一起兔瘟疫情的診斷與防控建議

韋登國(guó)， 譚舒華， 趙 超， 姜德榮

(1. 貴州省平塘縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 平塘 558300； 2. 貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025； 3. 黔西南布依族苗族自治州鄉(xiāng)村振興局，貴州 興義 562400)

兔瘟是由兔出血癥病毒(RHDV)引起的1種急性、敗血性傳染病，以實(shí)質(zhì)器官出血、水腫和肝臟壞死為特征，一年四季均可發(fā)生，發(fā)病急，傳播快，發(fā)病率及病死率高，易感兔發(fā)病率為90%，病死率可達(dá)100%[1～4]。2021年12月，貴州省平塘縣牙舟鎮(zhèn)某肉兔養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生以呼吸系統(tǒng)癥狀為主要特征的疾病。為確診病原，采集3只病兔的肝臟組織送貴州大學(xué)貴州省動(dòng)物疫病研究室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1 病例情況

該場(chǎng)存欄伊拉兔12 000只，2021年12月19日個(gè)別兔出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，臨床癥狀表現(xiàn)為口腔和鼻腔流出血樣液體，體溫升高，呼吸困難，突然死亡。12月20日兔死亡數(shù)量增加，兔場(chǎng)立即對(duì)未發(fā)病的兔進(jìn)行兔瘟疫苗緊急接種，但發(fā)病和死亡未得到有效控制，至12月26日兔死亡近10 000只，發(fā)病率83.33%，病死率100%。

2 流行病學(xué)調(diào)查

該場(chǎng)近6個(gè)月內(nèi)沒(méi)有從場(chǎng)外引進(jìn)種兔，2021年12月15日?qǐng)鲋饔?輛私人小貨車運(yùn)送300只商品兔到場(chǎng)外銷售，車輛和人員回養(yǎng)殖場(chǎng)后未進(jìn)行消毒，隨后出現(xiàn)兔發(fā)病死亡。

3 病理變化

對(duì)3只病兔進(jìn)行剖檢，可見(jiàn)肝臟水腫、質(zhì)脆、出血(見(jiàn)圖1)，肺臟水腫、出血(見(jiàn)圖2)，氣管充血、出血，其他組織器官無(wú)明顯變化。根據(jù)病理變化，疑似兔瘟或巴氏桿菌病。

圖1 肝臟水腫、質(zhì)脆、出血

圖2 肺臟水腫、出血

4 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

4.1 檢測(cè)病料無(wú)菌采集3只病兔的肝臟組織作為檢測(cè)病料，重點(diǎn)進(jìn)行兔出血癥病毒和巴氏桿菌核酸檢測(cè)。

4.2 主要試劑柱式DNA和RNA提取試劑盒、2×TaqPCR Mix、DL 2 000 DNA Maker，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；兔出血癥病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒、兔出血癥病毒一步法RT-PCR診斷試劑盒(內(nèi)含RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、引物RHD、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、ddH2O)，購(gòu)自山東綠都生物科技有限公司。

4.3 主要儀器熒光定量PCR儀(型號(hào)：BIO-RAD，上海艾研生物科技有限公司)、PCR儀(型號(hào)：VeritiTM96-Well Thermai Cycler，美國(guó)ABI公司)、電泳儀(型號(hào)：DYY-8C，北京六一生物科技有限公司)。

4.4 引物按照參考文獻(xiàn)[5]中多殺性巴氏桿菌KMT1基因檢測(cè)引物序列(見(jiàn)表1)，由上海生物工程股份有限公司合成，按說(shuō)明書(shū)稀釋至10 μmol/L，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

表1 多殺性巴氏桿菌引物信息

4.5 兔出血癥病毒核酸檢測(cè)

4.5.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR用柱式RNA提取試劑盒分別提取3份肝臟組織的總RNA，用兔出血癥病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)成立條件：陰性對(duì)照無(wú)Ct值或Ct值>32，且無(wú)特異擴(kuò)增曲線；陽(yáng)性對(duì)照Ct值<25，且有特異擴(kuò)增曲線。結(jié)果判定：檢測(cè)樣品Ct值≤30，且出現(xiàn)特異擴(kuò)增曲線，判為陽(yáng)性；檢測(cè)樣品Ct值>32或無(wú)Ct值，且無(wú)擴(kuò)增曲線，判為陰性；檢測(cè)樣品30

+：陽(yáng)性對(duì)照； -：陰性對(duì)照； 1～3：檢測(cè)樣品圖3 兔出血癥病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

4.5.2 一步法RT-PCR采用兔出血癥病毒一步法RT-PCR診斷試劑盒(目的片段440 bp)對(duì)2號(hào)樣品進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系20 μL：RT-PCR反應(yīng)液10 μL，引物RHD 2 μL，酶混合液0.8 μL，模板RNA 2 μL，ddH2O 5.2 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min，50 ℃ 30 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸 6 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示2號(hào)樣品于440 bp處出現(xiàn)特異條帶(見(jiàn)圖4)。確診2號(hào)樣品存在兔出血癥病毒感染。

M：DL 2 000 DNA Marker； +：陽(yáng)性對(duì)照； -：陰性對(duì)照； 2：2號(hào)樣品圖4 兔出血癥病毒一步法RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

4.6 巴氏桿菌核酸檢測(cè)用柱式DNA提取試劑盒分別提取3份肝臟組織的總DNA，用巴氏桿菌KMT1基因檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(目的片段460 bp)，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，未出現(xiàn)特異條帶，表明無(wú)巴氏桿菌感染。

5 診斷及處置

通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、病理剖檢、相關(guān)病原核酸檢測(cè)，診斷此次疫情為兔出血癥病毒感染引發(fā)的兔瘟。鑒于該場(chǎng)兔發(fā)病及死亡較多，已無(wú)太大治療價(jià)值，為避免疫情繼續(xù)傳播蔓延，2022年1月3日對(duì)兔場(chǎng)剩余兔全部撲殺并進(jìn)行了無(wú)害化處理。

6 感染原因分析

6.1 免疫失敗疫苗保存不當(dāng)或免疫注射不規(guī)范造成免疫失敗。

6.2 養(yǎng)殖場(chǎng)選址不合理該養(yǎng)兔場(chǎng)位于縣道邊，且沒(méi)有建設(shè)圍墻，養(yǎng)殖場(chǎng)和管理用房(飼料房)分別位于道路的兩側(cè)，飼養(yǎng)員必須橫穿縣道才能進(jìn)入養(yǎng)殖場(chǎng)，不利于疫病防控。

6.3 防疫制度不嚴(yán)格，防疫意識(shí)差外來(lái)人員可隨意進(jìn)入兔舍參觀，飼養(yǎng)人員沒(méi)有進(jìn)行徹底消毒就進(jìn)入兔舍；運(yùn)輸商品兔和飼料的車輛沒(méi)有分開(kāi)，裝卸前后未對(duì)車輛進(jìn)行嚴(yán)格清洗消毒，造成車輛或人員攜帶病原進(jìn)入兔場(chǎng)引發(fā)疫情。

7 防控措施

加強(qiáng)生物安全防控和免疫預(yù)防接種是預(yù)防兔瘟的主要措施。要堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，做好防蟲(chóng)、防鼠工作，合理安排養(yǎng)殖密度(每籠1～2只)，保證適當(dāng)光照和通風(fēng)。做好兔舍衛(wèi)生和消毒工作，兔籠、飼養(yǎng)用具及場(chǎng)內(nèi)外環(huán)境用2%來(lái)蘇兒溶液、4%氫氧化鈉溶液交替消毒，每周至少消毒1～2次。病兔淘汰或隔離，死兔焚燒或深埋。不從疫區(qū)引種，引種時(shí)進(jìn)行嚴(yán)格檢疫與隔離觀察。建立嚴(yán)格的防疫制度，禁止外來(lái)人員及運(yùn)輸工具未經(jīng)消毒直接進(jìn)入養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)。建立科學(xué)的免疫程序：30～40日齡兔皮下注射兔瘟-巴氏桿菌二聯(lián)苗1 mL，1個(gè)月后加強(qiáng)免疫1次，之后每4個(gè)月免疫 1次。 疫苗應(yīng)規(guī)范管理，按說(shuō)明書(shū)要求存放于合適的溫度環(huán)境。