.3.5 粒度測定 米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合聚集物的粒度分布采用Master sizer 3000激光粒度儀進(jìn)行測定，分散介質(zhì)為水，微粒的折射率設(shè)置為1.59，試驗(yàn)結(jié)果取3次平行平均值［12］。

1.3.6 接枝度測定 采用鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyae， OPA）試劑法測定［13］。稱取40 mg的鄰苯二甲醛（OPA）溶于1 mL甲醇中，分別加入20%（w∕v）SDS溶液2.5 mL，0.1 mol·L-1硼砂溶液25 mL，β-巰基乙醇100 μL，混合均勻后，用蒸餾水定容至50 mL，得到OPA試劑，即用即配。測定時，取4 mL于試管中，加入200 μL復(fù)合聚集物樣品液（5 mg·mL-1）混合均勻，于35 ℃水浴2 min，在340 nm處測定溶液吸光度值A(chǔ)340，以不加200 μL復(fù)合聚集物樣品液為空白對照。按照以下公式計(jì)算接枝度（grafting degree，GD）：

式中，A0為原復(fù)合聚集物溶液吸光度值；A1為反應(yīng)后復(fù)合聚集物溶液吸光度值。

1.3.7 表面疏水性測定 利用ANS熒光探針法［14］測定表面疏水性。利用pH值7.0的0.01 mol·L-1的磷酸緩沖液將復(fù)合物樣品稀釋成濃度梯度為0.1、0.05、0.025、0.0125 mg·mL-1的溶液，取稀釋后溶液6 mL，加入50 μL 8 mmol·L-1的ANS熒光探針，漩渦震蕩混合均勻，在避光處儲藏15 min（室溫），使用F96熒光分光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm，狹縫均為5 nm），以系列稀釋樣品溶液的熒光強(qiáng)度-蛋白質(zhì)量濃度圖的初始斜率表征溶液的表面疏水性指數(shù)。

1.3.8 游離巰基含量測定 米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合聚集物溶液游離巰基含量參考Xiao等［15］的方法測定。取復(fù)合物樣品溶于pH值8.0的Tris-Gly緩沖溶液，配置成10 mL質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的混合液，混合均勻，室溫下靜置30 min，經(jīng)冷凍離心機(jī)9 000 ×g離心10 min后，取上清液1 mL于10 mL離心管中，加入含有8 mol·L-1尿素、0.5%（w∕v）十二烷基磺酸鈉的pH值8.0的Tris-Gly緩沖溶液5 mL，再加入4 mg·mL-1DTNB試劑50 μL，室溫下混合均勻，靜置30 min后于412 nm下測定吸光度值，空白對照用緩沖液代替蛋白溶液。按以下公式計(jì)算巰基含量：

式中，F(xiàn)為巰基含量，μmol·L-1；D為稀釋倍數(shù)；c為復(fù)合物樣品蛋白濃度，mg·mL-1。

1.3.9 傅里葉變換紅外光譜（fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）測定 通過Nicolet5DXC紅外光譜儀掃描米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合物樣品［16］，光譜掃描范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，使用PeakFitv4.12軟件對1 700～1 600 cm-1酰胺I帶圖譜依次進(jìn)行平滑、基線校正、Gaussian去卷曲、二階導(dǎo)擬合等數(shù)據(jù)處理。

1.3.10 乳化性測定 采用Sui等［17］的方法，取10 mL 6 mg·mL-1米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合聚集物樣品溶液調(diào)pH值為8，與5 mL大豆油混合于50 mL燒杯中，用均質(zhì)機(jī)10 000 r·min-1均質(zhì)1 min，迅速從底部吸取50 μL乳液，加入5 mL 0.1%（w∕v）的十二烷基硫酸鈉稀釋，振蕩混勻，在500 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)0，靜置10 min后，再從底部取50 μL用5 mL 0.1%（w∕v）SDS溶液稀釋，測定500 nm處的吸光度值A(chǔ)10。按照以下公式計(jì)算乳液活性指數(shù)（emulsifying activity index， EAI）和乳液穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index， ESI）：

式中，N為稀釋倍數(shù)；φ為體系中油相所占比數(shù)；L為比色池光徑，1 cm；c為蛋白濃度，g·mL-1；?T為兩次靜置間隔時間差，10 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用PeakFit 4.12軟件進(jìn)行紅外擬合，SPSS Statistics 26軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著，Origin 2021軟件進(jìn)行作圖，所有試驗(yàn)均重復(fù)測定3次，所有數(shù)值均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳化性分析

乳液活性指數(shù)（EAI）表示稀釋乳液中油滴上的蛋白質(zhì)的相對表面覆蓋度。乳液穩(wěn)定性指數(shù)（ESI）表示在預(yù)定時間后乳液的相對穩(wěn)定性［18］。由圖1、表1可知，在同一加熱溫度條件下，不同加熱時間米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合物熱聚集乳化活性指數(shù)不同，隨著加熱時間的延長，復(fù)合聚集體乳化活性和乳化穩(wěn)定性指數(shù)明顯增加；同一加熱時間不同加熱溫度下，復(fù)合聚集體的乳化活性和乳化穩(wěn)定性指數(shù)也不一致，在加熱溫度為90 ℃、加熱時間為160 min時，復(fù)合聚集體的乳化活性指數(shù)達(dá)到最大，為16.92 m2·g-1，與天然米糠谷蛋白相比提高了2.39倍；而在加熱溫度為80 ℃、加熱時間為200 min時，復(fù)合聚集體乳化穩(wěn)定性指數(shù)達(dá)最大，為95.61 min，與天然米糠谷蛋白相比提高了2.39倍。這可能是因?yàn)槊卓饭鹊鞍资軣岷?，肽鏈結(jié)構(gòu)展開，疏水基團(tuán)暴露［19］，米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精發(fā)生Maillard反應(yīng)［20］，以共價鍵的形式形成分子間氫鍵，結(jié)合形成復(fù)合聚集體，改變了聚集體表面疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)的比例，使得復(fù)合聚集體分子更好地結(jié)合到油水的界面，親水親油值達(dá)到穩(wěn)定，從而使米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集體的乳化活性和乳化穩(wěn)定性得到明顯改善；而當(dāng)溫度過高時，米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合聚集體結(jié)構(gòu)改變，大分子可溶性聚集體的出現(xiàn)抑制了復(fù)合物界面的展開［21］，使得乳化活性和乳化穩(wěn)定性降低。

表1 不同加熱溫度和時間對米糠谷蛋白與β環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集體乳化穩(wěn)定性指數(shù)的影響Table 1 Effects of different heating temperature and time on rice bran gluten and β cyclodextrin complex thermal aggregate on emulsifying stability index /min

圖1 不同加熱溫度和時間對米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集體乳化活性指數(shù)的影響Fig.1 Effects of different heating temperature and time on the relationship between rice bran gluten and β-cyclodextrin complex thermal aggregates on emulsifying activity index

2.2 濁度分析

濁度常被用來表示蛋白質(zhì)熱聚集的程度［22］。為研究米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合的熱聚集行為，分別對米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合物在不同加熱溫度、不同加熱時間條件下的熱聚集行為進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。加熱時間對不同加熱溫度條件下米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合物熱聚集濁度的影響較為明顯。不同加熱條件下，米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合聚集體的濁度不同，在80 ℃、80 min熱處理下的濁度最大，為1.06，同時不同溫度條件下的濁度隨加熱時間變化的趨勢一致，在加熱時間為0～80 min時，隨著時間的延長，米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合物的濁度增加，當(dāng)加熱80 min后，濁度趨于穩(wěn)定。表明米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合聚集體在80 ℃加熱條件下的聚集程度較高。這可能是因?yàn)閺?fù)合物受熱后，米糠谷蛋白原有的緊密結(jié)構(gòu)被破壞，與β-環(huán)狀糊精結(jié)合，開始形成聚集體［23］，溫度達(dá)到80 ℃時，聚集程度較好；而溫度過高使得米糠谷蛋白發(fā)生變性，結(jié)構(gòu)被進(jìn)一步破壞，與β-環(huán)狀糊精形成較大顆粒的可溶性聚集體，使得復(fù)合聚集體濁度降低。

圖2 不同加熱溫度和時間對米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合物濁度的影響Fig.2 Effects of different heating temperature and time on rice bran gluten and β-cyclodextrin complex on turbidity

2.3 SDS-PAGE圖譜分析

SDS-PAGE電泳可以反映米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合聚集物中蛋白亞基分子量的條帶分布。由圖3可知，與天然米糠谷蛋白相比，復(fù)合物聚集體蛋白分子量條帶向分子量高的方向移動，在分離膠和濃縮膠位置出現(xiàn)大分子量分子［24］。這可能是米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精通過共價作用形成較大分子量的復(fù)合聚集體的結(jié)果，該結(jié)果與王金梅［23］、許彩虹等［25］的研究結(jié)果一致。

圖3 加熱200 min米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集體的SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE of rice bran gluten and β-cyclodextrin complex hot aggregate heated for 200 min

2.4 粒度分析

粒徑能夠較為直觀地表示出米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集體的形成及顆粒大?。?6］。在60、80、99 ℃條件下，米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合聚集體粒徑變化較為明顯，因此選取以上溫度進(jìn)行粒度分析。由圖4可知，在不同加熱溫度下，米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集體粒徑變化較為明顯。隨著加熱溫度的升高，復(fù)合聚集體的粒徑分布范圍略有增大，且在第2個峰后，較大粒徑的復(fù)合聚集體體積分?jǐn)?shù)增大，在99 ℃時，聚集體粒徑最大分布在200 μm左右。這可能是因?yàn)槊卓饭鹊鞍资軣?，與β-環(huán)狀糊精發(fā)生Maillard反應(yīng)，形成大分子量的復(fù)合聚集體［27］。而溫度達(dá)到99 ℃后，米糠谷蛋白變性，結(jié)構(gòu)改變，與β-環(huán)狀糊精結(jié)合形成可溶性的大顆粒復(fù)合聚集體［28］，這也解釋了溫度為80 ℃時濁度最高的結(jié)果，與濁度、SDS-PAGE圖譜分析結(jié)果均一致。

圖4 加熱200 min不同加熱溫度對米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集體粒徑的影響Fig.4 Effect of different heating temperature on particle size of rice bran gluten and β-cyclodextrin complex hot aggregate after heating for 200 min

2.5 接枝度分析

接枝度可以反映米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精之間的反應(yīng)程度。為了更清晰地表示加熱溫度和加熱時間對復(fù)合聚集體接枝度的影響，分別固定加熱時間和加熱溫度為120 min和80 ℃，研究加熱溫度和加熱時間對接枝度的影響。結(jié)果顯示，固定加熱時間為120 min，隨著加熱溫度的升高，接枝度先增加后減小，在加熱溫度為80 ℃時，接枝度最大，為38.99%（圖5-A）。這可能是因?yàn)閺?fù)合聚集體受熱后發(fā)生Maillard反應(yīng)，反應(yīng)初期暴露在米糠谷蛋白表面的游離氨基可以較快地與β-環(huán)狀糊精發(fā)生反應(yīng)，引入糖基，增加復(fù)合聚集體的親水性質(zhì)；當(dāng)溫度達(dá)到90 ℃時，米糠谷蛋白中更多的內(nèi)部氨基參與反應(yīng)，但此時已經(jīng)糖基化的米糠谷蛋白有可能再次發(fā)生聚合，從而使接枝度略有降低［29-30］。固定加熱溫度為80 ℃，在加熱40～120 min時，米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合聚集體接枝度隨加熱時間的延長而增加（圖5-B）。當(dāng)加熱120 min后，接枝度趨于穩(wěn)定，說明加熱120 min內(nèi)二者不斷復(fù)合形成聚集體，120 min后二者作用位點(diǎn)趨于飽合，接枝度不再繼續(xù)大幅提高。

圖5 不同加熱溫度（A）和時間（B）對米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合物熱聚集物接枝度的影響Fig.5 Effect of different heating temperature （A） and time （B） on grafting degree of thermal aggregates of rice bran gluten and β-cyclodextrin complex

2.6 表面疏水性分析

表面疏水性可以反映米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合物表面疏水性集團(tuán)的數(shù)量，其數(shù)值大小決定了蛋白質(zhì)與β-環(huán)狀糊精分子間相互作用的能力［31］。由表2可知，在相同的加熱時間條件下，不同加熱溫度間的米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集體表面疏水性差異顯著。在80 ℃、200 min加熱條件下的表面疏水性最強(qiáng)，為2 305.83，這可能是因?yàn)樵诩訜徇^程中，隨著加熱溫度的升高，米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合物的結(jié)構(gòu)逐漸展開，分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)逐漸暴露，從而導(dǎo)致復(fù)合熱聚集體的表面疏水性增加［32］。溫度超過80 ℃后，米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合聚集體反應(yīng)稍減緩，表面疏水性降低。溫度達(dá)到99 ℃，更高的溫度促進(jìn)了復(fù)合聚集體的結(jié)構(gòu)打開，暴露疏水基團(tuán)，從而使表面疏水性又增加，可達(dá)到1 835.37。這與濁度分析結(jié)果一致。

表2 不同加熱溫度和時間對米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集體表面疏水性的影響Table 2 Effects of different heating temperature and time on surface hydrophobicity of rice bran gluten and β-cyclodextrin complex hot aggregate

2.7 游離巰基含量分析

游離巰基和二硫鍵是穩(wěn)定米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合物分子結(jié)構(gòu)的重要化學(xué)鍵，對其功能性質(zhì)起決定性作用。固定加熱時間為120 min，在不同的加熱溫度條件下，復(fù)合聚集體溶液游離巰基含量先增加后減小，在80 ℃加熱條件下的游離巰基含量最高，為10.08 μmol·g-1（圖6-A）。這可能是因?yàn)閺?fù)合聚集體受熱后，復(fù)合聚集體肽鏈斷開暴露巰基，超過80 ℃，復(fù)合物蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)一步被破壞，導(dǎo)致游離巰基氧化形成二硫鍵或發(fā)生巰基-二硫鍵（sulfydryl-disulfide bond，SH-SS）互換反應(yīng)［33］，這與王金梅［23］的研究結(jié)果一致。固定加熱溫度為80 ℃，不同加熱時間下米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集體游離巰基含量差異顯著。加熱120 min后，隨著時間的延長，游離巰基含量逐漸增加，這可能是因?yàn)槊卓饭鹊鞍着cβ-環(huán)狀糊精復(fù)合物相互作用解螺旋，暴露了隱藏的巰基。

圖6 不同加熱溫度（A）及時間（B）對米糠谷蛋白與β環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集體游離巰基含量的影響Fig.6 Effects of different heating temperature （A） and time （B） on the content of free sulfhydryl group in the complex thermal aggregates of rice bran gluten and β-cyclodextrin

2.8 紅外光譜（FTIR）分析

采用PeakFit 4.12軟件對酰胺Ⅰ帶的吸收峰進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)擬合，計(jì)算出對應(yīng)區(qū)間范圍內(nèi)米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合聚集體中各個二級結(jié)構(gòu)的相對含量。酰胺Ⅰ（1 600～1 700 cm-1）對于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析最為重要，它與其二級結(jié)構(gòu)之間存在著一定的對應(yīng)關(guān)系，在酰胺I處，α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)的拉曼特征振動頻率分別為1 650～1 660、1 600～1 640、1 662～1 695和1 640～1 650 cm-1［34］。

由圖7可知，在3 700～3 200 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)吸收峰，可能是由游離羥基的伸縮振動引起的［32］；而在1 260～1 000 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)明顯的吸收峰，可能是由碳氧鍵的伸縮振動引起的［18］。這是因?yàn)棣?環(huán)狀糊精鏈上存在多個羥基，與米糠谷蛋白復(fù)合反應(yīng)后，增加了谷蛋白肽鏈中的羥基和碳氧鍵的數(shù)量，使得出現(xiàn)對應(yīng)的吸收峰。

圖7 米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合聚集物紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectra of rice bran gluten and β-cyclodextrin complex thermal aggregates

由圖8-A、B可知，天然米糠谷蛋白在酰胺Ⅰ帶的紅外特征峰分別為1 627.6、1 652.8、1 674.4 cm-1，加熱的米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集體在酰胺Ⅰ帶的紅外特征峰分別為1 627.6、1 649.2、1 670.8 cm-1，其中1 627.6 cm-1是β-折疊的特征峰，1 652.8、1 649.2 cm-1是α-螺旋的特征峰，1 674.4、1 670.8 cm-1是β-轉(zhuǎn)角的特征峰。由表3可知，天然米糠谷蛋白β-折疊、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角含量分別為36.55%、44.67%、18.41%。與天然米糠谷蛋白相比，米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集體β-折疊降低了4.08個百分點(diǎn)，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角分別增加了2.06和1.96個百分點(diǎn)，這說明部分β-折疊轉(zhuǎn)化為α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角，使得復(fù)合熱聚集體的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，失去了規(guī)則有序的二級結(jié)構(gòu)，以共價鍵的形式形成了分子間氫鍵，α-螺旋與疏水作用相關(guān)，這與表面疏水性的分析結(jié)果一致。

圖8 天然米糠谷蛋白、米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集體紅外光譜擬合圖Fig.8 Infrared spectrogram fitting of natural rice bran gluten， rice bran gluten and β-cyclodextrin complex thermal aggregate

表3 天然米糠谷蛋白、米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集體的二級結(jié)構(gòu)含量Table 3 Secondary structure contents of natural rice bran gluten， rice bran gluten and β-cyclodextrin complex thermal aggregates /%

3 討論

米糠蛋白中的谷蛋白因溶解性差而影響了其功能性質(zhì)的開發(fā)，未能有效利用。本研究結(jié)果顯示，米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集處理后，復(fù)合聚集體的乳化活性指數(shù)以及乳化穩(wěn)定性指數(shù)與天然米糠谷蛋白相比顯著提高。這與曾茂茂等［8］研究發(fā)現(xiàn)糖與蛋白通過交聯(lián)的方式結(jié)合，糖的親水性使得復(fù)合物表面活性增加、乳化性提高的結(jié)果相似。

本研究分析不同加熱溫度和時間條件下米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集體乳化性差異及機(jī)理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在90 ℃加熱160 min，復(fù)合聚集體乳化活性指數(shù)最大，80 ℃加熱200 min乳化穩(wěn)定性指數(shù)最高，與天然米糠蛋白相比，均提高了2.39倍。這可能是因?yàn)槊卓饭鹊鞍着cβ-環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集過程中蛋白質(zhì)受熱結(jié)構(gòu)展開，疏水基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水氨基酸的氨基末端與β-環(huán)狀糊精分子還原末端的羥基相互結(jié)合，形成復(fù)合聚集體。方春華［35］關(guān)于鮭魚肌球蛋白質(zhì)與魔芋寡糖二者復(fù)合熱聚集的研究中也有類似報道。同時，熱聚集體形成過程中米糠谷蛋白的二級結(jié)構(gòu)被破壞，部分β-折疊轉(zhuǎn)化為α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角，與β-環(huán)狀糊精形成分子間氫鍵，也是復(fù)合聚集體乳化性質(zhì)得以改善的原因。本研究結(jié)果可為米糠谷蛋白在食品及醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

熱復(fù)合溫度和時間對米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精復(fù)合熱聚集體乳化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性有明顯影響。與天然米糠谷蛋白相比，在90 ℃加熱160 min條件下，復(fù)合聚集體乳化活性指數(shù)達(dá)到最大，提高了2.39倍；在80 ℃加熱200 min條件下，復(fù)合聚集體乳化穩(wěn)定性指數(shù)達(dá)到最大，提高了2.39倍。主要是由于米糠谷蛋白與β-環(huán)狀糊精熱復(fù)合后米糠谷蛋白空間結(jié)構(gòu)展開，疏水基團(tuán)暴露，二硫鍵斷開，游離巰基含量增加，復(fù)合聚集體分子更易于被吸附到油水界面，增加了復(fù)合聚集體的乳化活性。加熱致使復(fù)合過程中米糠谷蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，β-折疊向α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)化，從而使復(fù)合聚集體的乳化穩(wěn)定性有所提高。