嘧菌酯對河南省小麥莖基腐病菌的抑制活性及對病害的防治效果

郭雨薇, 徐建強(qiáng), 亢豪佳, 殷消茹, 劉圣明, 陳根強(qiáng)

(河南科技大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，河南 洛陽 471003)

小麥莖基腐病是由多種鐮刀菌引起的土傳病害，其中主要病原物為假禾谷鐮孢Fusarium pseudograminearum[1-2]。自2012 年河南省首次報道由假禾谷鐮孢引起的小麥莖基腐病后[3]，該病就在中國東部小麥主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，且危害日趨嚴(yán)重[4-5]。2021 年2 月，該病已被列入《河南省二類農(nóng)作物病蟲害名錄》[6]。目前，小麥莖基腐病的防治主要以化學(xué)防治為主，但還未有防治小麥莖基腐病的藥劑登記。嘧菌酯(azoxystrobin)為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑(methoxy-acrylates)，屬于呼吸抑制劑C3 類[7]，作用靶標(biāo)為真菌線粒體復(fù)合物Ⅲ，即線粒體內(nèi)膜外壁上細(xì)胞色素bc1 復(fù)合物上的醌氧化位點(ubiquinol oxidationsite)——Qo，與Qo 位點的細(xì)胞色素b 低勢能血紅素(Qo-proximal)結(jié)合，阻止電子從細(xì)胞色素b 向c1 的轉(zhuǎn)移，破壞ATP 合成，干擾真菌進(jìn)行呼吸作用，故又被稱為Qo 位點抑制劑(QoIs)[8-9]。嘧菌酯不僅具有廣譜殺菌性，對植物還兼有保護(hù)和治療的效果[10-11]。根據(jù)FRAC (Fungicide Resistance Action Committee)報告，目前尚未有鐮刀菌對QoIs 類藥劑產(chǎn)生抗藥性[12]。因此評價小麥莖基腐病對嘧菌酯的敏感性，并通過離體接種和溫室盆栽試驗評價嘧菌酯的防治效果，可為該藥劑在小麥莖基腐病綜合防治中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、藥劑及培養(yǎng)基

1.1.1 試驗菌株 2021 年在河南17 個縣市采集有典型發(fā)病癥狀的小麥莖基腐病標(biāo)本，即近地面莖節(jié)處有粉紅色霉層，將發(fā)病莖節(jié)剪下，經(jīng)分離純化獲得小麥莖基腐病菌，轉(zhuǎn)接在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)斜面上，4 ℃冰箱保存。對獲得的菌株利用假禾谷鐮孢(Fpg-F, 5′-CGGGGTAGTT TCACATTTCCG-3′/Fpg-R, 5′-GAGAATGTG ATGACGACAATA-3′; 擴(kuò)增長度 520 bp)和禾谷鐮孢(Fg-F, 5′-TTCTTTGACATCTGTTCAACC CA-3′/Fg-R, 5′-ACAGATGACAAGATTCAGGCA CA-3′, 擴(kuò)增長度280 bp) 特異性引物進(jìn)行分子鑒定，獲得假禾谷鐮孢76 株，禾谷鐮孢6 株，共82 株。

表1 試驗所用藥劑信息Table 1 Information of tested fungicides in the study

1.1.3 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂16 g，加去離子水至1 L，用于菌株分離、純化、保存；綠豆湯培養(yǎng)液：綠豆30 g，煮沸至綠豆裂開，加去離子水定容至1 L，過濾去除綠豆，用于菌株搖培產(chǎn)孢；水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂16 g，去離子水定容至1 L，用于孢子萌發(fā)的測定；小米培養(yǎng)基：30 g小米煮熟晾干，裝入錐形瓶中滅菌備用，用于溫室防效的測定[13]。

1.2 嘧菌酯對小麥莖基腐病菌的抑制作用

1.2.1 嘧菌酯對假禾谷鐮孢及禾谷鐮孢孢子萌發(fā)的抑制活性測定 采用孢子萌發(fā)法[13]。供試菌株培養(yǎng)3 d 后，在菌落邊緣打取8 個直徑為5 mm 的菌餅，放入50 mL 綠豆湯培養(yǎng)液中，在25 ℃、175 r/min 的恒溫振蕩搖床上進(jìn)行搖培產(chǎn)孢。培養(yǎng)條件為12 h 光照，12 h 黑暗。搖培5 d 后，用紗布過濾至離心管中，于4 ℃、6 000 r/min 下離心10 min，倒掉上清液，加入清水，反復(fù)離心兩次。調(diào)整孢子濃度為1 × 105個/mL。配制嘧菌酯最終濃度為0、0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5 和1 μg/mL 的含藥PSA 平板，并在每個平板內(nèi)加入100 μg/mL 的水楊肟酸以抑制旁路氧化途徑。吸取50 μL 孢子懸浮液均勻涂布在培養(yǎng)基表面，于25 ℃下黑暗培養(yǎng)4 h，以孢子芽管長度大于短半徑為萌發(fā)，當(dāng)空白對照萌發(fā)率達(dá)95%以上時統(tǒng)計各處理孢子萌發(fā)情況。每處理重復(fù)3 次，每個重復(fù)統(tǒng)計100 個孢子。按公式(1)計算各藥劑濃度處理下孢子萌發(fā)抑制率(Ig)；用WPS 11.1 和DPS V9.50 計算藥劑抑制孢子萌發(fā)的毒力回歸方程和EC50值。

式中：Rc為對照組孢子萌發(fā)率，%；Rt為處理組孢子萌發(fā)率，%。

1.2.2 假禾谷鐮孢孢子萌發(fā)對嘧菌酯的敏感性基線建立 將嘧菌酯對76 株假禾谷鐮孢孢子萌發(fā)的毒力(EC50值)從低到高分為6 個區(qū)間，從最小值開始，統(tǒng)計EC50值在每個區(qū)間的菌株數(shù)和頻率。以每個區(qū)間的EC50平均值為橫坐標(biāo)，菌株的分布頻率為縱坐標(biāo)，繪制假禾谷鐮孢對嘧菌酯敏感性頻率分布圖。用WPS 11.1 計算測定的EC50值中是否有異常值，按公式 (2) 計算誤差值 (M)；當(dāng)M＞3 時表示該菌株EC50值異常，舍棄[14]。以嘧菌酯對正常菌株的平均EC50值作為病菌對嘧菌酯的敏感性基線。

式中，A代表計算值的絕對值；X代表某一菌株的EC50值；AT代表76 個菌株的平均EC50值；SDT代表76 個菌株EC50值的標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.3 河南省不同地市菌株孢子萌發(fā)對嘧菌酯的敏感性差異分析 利用 DPS V9.50 的最小顯著差數(shù)(LSD)法進(jìn)行不同地市菌株對藥劑的敏感性方差分析。將嘧菌酯對76 株假禾谷鐮孢的EC50平均值設(shè)為1，將各地區(qū)菌株的平均EC50值與之比較，按公式 (3) 計算敏感性指數(shù) (FS)：當(dāng)FS＞ 1時說明該地區(qū)菌株對藥劑敏感性低于河南省平均水平，越大，越不敏感；當(dāng)FS= 1 時說明該地區(qū)菌株對藥劑敏感性居于河南省平均水平；當(dāng)FS＜1 時說明該地區(qū)菌株對藥劑敏感性高于河南省平均水平，越小，越敏感[13]。

式中，AC為各地區(qū)菌株平均EC50值；AT為76 個菌株平均EC50值。

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1.2.4 假禾谷鐮孢孢子萌發(fā)對不同藥劑敏感性的比較 為檢測嘧菌酯與丙硫菌唑、多菌靈、咯菌腈、氰烯菌酯、戊唑醇、吡唑醚菌酯對病菌毒力的敏感性，從76 株假禾谷鐮孢菌株中選取67 株，根據(jù)對孢子萌發(fā)的抑制效果來確定供試殺菌劑對假禾谷鐮孢的毒力，并對其進(jìn)行敏感性比較。

1.2.5 假禾谷鐮孢及禾谷鐮孢菌絲生長對嘧菌酯的敏感性性測定 采用菌絲生長速率法[13]測定6 株禾谷鐮孢及隨機(jī)挑選的6 株假禾谷鐮孢 (PDSYX-2、SQYC-6、LHLY-4、XXWH-2、LYYS-3、XCJA-8) 菌絲生長對嘧菌酯的敏感性。供試菌株培養(yǎng)3 d 后，在菌落邊緣打取直徑為5 mm 的菌餅，轉(zhuǎn)入分別含1、2、4、8、16 和32 μg/mL 嘧菌酯的PSA 平板上，每平板加入100 μg/mL 水楊肟酸以抑制旁路氧化途徑。每個濃度重復(fù)3 次，以不含藥劑的平板為對照。待對照菌落直徑長至80 mm 時，采用十字交叉法測定各藥劑濃度下的菌落直徑，并計算抑制率，利用WPS 11.1 和DPS V9.50 計算藥劑抑制菌絲生長的毒力回歸方程及EC50值。

1.3 嘧菌酯對小麥莖基腐病的防治效果

供試小麥品種為百農(nóng)4 199，供試藥劑為15%嘧菌酯懸浮種衣劑。

1.3.1 嘧菌酯對小麥莖基腐病的離體防效 經(jīng)過預(yù)試驗篩選出致病力較強(qiáng)的LYXA-8 菌株，制成濃度為1 × 105個/mL 的孢子懸浮液。根據(jù)藥劑指導(dǎo)用量設(shè)計試驗，共設(shè)5 個處理，T1：15%嘧菌酯懸浮種衣劑180 g/(100 kg 種子)；T2：15%嘧菌酯懸浮種衣劑220 g/(100 kg 種子)；T3：15%嘧菌酯懸浮種衣劑260 g/(100 kg 種子)；CK0：空白對照(清水)；CK：發(fā)病對照(接種病原菌孢子懸浮液)。稱取5 份各2 g 小麥種子，先用70%乙醇消毒1 min，再用無菌水反復(fù)沖洗3 次，在濾紙上晾干。取3 份小麥以稀釋至不同濃度的15%嘧菌酯懸浮種衣劑拌種，并在濾紙上晾干，另兩份小麥不進(jìn)行拌種，作為清水對照及發(fā)病對照。

采用胚芽鞘接種法[15]，將種子腹溝向下擺入鋪有無菌濕潤濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中，于25 ℃、12 h 光照、12 h 黑暗條件下培養(yǎng)3 d，其間如有發(fā)霉種子及時取出，待胚芽鞘長出2～3 cm、幼葉還未長出時，剪去胚芽鞘的葉尖，在傷口處接種3 μL 孢子懸浮液。培養(yǎng)7 d 后，統(tǒng)計小麥病情指數(shù)。每個處理3 個重復(fù)，試驗重復(fù)2 次。病情分級按Li 等[16]的方法；按公式 (4) 和 (5) 計算病情指數(shù)(DI)和防治效果(P)。

(4)式中：Ni為各級病株數(shù)；i為相應(yīng)的級數(shù)值；Nt為調(diào)查總株數(shù)。

(5)式中：DICK為空白對照病情指數(shù)；DIPT為處理病情指數(shù)。

1.3.2 嘧菌酯對小麥莖基腐病的溫室防效 采用小米擴(kuò)繁法[17]并加以改良。經(jīng)過預(yù)試驗篩選出致病力較強(qiáng)的LYXA-8 菌株，在PDA 平板上活化，5 d 后在菌落邊緣打取直徑為5 mm 的 菌餅，每瓶小米培養(yǎng)基內(nèi)放置7 塊，于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5～7 d，制成小米培養(yǎng)物備用。根據(jù)藥劑指導(dǎo)用量設(shè)計試驗，共設(shè)5 個處理，同1.3.1 節(jié)。

采用溫室盆栽試驗，將小米培養(yǎng)物與無菌土攪拌均勻(小米培養(yǎng)物與無菌土質(zhì)量比為0.75：100)，取200 g 裝入花盆中，將種子腹溝向下擺在盆內(nèi)，每盆7 粒，均勻覆蓋30 g 帶病土壤，于25 ℃、12 h 光照、12 h 黑暗條件下培養(yǎng)21 d 后取出，用清水洗凈根部，放在濾紙上晾干后計算小麥病情指數(shù)。每處理重復(fù)3 次，試驗重復(fù)2 次。病情分級、病情指數(shù)、防治效果及計算公式參考1.3.1 節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 河南省假禾谷鐮孢孢子萌發(fā)對嘧菌酯的敏感性及敏感性基線

測定了2021 年從河南省各地采集分離到的76 株假禾谷鐮孢對嘧菌酯的敏感性。結(jié)果表明：嘧菌酯對76 株假禾谷鐮孢的EC50值分布范圍在0.02～1.54 μg/mL 之間，呈連續(xù)性分布，最大值是最小值的77 倍，平均EC50值為(0.33 ± 0.29) μg/mL(圖1)，敏感性曲線呈單峰曲線分布。經(jīng)數(shù)據(jù)異常值檢驗，LHWY-6 的EC50值1.54 μg/mL 和SQYC-6 的EC50值1.23 μg/mL，M值分別為4.17 和3.10，均大于3，視為異常菌株，其余菌株的M值均在3 以下。嘧菌酯對74 株 (97.37%) 正常菌株的平均EC50值(0.30 ± 0.24) μg/mL 可作為假禾谷鐮孢對嘧菌酯的敏感性基線。

圖1 假禾谷鐮孢對嘧菌酯的敏感性(A)和分布頻率(B)Fig.1 Determination (A) and distribution frequency (B) of the sensitivity of F. pseudograminearum to azoxystrobin

2.2 河南省不同地區(qū)假禾谷鐮孢孢子萌發(fā)對嘧菌酯的敏感性

通過對EC50值的地理區(qū)域分析，同一地區(qū)的假禾谷鐮孢對嘧菌酯的敏感性差異較大，其中許昌市的菌株間敏感性差異最大，EC50值差異倍數(shù)高達(dá)32.50 倍，其次為焦作市，差異倍數(shù)為26.00，洛陽和商丘2 市的菌株，差異倍數(shù)都在20 倍以上；南陽、三門峽和開封3 地的差異倍數(shù)均在2.00 以下，分別為1.26、1.35 和1.92；其他地市差異倍數(shù)均在2.70～26.00 之間。將嘧菌酯對76 株假禾谷鐮孢的平均EC50值0.33 μg/mL 設(shè)為1，將各地區(qū)菌株的均值與之比較，則安陽、濮陽、開封、平頂山、駐馬店和鄭州菌株的敏感性均低于河南省平均水平，漯河和商丘菌株的敏感性均高于河南省平均水平，其余菌株均接近河南省平均水平(表2)。

2.3 假禾谷鐮孢孢子萌發(fā)對6 種殺菌劑與對嘧菌酯敏感性的比較

本研究測定了假禾谷鐮孢孢子萌發(fā)對丙硫菌唑、多菌靈、咯菌腈、氰烯菌酯、吡唑醚菌酯和戊唑醇的敏感性，分別獲得了14、15、5、10、50和27 條毒力回歸方程。6 種殺菌劑對假禾谷鐮孢孢子萌發(fā)的毒力從大到小依次為吡唑醚菌酯 ＞ 咯菌腈 ＞ 丙硫菌唑 ＞ 多菌靈 ＞ 氰烯菌酯 ＞ 戊唑醇，其平均EC50值分別為(0.07 ± 0.04)、(5.42 ±4.78)、(10.81 ± 5.45)、(11.33 ± 10.96)、(12.85 ±12.19)和(132.62 ± 78.58) μg/mL (圖2)，分別是嘧菌酯平均EC50值的0.21、16.42、32.76、34.33、38.94 和401.88 倍。除吡唑醚菌酯對孢子萌發(fā)的毒力較嘧菌酯強(qiáng)外，其余5 種藥劑對孢子萌發(fā)的抑制作用均弱于嘧菌酯。

圖2 假禾谷鐮孢對7 種殺菌劑的敏感性Fig.2 Sensitivity of F. pseudograminearum to 7 fungicides

2.4 禾谷鐮孢孢子萌發(fā)對嘧菌酯的敏感性

本研究從河南省駐馬店確山、汝南和信陽息縣共分離鑒定了6 株禾谷鐮孢。嘧菌酯對這6 株禾谷鐮孢的EC50值在0.10～0.42 μg/mL 之間，最大值是最小值的42 倍，平均EC50值為(0.19 ±0.12) μg/mL。

2.5 假禾谷鐮孢和禾谷鐮孢菌絲生長對嘧菌酯的敏感性

嘧菌酯對6 株假禾谷鐮孢菌絲生長的EC50值為10.76～74.10 μg/mL，對6 株禾谷鐮孢菌絲生長的EC50值為7.16～19.13 μg/mL。嘧菌酯對這兩種鐮孢菌絲生長的EC50值均大于7 μg/mL，說明兩種鐮孢菌絲生長對嘧菌酯的敏感性均較弱。

2.6 嘧菌酯對小麥莖基腐病的防治效果

離體條件下，嘧菌酯對小麥莖基腐病的防效隨著施用劑量的增加而增加：盡管低濃度時有一定防效，但病情指數(shù)與對照相比沒有顯著差異；當(dāng)劑量達(dá)到260 g/(100 kg 種子)時，病情指數(shù)顯著降低，防治效果最高 (表3)。

溫室試驗中，嘧菌酯各處理的病情指數(shù)均低于對照，其中施用劑量為220 g/(100 kg 種子)時達(dá)顯著水平；低濃度時對病害的防治效果不明顯，但防效并未隨著藥劑施用劑量的增加而變大，其中220 和260 g/(100 kg 種子)劑量下的防效接近，均在50%左右，220 g/(100 kg 種子)劑量下的防效最高(表3)。

表3 嘧菌酯對小麥莖基腐病的防治效果Table 3 Control efficacy of azoxystrobin against wheat crown rot in vitro and in greenhouse

3 討論與結(jié)論

小麥莖基腐病近年來已在河南各地被發(fā)現(xiàn)，其中河南北部地區(qū)多為假禾谷鐮孢[18]，這些區(qū)域多為溫暖干旱的氣候，這與美國小麥莖基腐的分布規(guī)律相似[19]。隨著近些年來保護(hù)性耕作政策的實施，秸稈大量還田，導(dǎo)致土壤中病原菌含量提高，小麥莖基腐病等土傳病害發(fā)生日趨嚴(yán)重，從而影響小麥產(chǎn)量[20-21]。本研究中的小麥莖基腐病病原菌為禾谷鐮孢和假禾谷鐮孢，這兩種病原菌均產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素(DON)，此種真菌毒素可污染小麥籽粒，一旦被人畜誤食，很容易引起中毒[22-23]。本研究所建立的假禾谷鐮孢對嘧菌酯的敏感性基線約為已報導(dǎo)的假禾谷鐮孢對醚菌酯敏感性基線的20 倍[13]。究其原因：一方面是由于藥劑活性不同造成的，另一方面也可能是由于測試菌株數(shù)的差異造成。本研究所用菌株為2021年采自河南省17 個縣市的76 株，而王莉莉等[13]測定假禾谷鐮孢對醚菌酯敏感性時所用菌株為2019年采自河南省的13 個縣市的50 個菌株。通常不同病原菌對殺菌劑的敏感性具有地理時空尺度差異性[24]，本研究結(jié)論證實了此觀點。

嘧菌酯尚未登記用于小麥莖基腐病防治，本研究中僅有2 株 (2.63%) 菌株在數(shù)據(jù)異常值分析中顯示異常，這是否是由于地理差異或天然耐藥個體的存在所導(dǎo)致，還需要進(jìn)一步的研究。嘧菌酯作為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，具有殺菌譜廣的特點，對3 種主要的植物病原真菌(子囊菌、擔(dān)子菌和卵菌)都具有抑菌活性，因此通過建立敏感性基線，從而監(jiān)測其敏感性變化具有重要意義。根據(jù)FRAC 的報道，嘧菌酯在真菌物種中已發(fā)生抗藥性，其抗性的發(fā)生與cyt b的點突變(G143A、F129L)有關(guān)，其他機(jī)制也可能參與抗藥性；而且嘧菌酯產(chǎn)生抗性后與其他QoIs 類藥劑有交互抗性[7]，因此生產(chǎn)中應(yīng)用嘧菌酯防治小麥莖基腐病時，除了定期進(jìn)行敏感性監(jiān)測，了解病菌敏感性的變化動態(tài)外，還應(yīng)盡量選用復(fù)配劑或與其他藥劑輪換應(yīng)用，以延緩病菌抗藥性的發(fā)展。

小麥莖基腐病現(xiàn)已在黃海華麥區(qū)普遍發(fā)生。本研究僅測定了河南省假禾谷鐮孢對嘧菌酯的敏感性，而沒有涉及河北、山東、安徽等省份的菌株。本研究所建立的敏感性基線，對其他省份菌株是否適用，尚需做進(jìn)一步的研究。

本研究使用15%嘧菌酯懸浮種衣劑測定對小麥莖基腐病的離體和溫室防效，在嘧菌酯濃度為220 g/ (100 kg 種子) 時達(dá)到了49%以上的防治效果。在生產(chǎn)中應(yīng)用時，為了防治苗期病害可使用懸浮種衣劑。由于懸浮種衣劑持效期短，隨時間推移防效下降，可在小麥返青拔節(jié)期再噴施一次嘧菌酯懸浮劑，以增強(qiáng)對病害的持續(xù)控制。