珠子參總皂苷上調(diào)miR-216a 抑制人巨細(xì)胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞損傷

高山，龐婕，李占結(jié)，李晨希，尚慶毅

1.連云港第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 連云港 222006；2.江蘇省人民醫(yī)院感染科，南京 210036；3.徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221004；4.連云港市贛榆區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 連云港 222199

人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）屬于雙鏈DNA 病毒，HCMV 病毒感染機體后可能終身攜帶，我國HCMV 感染率為80%以上，主要感染人群為嬰幼兒、艾滋病患者等，目前抗HCMV 感染藥物的研究相對滯緩，臨床用于抗HCMV 感染的藥物較少，尋找安全有效且副作用小的藥物成為研究重點[1]。珠子參為五加科人參屬植物子參的干燥根狀莖，具有祛瘀止痛等功效，珠子參總皂苷是珠子參的活性成分之一，有活血作用，研究表明珠子參總皂苷可抑制炎癥反應(yīng)從而減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷[2]。HCMV 具有230 kb 的基因組并可編碼微小RNA（miRNA），miRNA 可通過靶mRNA 抑制其翻譯及降解，病毒的miRNA 與潛伏感染、細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)[3]。微小RNA-216a（miR-216a）在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷中表達(dá)水平降低，并可調(diào)控JAK2/STAT3 和NF-κB 信號傳導(dǎo)減輕LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷[4]。但珠子參總皂苷能否通過調(diào)節(jié)miR-216a 表達(dá)影響HCMV 感染性疾病的發(fā)生過程尚未可知。本研究采用HCMV 感染人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5 建立病毒感染模型，檢測珠子參總皂苷對HCMV 感染MRC-5 細(xì)胞炎癥及凋亡的影響，探究其對miR-216a 的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人巨細(xì)胞病毒HCMV AD169 購自中國科學(xué)院微生物研究所；人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5 購自上海澤葉生物科技有限公司；珠子參購自蘭州沃特萊斯生物科技有限公司，并經(jīng)鑒定為五加科人參屬植物珠子參；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自上海玉博生物科技有限公司；TNF-α、IL-6 檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma 公司；Lipofectamine2000 購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR 試劑購自美國Thermo Fisher 公司；miR-NC、miR-216a mimics、anti-miR-NC、anti-miR-216a 購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；兔抗人Bcl-2、Bax 抗體購自美國CST 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 珠子參總皂苷培養(yǎng)液配制[5]稱取1 kg 珠子參根莖磨碎成粉狀，加入60%乙醇回流提取，2 h 提取3次，收取3 次過濾后的濾液，減壓處理后得到乙醇提取物375 g，將提取物溶解于蒸餾水中，分別經(jīng)石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到正丁醇提取物219 g，將其溶解于蒸餾水，加入含大孔吸附樹脂D101 的色譜柱中，使用蒸餾水清洗后采用乙醇洗脫（30%、60%、90%），得到正丁醇精制物，采用高效液相色譜法對其進(jìn)行定量分析，鑒定其中珠子參總皂苷的含量60 g。其溶解于DMSO（1%）中，制備濃度為10 mg/mL 的母液，根據(jù)實驗需求分別稀釋至100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL。

1.2.2 實驗分組 MRC-5 細(xì)胞接種于96 孔板培養(yǎng)成單層細(xì)胞后分別加入HCMV 病毒感染（100 TCID50/孔）[6]，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h 后棄病毒液，記為病毒模型組。同時將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組。MRC-5 細(xì)胞接種于96 孔板（3×103個/孔）后加入HCMV 病毒感染（100 TCID50/孔）1 h 后棄病毒液，放入不同濃度（100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL）的珠子參總皂苷培養(yǎng)液孵育24 h，分別記為病毒+珠子參總皂苷100 μg/mL 組、病毒+珠子參總皂苷200 μg/mL 組、病毒+珠子參總皂苷400 μg/mL 組。采用Lipofectamine2000 試劑分別將miR-NC、miR-216a mimics 轉(zhuǎn)染入MRC-5 細(xì)胞24 h 后加入HCMV 病毒感染（100 TCID50/孔）1 h 后棄病毒液，更換含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別記為病毒+miR-NC 組、病 毒+miR-216a 組。采 用Lipofecta mine2000 試劑分別將anti-miR-NC、anti-miR-216a 轉(zhuǎn)染入MRC-5 細(xì)胞24 h 后加入HCMV 病毒感染（100 TCID50/孔）1 h 后棄病毒液，更換含400 μg/mL 的珠子參總皂苷培養(yǎng)液孵育24 h，分別記為病毒+珠子參總皂苷+anti-miR-NC 組、病毒+珠子參總皂苷+anti-miR-216a 組。

1.2.3 ELISA 檢測TNF-α、IL-6 的水平 取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA 檢測TNF-α、IL-6 的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 取各組MRC-5細(xì)胞加入預(yù)冷PBS 清洗，4℃經(jīng)3000 r/min 離心10 min，棄上清，加入Binding Buffer 懸浮細(xì)胞（500 μL），依次分別加入5 μL Annexin V-FITC 與5 μL PI，充分混勻后避光孵育10 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 qRT-PCR 檢測細(xì)胞中miR-216a 表達(dá)水平 采用Trizol 法提取各組MRC-5 細(xì)胞總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計測定RNA 濃度。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 2 μL，10×RT Buffer 2 μL，dNTP 0.4 μL，Multiscripe RT 1 μL，10×Random Primer 2 μL，RNase-Free ddH2O 補足體系至20 μL；反應(yīng)條件：25 ℃10 min，37 ℃60 min，95 ℃5 min，4 ℃保存。qRT-PCR 反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，Real-Time Master Mix 10 μL，正反向引物各1 μL，RNase-Free dd H2O 補足體系至20 μL；條件：95 ℃預(yù)變性5 min 循環(huán)1 次，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)40 次。miR-216a 以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-216a 相對表達(dá)量。

1.2.6 Western blot 檢測Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá) 各組MRC-5 細(xì)胞加入RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度，SDS-PAGE 電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，分別孵育一抗稀釋液（1：1000）與二抗稀釋液（1：5000），孵育條件分別為4℃孵育24 h（一抗）、室溫孵育1 h（二抗），暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用ImageJ 軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 珠子參總皂苷對人巨細(xì)胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

與對照組比較，病毒模型組TNF-α、IL-6 的水平升高（P＜0.05）；與病毒模型組比較，病毒+珠子參總皂苷100 μg/mL 組、病毒+珠子參總皂苷200 μg/mL 組、病毒+珠子參總皂苷400 μg/mL 組TNF-α、IL-6 的水平降低（P＜0.05），且病毒+珠子參總皂苷100 μg/mL 組、病毒+珠子參總皂苷200 μg/mL 組、病毒+珠子參總皂苷400 μg/mL 組間TNF-α、IL-6 的水平比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 珠子參總皂苷對人巨細(xì)胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞炎癥因子TNF-α（A）及IL-6（B）表達(dá)的影響* P＜0.05，與對照組比較 #P＜0.05，與病毒模型組比較 &P＜0.05，$P＜0.05，與珠子參總皂苷不同濃度組比較Fig.1 Effects of rhizome panacis majoris total saponin on the expression of inflammatory factors TNF-α (A) and IL-6 (B) in human embryonic lung fibroblasts infected with human cytomegalovirusCompared with the control group,*P＜0.05;compared with the virus model group,#P＜0.05;compared with the virus+rhizome panacis majoris total saponin 100 μg/mL group,&P＜0.05;compared with the virus+rhizome panacis majoris total saponin 200 μg/mL group,$P＜0.05

2.2 珠子參總皂苷對人巨細(xì)胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較，病毒模型組凋亡率升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平降低（P＜0.05），Bax 蛋白水平升高（P＜0.05）；與病毒模型組比較，病毒+珠子參總皂苷100 μg/mL 組、病毒+珠子參總皂苷200 μg/mL 組、病毒+珠子參總皂苷400 μg/mL 組凋亡率降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平升高（P＜0.05），Bax 蛋白水平降低（P＜0.05），且病毒+珠子參總皂苷100 μg/mL 組、病毒+珠子參總皂苷200 μg/mL 組、病毒+珠子參總皂苷400 μg/mL 組各指標(biāo)間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 珠子參總皂苷對人巨細(xì)胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞凋亡率（A）及相關(guān)蛋白表達(dá)（B）的影響*P＜0.05，與對照組比較 #P＜0.05，與病毒模型組比較 &P＜0.05，$P＜0.05，與珠子參總皂苷不同濃度組比較Fig.2 Effects of rhizome panacis majoris total saponin on the apoptosis rate (A) and related protein expression (B)of human embryonic lung fibroblasts infected by human cytomegalovirus Compared with the control group,*P＜0.05;compared with the virus model group,#P＜0.05;compared with the virus+rhizome panacis majoris total saponin 100 μg/mL group,&P＜0.05;compared with the virus+rhizome panacis majoris total saponin 200 μg/mL group,$P＜0.05

2.3 珠子參總皂苷對人巨細(xì)胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞中miR-216a 表達(dá)的影響

與對照組比較，病毒模型組miR-216a 的表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與病毒模型組比較，病毒+珠子參總皂苷100 μg/mL 組、病毒+珠子參總皂苷200 μg/mL組、病毒+珠子參總皂苷400 μg/mL 組miR-216a 的表達(dá)水平升高（P＜0.05），且病毒+珠子參總皂苷100 μμg/mL 組、病毒+珠子參總皂苷200 μg/mL 組、病毒+珠子參總皂苷400 μg/mL 組間miR-216a 的表達(dá)水平比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 珠子參總皂苷對人巨細(xì)胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞中miR-216a 表達(dá)的影響*P＜0.05，與對照組比較 #P＜0.05，與病毒模型組比較 &P＜0.05，$P＜0.05，與珠子參總皂苷不同濃度組比較Fig.3 Effects of rhizome panacis majoris total saponin on the expression of miR-216a in human embryonic lung fibroblasts infected with human cytomegalovirusCompared with the control group,*P＜0.05;compared with the virus model group,#P＜0.05;compared with the virus+rhizome panacis majoris total saponin 100 μg/mL group,&P＜0.05;compared with the virus+panacis majoris rhizome total Compared with saponin 200 μg/mL group,$P＜0.05

2.4 miR-216a 過表達(dá)對人巨細(xì)胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

與病毒+miR-NC 組比較，病毒+miR-216a 組TNFα、IL-6 的水平降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 miR-216a 過表達(dá)對人巨細(xì)胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響A：miR-216a 相對表達(dá)量B：miR-216a 過表達(dá)對人巨細(xì)胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞TNF-α 表達(dá)的影響C：miR-216a 過表達(dá)對人巨細(xì)胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞IL-6 表達(dá)的影響* P＜0.05，與病毒+miR-NC 組比較Fig.4 Effects of miR-216a overexpression on the inflammatory factor in human embryonic lung fibroblasts infected by human cytomegalovirusA: The relative expression of miR-216a; B: Effects of miR-216a overexpression on the expression of TNF-α in human embryonic lung fibroblasts infected by human cytomegalovirus;C: Effects of miR-216a overexpression on the expression of IL-6 in human embryonic lung fibroblasts infected with human cytomegalovirus；Compared with virus+miR-NC group,*P＜0.05

2.5 miR-216a 過表達(dá)對人巨細(xì)胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞凋亡的影響

與病毒+miR-NC 組比較，病毒+miR-216a 組凋亡率降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平升高（P＜0.05），Bax蛋白水平降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 miR-216a 過表達(dá)對人巨細(xì)胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞凋亡率（A）及相關(guān)蛋白表達(dá)（B）的影響*P＜0.05，與病毒+miR-NC 組比較Fig.5 Effects of miR-216a overexpression on the apoptosis rate (A) and the related protein expression (B) of human embryonic lung fibroblasts infected by human cytomegalovirusCompared with virus+miR-NC group,*P＜0.05

2.6 抑制miR-216a 表達(dá)逆轉(zhuǎn)珠子參總皂苷（400 μg/mL）對人巨細(xì)胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞炎癥損傷的作用

與病毒+珠子參總皂苷+anti-miR-NC 組比較，病毒+珠子參總皂苷+anti-miR-216a 組TNF-α、IL-6 的水平升高（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平降低（P＜0.05），Bax蛋白水平升高（P＜0.05），見圖6。

圖6 抑制miR-216a 表達(dá)逆轉(zhuǎn)珠子參總皂苷對人巨細(xì)胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞炎癥損傷的作用A：miR-216a 相對表達(dá)量 B：抑制miR-216a 表達(dá)逆轉(zhuǎn)珠子參總皂苷對人巨細(xì)胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞TNF-α 表達(dá)的作用C：抑制miR-216a 表達(dá)逆轉(zhuǎn)珠子參總皂苷對人巨細(xì)胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞IL-6 表達(dá)的作用D：抑制miR-216a 表達(dá)逆轉(zhuǎn)珠子參總皂苷對人巨細(xì)胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞凋亡的作用E：抑制miR-216a 表達(dá)逆轉(zhuǎn)珠子參總皂苷對人巨細(xì)胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的作用* P＜0.05，與病毒+珠子參總皂苷+anti-miR-NC 組比較Fig.6 Inhibition of miR-216a expression reversed the effect of rhizome panacis majoris total saponin on the inflammatory injury of human embryonic lung fibroblasts infected by human cytomegalovirusA: Relative expression of miR-216a; B: Inhibition of miR-216a expression reversed the effect of total saponins of Zhuzishen on the expression of TNF-α in human embryonic lung fibroblasts infected by human cytomegalovirus; C: Inhibition of miR-216a expression reversed the effect of rhizome panacis majoris total saponin on the expression of IL-6 in human embryonic lung fibroblasts infected by human cytomegalovirus; D: Inhibition of miR-216a expression reversed the effect of rhizome panacis majoris total saponin on human cytomegalovirus infection of human embryonic lung fibroblasts the effect of apoptosis; E: Inhibition of miR-216a expression reversed the effect of rhizome panacis majoris total saponin on the expression of apoptosis-related proteins in human embryonic lung fibroblasts infected with human cytomegalovirusCompared with virus+rhizome panacis majoris total saponin+anti-miR-NC group,*P＜0.05

3 討論

本研究結(jié)果顯示，HCMV 感染的MRC-5 細(xì)胞中TNF-α、IL-6 的水平升高，與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果相似[7]，提示成功建立病毒感染模型。本研究進(jìn)一步分析顯示，珠子參總皂苷可明顯降低HCMV 感染的MRC-5 細(xì)胞中TNF-α、IL-6 的水平，且隨著藥物濃度的升高而明顯降低，細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2 的表達(dá)下調(diào)而Bax 的表達(dá)上調(diào)，而珠子參總皂苷處理后可明顯降低HCMV感染的MRC-5 細(xì)胞凋亡率，促進(jìn)Bcl-2 的表達(dá)及抑制Bax 的表達(dá)，且呈劑量依賴性；HCMV 感染的MRC-5細(xì)胞中miR-216a 的表達(dá)水平降低，提示HCMV 可能編碼miR-216a 而參與機體病理過程；miR-216a 過表達(dá)可明顯降低HCMV 感染的MRC-5 細(xì)胞中TNF-α、IL-6 的水平，還可降低細(xì)胞凋亡率。

文獻(xiàn)揭示，珠子參總皂苷具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化等作用，可通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及增強組織抗氧化能力從而減輕肝損傷；珠子參總皂苷對心腦血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等具有一定作用，可抑制促炎因子生成從而保護(hù)心肌梗死大鼠的心肌組織；珠子參總皂苷可能通過激活PI3K/Akt 通路及抑制線粒體途徑從而減輕小鼠缺血再灌注損傷[8～10]。本研究結(jié)果提示珠子參總皂苷可通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗HCMV 感染的作用。細(xì)胞炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2 屬于抗凋亡蛋白，Bax 屬于促凋亡蛋白，Bax 表達(dá)水平升高可激活線粒體凋亡途徑從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。本研究結(jié)果提示珠子參總皂苷可通過抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡從而減輕HCMV 感染的MRC-5 細(xì)胞損傷。文獻(xiàn)表明，miR-216a 上調(diào)表達(dá)通過負(fù)調(diào)控JAK2/STAT3 抑制細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)從而對缺血性損傷發(fā)揮保護(hù)作用；miR-216a-5p 通過靶向HMGB1/NF-kB 途徑減輕過氧化氫誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞損傷；LncRNA DANCR 通過miR-216a-5p-JAK2-STAT3 軸調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡[12～14]。本研究結(jié)果提示miR-216a 過表達(dá)可通過抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抗HCMV 感染的作用。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，珠子參總皂苷可明顯提高HCMV 感染的MRC-5 細(xì)胞中miR-216a 的表達(dá)水平，提示珠子參總皂苷可能通過上調(diào)miR-216a 的表達(dá)從而逆轉(zhuǎn)HCMV 感染引起的一系列疾病的發(fā)生。為進(jìn)一步探究珠子參總皂苷與miR-216a 在抗HCMV 感染過程中的作用機制，本研究抑制miR-216a 與珠子參總皂苷聯(lián)合處理HCMV 感染的MRC-5 細(xì)胞，結(jié)果顯示，TNF-α、IL-6 的水平升高，凋亡率升高，提示抑制miR-216a 表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)珠子參總皂苷對HCMV 感染的MRC-5 細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡的作用，

綜上所述，珠子參總皂苷可通過上調(diào)miR-216a的表達(dá)而抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡從而減輕HCMV感染的MRC-5 細(xì)胞損傷，miR-216a 可能作為逆轉(zhuǎn)HCMV 感染的潛在靶點，還可為進(jìn)一步揭示珠子參總皂苷抗HCMV 感染的作用機制奠定實驗基礎(chǔ)。