人尿激肽原酶對SAMP8小鼠模型認(rèn)知功能的影響及機制

王智亮，趙 莉，李 靖，高世超，張躍其

(濰坊市人民醫(yī)院 1.藥物臨床研究中心、2.疼痛科，山東 濰坊 261000；3.紐約州立大學(xué)布法羅分校藥理系，紐約州 布法羅 14214；4.濰坊市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 濰坊 261000)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，是老年人群中導(dǎo)致癡呆的主要原因。超過95%的AD患者是散發(fā)性AD(sporadic AD，SAD)[1]。隨著我國醫(yī)療條件的改善，老年人口比例的上升，SAD患者逐年增多。目前AD尚無有效的治療方法，因此，針對SAD的治療研究日顯重要和緊迫。針對SAD的藥物治療研究中，動物模型是藥物篩選的重要工具，SAMP8小鼠是目前公認(rèn)的非轉(zhuǎn)基因癡呆模型[2]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，8月齡SAMP8小鼠海馬神經(jīng)炎性斑、細胞外β淀粉樣蛋白42(Aβ42)、p181-Tau增多，認(rèn)知功能明顯下降，證實SAMP8小鼠可作為SAD理想的動物模型[3]。

人尿激肽原酶(human urinary kallidinogenase，HUK)是激肽釋放酶—激肽系統(tǒng)的調(diào)節(jié)物質(zhì)，能選擇性擴張腦細小動脈，減輕炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激水平，促進小血管生成，并減少神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞凋亡[4]。已有研究報道，HUK可改善大鼠腦缺血再灌注后空間學(xué)習(xí)記憶能力[5]，而記憶能力下降與突觸可塑性密切相關(guān)，但目前尚無關(guān)于HUK對SAD中認(rèn)知能力影響及突觸相關(guān)蛋白的研究報道。本研究通過觀察SAMP8小鼠給予HUK干預(yù)后的行為學(xué)及腦組織蛋白改變，探討HUK對SAD模型認(rèn)知功能的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料8月齡♂SAMP8小鼠和SAMR1小鼠購自山東大學(xué)實驗動物中心[SCXK(魯) 2019 - 0001]，動物實驗遵循動物實驗倫理要求。HUK購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司(0.15PNAU/瓶，粉針劑)。膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransterase，ChAT)購自Mlillipore公司，稀釋度為1 ∶100，二抗為羊抗免IgG，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)。IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒購自江蘇碧云天生物科技有限公司；MPO檢測盒購自南京建成生物工程研究所，引物由上海生工公司構(gòu)建。RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RtPCR擴增試劑盒購自上海吉凱基因技術(shù)有限公司。PSD95、BDNF抗體購自Abcam公司。SYN、pCREB抗體購自Cell Signaling公司。Morris水迷宮購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部神科所。冰凍切片機購自德國Leica公司。

1.2 試驗方法

1.2.1動物分組及給藥 未處理的SAMR1小鼠作為對照組(SAMR1組)。SAMP8鼠隨機分為5組：SAMP8組、治療組(分別給予8.75×10-3、1.75×10-2、3.5×10-2、7.0×10-2PNAU·kg-1尿激肽原酶，對應(yīng)a、b、c、d組)，每組10只，每日同一時間(9 ∶00 am)舌下靜脈注射0.9%氯化鈉溶液稀釋的HUK，氯化鈉量以1 mL·kg-1計。SAMR1組和SMAP8組均給予0.9%氯化鈉溶液1 mL·kg-1，1次/日，給藥共7 d，給藥結(jié)束后進行行為學(xué)實驗。

1.2.2Morris水迷宮實驗 每日游泳5次，每次60 s，記錄小鼠逃避潛伏期。若小鼠在60 s內(nèi)未找到平臺，則引導(dǎo)至目標(biāo)平臺停留5 s，觀察周圍環(huán)境。實驗歷時6 d。d 7撤掉平臺，選擇象限I為入水點，水中游泳60 s，記錄動物在目標(biāo)象限(target quadrant)的游泳時間、穿越平臺次數(shù)(passing times)。

1.2.3組織標(biāo)本制備 水迷宮結(jié)束后各組小鼠進行腹腔注射麻醉，暴露心臟后向左心室內(nèi)注射1%肝素鈉0.2 mL，經(jīng)左心室行主動脈插管，剪開右心耳后以生理鹽水沖洗血管，再以含4%多聚甲醛的0.01 mol·L-1PBS(4 ℃，pH 7.40)250 mL灌注固定，之后取材。留取一側(cè)腦組織行PCR檢測，另一側(cè)腦組織放于多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片后，進行免疫組化顯色。

1.2.4免疫組化檢測 免疫組化測定海馬組織CA3區(qū)ChAT表達。取海馬組織切片，脫蠟水化，室溫孵育10 min，PBS沖洗后以1% BSA+0.4% PBST封閉1 h，加入兔源多克隆抗ChAT抗體，37 ℃孵育1 h。PBS沖洗后加入羊抗兔的二抗，室溫孵育1 h；PBS沖洗后滴加辣根酶標(biāo)記生物素，孵育20 min后PBS沖洗，行DAB增強顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。熒光顯微鏡下觀察CA3區(qū)視野。

1.2.5RT-PCR檢測 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。使用ChAT基因引物進行逆轉(zhuǎn)錄。引物序列：上游：5′-GGTGGCCCAGAAGAGCAGTATC-3′，下游：5′-ATTGGAGGCAGGCGTTCATC-3′。PCR循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性3 m，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30s，72 ℃延伸1 m后進行36個循環(huán)，進行融解曲線分析引物的特異性。相對定量2-△△Ct法比較各組間表達差異。

1.2.6MPO活性及IL-1β、IL-18含量測定 各組中任取5只大鼠，取腦組織后剝離海馬，以生理鹽水制成10%的組織勻漿，取0.5 mL的組織勻漿，按照試劑說明書，采用分光光度計比色法用于測定髓過氧化物酶(MPO)活性，以每克腦組織所含酶活力單位(U)表示(U·g-1)。另取0.5 mL腦組織勻漿，4 ℃離心10 min后取上清液，按照說明書步驟分別用IL-1β、IL-18試劑盒檢測組織IL-1β、IL-18含量。

1.2.7Western blot檢測 突觸相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶蛋白表達腦組織中加入裂解液(1 mL·mg-1)，勻漿后離心(4 ℃下，10 min)。加入2×緩沖液后煮沸5 min。每孔上樣100 μg后進行電泳(30 mA)分離蛋白質(zhì)后以PVDF膜轉(zhuǎn)膜40 min，使用5%脫脂牛奶進行封閉，室溫勻搖2 h，將膜于PSD95一抗(1 ∶600)、SYN一抗(1 ∶800)、BDNF(1 ∶1 000)、pCREB(1 ∶500)于4 ℃孵育過夜，HRP標(biāo)記二抗孵育1 h，經(jīng)漂洗后加入ECL發(fā)光劑?；瘜W(xué)發(fā)光分析儀拍照后用ImageJ軟件進行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠空間認(rèn)知功能進行水迷宮測試前，各組間小鼠體質(zhì)量差異無顯著性(P>0.05)。進行空間探索實驗后，相較于SAMR1組，SAMP8組小鼠的平臺穿梭次數(shù)減少(P<0.05)，在的目的象限內(nèi)探索時間短(P<0.05)，游泳軌跡紊亂盲目，多采為邊緣及隨機軌跡。而給予8.75×10-3、1.75×10-2、3.5×10-2、7.0×10-2PNAU·kg-1不同劑量HUK后，平臺穿梭次數(shù)較SAMP8組增多(P<0.05或P<0.01)，在目的象限內(nèi)探索時間短(P<0.05或P<0.01)，游泳軌跡目的性強(Fig 1 A～C)。以上結(jié)果說明，給予HUK處理后，SAMP8小鼠空間探索能力得到明顯提高，空間記憶能力改善。我們以7.0×10-2PNAU·kg-1劑量的d組(HUK組)進行后續(xù)實驗。

Fig 1 Spatial cognitive function of mice in each group detected by water maze test

2.2 HUK對SAMP8小鼠CA3區(qū)ChAT表達的影響免疫組化染色可見ChAT呈胞質(zhì)胞膜染色，相較于SAMR1組，SAMP8組ChAT陽性細胞在CA3區(qū)表達明顯減少；而HUK組ChAT陽性細胞在CA3區(qū)表達明顯增多(Fig 2A)。隨后，我們對各組ChAT的表達進行了rtPCR檢測，SAMP8組表達明顯低于SAMR1組(P<0.01)，而給予HUK治療后，ChAT表達明顯高于SAMP8組(P<0.01)，見Fig 2B。

Fig 2 Spatial cognition of each group detected by water maze test(× 400)

2.3 HUK對氧化應(yīng)激水平的影響由Fig 3可見，與SAMR1組比較，SAMP8組小鼠CA3區(qū)中IL-1β、IL-18含量及MPO活性明顯升高(P<0.01)。與SAMP8組比較，HUK明顯降低小鼠CA3中IL-1β、IL-18含量及MPO活性(P<0.01)。以上結(jié)果提示HUK能降低SAMP8小鼠中氧化應(yīng)激水平。

Fig 3 Effect of HUK on level of oxidative stress##P<0.01 vs SAMR1 group; **P<0.01 vs SAMP8 group.

2.4 HUK對SAMP8小鼠突觸相關(guān)蛋白表達的影響為進一步驗證HUK能否改善SAMP8小鼠的突觸可塑性，我們采用Western blot法檢測了CA3區(qū)突觸相關(guān)蛋白PSD95和SYN。與SAMP8小鼠比，SAMR1小鼠PSD95和SYN蛋白表達量均低(P<0.01)；而經(jīng)HUK干預(yù)7 d后，PSD95和SYN蛋白的表達均增加(P<0.01)，見Fig 4。本部分結(jié)果表明HUK改善了SAMP8小鼠海馬突觸可塑性。

Fig 4 Effect of HUK on expression of synapse-related proteins ##P<0.01 vs SAMR1 group; **P<0.01 vs SAMP8 group.

2.5 HUK對pCREB-BDNF信號通路的影響Western blot分析顯示，與SAMR1組相比，SAMP8小鼠BNDF和pCREB水平明顯降低(P<0.01)。而SAMP8小鼠經(jīng)HUK處理后，BNDF和pCREB水平顯著增加(P<0.01)。見Fig 5。以上結(jié)果表明HUK增強了SAMP8小鼠海馬中的pCREB/BDNF信號傳導(dǎo)，這可能是HUK保護突觸可塑性的潛在機制。

Fig 5 Effect of HUK on pCREB-BDNF signaling pathway##P<0.01 vs SAMR1 group; **P<0.01 vs SAMP8 group.

3 討論

本研究表明，HUK能明顯改善8月齡SAMP8小鼠的空間認(rèn)知功能，HUK提高了SAMP8小鼠CA3區(qū)ChAT的表達，并且HUK能減輕小鼠腦組織中氧化應(yīng)激水平，促進突觸相關(guān)蛋白的表達。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，HUK具有多方面的藥理活性，能夠減弱氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)元凋亡，并保護瀕臨壞死的神經(jīng)元[4-5]。臨床研究證實，HUK能夠減輕神經(jīng)功能損傷，促進腦組織修復(fù)能力，促進神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，具有潛在的改善認(rèn)知功能作用[4]。但目前尚無關(guān)于HUK與SAD模型中神經(jīng)元細胞ChAT、突觸蛋白表達的研究報道。

AD的標(biāo)志性病理學(xué)改變包括：由Aβ構(gòu)成的淀粉樣炎性斑塊、Tau蛋白過度磷酸化構(gòu)成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。少部分AD患者與Aβ前體蛋白和早老素1、2基因突變有關(guān)，大多數(shù)AD患者呈散發(fā)性，與突變基因無關(guān)聯(lián)。SAD的多種致病因素可能最終導(dǎo)致Aβ的瀑布效應(yīng)，意味著在Aβ形成之前SAD患者存在其他形式病理改變[6]。乙酰膽堿是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，在學(xué)習(xí)記憶中起重要作用。膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)為乙酰膽堿生成的限速酶。AD患者多處腦區(qū)ChAT活性降低，表達量減少，與患者癡呆程度、腦內(nèi)Aβ含量呈負相關(guān)。

SAMP8小鼠模型是由AKR/J小鼠品系基于自然衰老篩選而來的快速老化模型，未經(jīng)基因突變修飾，表現(xiàn)出記憶力和學(xué)習(xí)能力的迅速惡化[7-8]。SAMP8小鼠具有AD早期的多種特征，例如神經(jīng)元和樹突棘的喪失、膽堿能缺陷、氧化應(yīng)激增加等[3，7]，因此，SAMP8是進行SAD研究的良好動物模型。本研究中，SAMP8小鼠空間認(rèn)知能力較SAMR1小鼠明顯下降，并且出現(xiàn)ChAT減少、氧化應(yīng)激水平增加，進一步證實了以上結(jié)論。AD發(fā)病機制中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)是促炎細胞因子增加為特征的神經(jīng)炎性相關(guān)氧化應(yīng)激過程，IL-1β和IL-18介導(dǎo)谷氨酸興奮毒性與氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡。IL-1β和IL-18參與了神經(jīng)損傷后炎性小體介導(dǎo)的氧化應(yīng)激作用，去氧化狀態(tài)后，IL-1β、IL-18、cleaved-caspase-1和MPO表達降低[9-10]，而氧化應(yīng)激還可進一步增加IL-1β和IL-18的產(chǎn)生[11]。Corbo等[12]最新研究表明，白細胞端粒長度和IL-1β和IL-18是認(rèn)知障礙轉(zhuǎn)變?yōu)锳D的新型標(biāo)志物，AD不僅是神經(jīng)退行性疾病，而且是具有加速氧化應(yīng)激水平的“全身”疾病。AD患者及動物模型中氧化應(yīng)激水平增高，而神經(jīng)元內(nèi)氧化應(yīng)激會導(dǎo)致突觸減少及樹突棘丟失[13]。在1-2月齡APP/PS1小鼠中Aβ斑周圍存在較強氧化應(yīng)激水平，而突觸明顯減少，在3xTg-AD小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)域明顯氧化應(yīng)激水平，海馬神經(jīng)元傳遞信號級聯(lián)降低，并影響突觸可塑性[14-15]。

膽堿能神經(jīng)元主要分布于海馬CA3區(qū)，而海馬CA3區(qū)與學(xué)習(xí)及記憶密切相關(guān)，CA3區(qū)損傷會出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶功能障礙。研究顯示SAD患者CA3區(qū)出現(xiàn)明顯增齡性退變[16]。海馬區(qū)突觸相關(guān)蛋白也參與了學(xué)習(xí)記憶過程，突觸素(SYN)是突觸前末端標(biāo)記物，而突觸后密度蛋白95(PSD95)則是突觸后末端標(biāo)記物。除了神經(jīng)營養(yǎng)功能外，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)還可以有效調(diào)節(jié)突觸可塑性、學(xué)習(xí)和記憶。突觸蛋白的表達和活性通過BDNF來調(diào)節(jié)，海馬中SYN和PSD95的表達會通過增強的BDNF信號傳導(dǎo)而增加[17]，而BDNF的神經(jīng)保護作用則依賴于磷酸化轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋(pCREB)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄[18]。本研究中，SAMP8小鼠突觸相關(guān)蛋白及BDNF、pCREB均減少，與上述研究結(jié)果相一致。

綜上，本研究證明HUK具有提高SAD動物模型認(rèn)知功能的作用，能改善CA3區(qū)神經(jīng)元功能，其機制可能通過促進CA3區(qū)ChAT表達、減輕氧化應(yīng)激水平及增加突觸相關(guān)蛋白表達來實現(xiàn)。由此初步闡明HUK具有潛在的AD治療效果。在以后的工作中，我們還將繼續(xù)通過體外細胞實驗，以進一步闡明HUK的分子作用機制。