金粉蕨素抗腫瘤和抗血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的研究

吳廣,沈倩,許時(shí)麗,符平,李榮（南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院,湖南 衡陽(yáng) 421001）

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，抗氧化防御系統(tǒng)通過(guò)產(chǎn)生多種促氧化酶如NAPDH酶、環(huán)氧化酶、黃嘌呤脫氫酶等發(fā)揮重要作用[1]。近年來(lái)，黃酮類化合物的抗癌和抗氧化活性是國(guó)內(nèi)外研究的一大熱點(diǎn)，其具有抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的特性，被認(rèn)為是預(yù)防癌癥和抗癌癥臨床的理想化合物[2-4]。

金粉蕨含有黃酮類化合物，金粉蕨植物中提取分離得到的一種二氫黃酮苷（flavanone glycoside）-金粉蕨素（onychin），已發(fā)現(xiàn)其對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞和人卵巢癌細(xì)胞等都表現(xiàn)出較好的增殖抑制活性[4-6]。本研究旨在繼續(xù)擴(kuò)展其在抗癌和抗氧化等方面的藥理活性的研究。

1 材料和方法

1.1 金粉蕨素溶液的配置 以二甲基亞砜（DMSO）溶解金粉蕨素粉劑使儲(chǔ)存液的濃度為200mg/mL，使用0.22μm孔徑微孔濾膜過(guò)濾后，4℃避光保存，一個(gè)月內(nèi)使用。使用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至20μg/mL，并使DMSO的終濃度低于0.1%，以最高濃度組DMSO含量作為陰性對(duì)照組，12μg/mL的5-氟尿嘧啶（5-FU）作為陽(yáng)性對(duì)照組。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) MGC-803細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和HepG2-A16細(xì)胞培養(yǎng)于1640培養(yǎng)基中，添加10%的胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.3 MTT法 選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞MGC-803、Hela、HepG2-A16，使用0.25%的胰酶消化成單細(xì)胞懸液，1000rpm離心5min，使用含血清1640培養(yǎng)基重懸為密度為2.5×104個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔加入200μl單細(xì)胞懸液。細(xì)胞貼壁過(guò)夜后加入不同濃度的含金粉蕨素培養(yǎng)基：0、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0μg/mL；以12μg/mL的5-FU作為陽(yáng)性對(duì)照組，0.01%DMSO組作為陰性對(duì)照組。在酶標(biāo)儀490nm處檢測(cè)OD值，計(jì)算各組的相對(duì)抑制率（IR）。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn) 取上述實(shí)驗(yàn)平行處理的腫瘤細(xì)胞，在經(jīng)過(guò)不同濃度的金粉蕨素處理48h后，分別用0.25%的胰酶消化成單細(xì)胞懸液，離心計(jì)數(shù)，稀釋密度500個(gè)/ml，在6孔板中每孔加入1ml單細(xì)胞懸液，輕輕晃勻，在37℃的環(huán)境下培養(yǎng)2-3周，直至出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)克隆集落。終止培養(yǎng)，PBS漂洗兩次，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，使用1%的結(jié)晶紫染色20min，經(jīng)緩慢的流水洗去多余的染色液，室溫濾干。在顯微鏡（低倍鏡）下計(jì)數(shù)大于20個(gè)的克隆集落數(shù)，計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.5 離體兔胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷實(shí)驗(yàn) 利用戊巴比妥鈉（30.0mg/kg）耳緣靜脈注射麻醉新西蘭兔（南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部）后，將其頸動(dòng)脈放血致死。ACh誘導(dǎo)血管內(nèi)皮舒張功能以PE收縮的舒張百分率表示。觀察ACh誘導(dǎo)的舒張百分比。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值±方差表示，組內(nèi)數(shù)據(jù)經(jīng)方差檢驗(yàn)，組間數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金粉蕨素抑制腫瘤細(xì)胞MGC-803、HeLa、HepG2-A16的增殖 由圖1可見(jiàn)，金粉蕨素可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞MGC-803、HeLa、HepG2-A16的增殖活性，1.25μg/mL的金粉蕨素的活性抑制率分別為24%、19%、31%，相對(duì)DMSO組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而不同的腫瘤細(xì)胞對(duì)金粉蕨素的敏感度還是具有顯著差異的，由圖2可見(jiàn)，MGC-803和HepG2-A16細(xì)胞相對(duì)HeLa細(xì)胞對(duì)金粉蕨素具有更強(qiáng)的敏感度。

圖1 MTT法檢測(cè)金粉蕨素對(duì)常見(jiàn)腫瘤細(xì)胞活性的影響

圖2 不同腫瘤細(xì)胞的耐藥性

2.2 金粉蕨素抑制腫瘤細(xì)胞MGC-803、HeLa、HepG2-A16的克隆形成能力 由圖3可見(jiàn)，金粉蕨素可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞MGC-803、HeLa、HepG2-A16的克隆形成能力，2.5μg/mL的金粉蕨素的克隆形成能力分別為74.6%、47%、37%，相對(duì)DMSO組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖3 金粉蕨素對(duì)常見(jiàn)腫瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響

2.3 金粉蕨素對(duì)LPC損傷新西蘭兔離體胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮舒張功能的影響 由圖4可見(jiàn)，5.0μg/mL-50.0μg/mL的金粉蕨素對(duì)4.0μg/mL的LPC損傷的兔血管內(nèi)皮舒張功能沒(méi)有明顯影響（P＞0.05）；而在125.0μg/mL的金粉蕨素作用下，被LPC損傷的兔血管內(nèi)皮舒張功能與對(duì)照組有明顯差異（P＜0.001）。

圖4 金粉蕨素對(duì)新西蘭兔胸主動(dòng)脈舒張功能的影響。注：與LPC組比較，#P＜0.05；與LPC組比較，*P＞0.05

3 討論

目前針對(duì)惡性腫瘤的治療大多數(shù)采用手術(shù)、放化療相結(jié)合的措施，治療效果不理想[7-8]。因此，尋找高效低毒的抗癌先導(dǎo)化合物是當(dāng)務(wù)之急，也是腫瘤研發(fā)的首要任務(wù)之一。本研究發(fā)現(xiàn)金粉蕨素對(duì)MGC-803、HeLa和HepG2-A16細(xì)胞增殖和克隆形成能力具有抑制作用，并且呈濃度依賴性。與5-FU比較，金粉蕨素可作為先導(dǎo)化合物，獲得一系列衍生物，形成活性更強(qiáng)的抗癌化合物。

金粉蕨素作為一種新型二氫黃酮苷單體化合物[9]，能夠終止自由基的連鎖反應(yīng)，從而發(fā)揮抗氧化損傷作用[10-11]。本研究用離體兔胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)金粉蕨素對(duì)LPC損傷的新西蘭兔胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮舒張功能的作用強(qiáng)度與維生素E近似，保護(hù)ACh誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張。目前的研究還僅限于體外實(shí)驗(yàn)，因此金粉蕨素體內(nèi)對(duì)心血管保護(hù)作用及心血管疾病防治的功能有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，金粉蕨素抗腫瘤作用已經(jīng)得到初步證實(shí)，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其可以顯著降低MGC-803、HeLa和HepG2-A16細(xì)胞增殖和克隆形成能力，表明了金粉蕨素單體的初步藥理方向，為傳統(tǒng)中藥開(kāi)發(fā)腫瘤有效藥物提供了科學(xué)依據(jù)。