小麥莖基腐病抗性QTL的分析

周淼平,張 鵬,楊學(xué)明,陳 達(dá),姚金保

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，江蘇南京 210014)

小麥莖基腐病(wheat crown rot,WCR)，又稱(chēng)鐮刀莖基腐病(Fusarium crown rot)，是發(fā)生在干旱和半干旱地區(qū)的世界性小麥病害，該病害在澳大利亞、新西蘭、南美洲、美國(guó)西北部太平洋沿岸、加拿大、意大利、北非、中東和中國(guó)均有發(fā)生[1]。在澳大利亞該病害主要由假禾谷鐮刀菌(Fusariumpseudograminearum)引起[2]，在中國(guó)主要由禾谷鐮刀菌(F.graminearum)和亞洲鐮刀菌(F.asiaticum)引起，但近幾年假禾谷鐮刀菌呈上升趨勢(shì)[3]。病原菌首先侵染小麥的莖基部，在苗期莖基部葉鞘和莖稈出現(xiàn)褐變，嚴(yán)重時(shí)引起根部褐變腐爛，造成死苗。后期隨著小麥的生長(zhǎng)，病原菌沿莖稈向上擴(kuò)展，使小麥多個(gè)節(jié)和節(jié)間出現(xiàn)褐變，嚴(yán)重時(shí)造成枯白穗，從而導(dǎo)致小麥減產(chǎn)。感染莖基腐病的小麥籽粒中還可能殘留DON等毒素[4]，影響小麥的食用、飼用和種用價(jià)值。由于該病害的流行，在澳大利亞，小麥和大麥每年的損失超過(guò)9 700萬(wàn)澳元[2]；美國(guó)西北部太平洋沿岸發(fā)病嚴(yán)重田塊，產(chǎn)量損失可達(dá)35%[5]。近年來(lái)，由于常年實(shí)施秸稈還田，造成土壤中菌源積累，我國(guó)河北中南部、山西南部、陜西中東部、河南和山東大部、江蘇和安徽北部的小麥莖基腐病有加重趨勢(shì)，河南沁陽(yáng)以及江蘇沿海部分田塊小麥損失高達(dá)30%以上[3,6]。

目前對(duì)小麥莖基腐病的防治主要采用農(nóng)業(yè)措施與藥劑防治相結(jié)合的方法，不僅增加農(nóng)業(yè)成本，而且污染環(huán)境，不利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展，因此，種植抗病品種無(wú)疑是防治小麥莖基腐病最經(jīng)濟(jì)和有效的途徑?？共∑贩N的培育需要抗性穩(wěn)定的抗源用于雜交配組以及明確的抗性機(jī)理指導(dǎo)育種，國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)小麥莖基腐病的抗性鑒定方法、抗源的篩選以及抗性機(jī)理的解析方面已經(jīng)取得了一些研究成果。前人采用病麥粒接種、菌液直接浸泡接種等方法先后建立了田間成株期以及室內(nèi)苗期的抗性鑒定方法；并運(yùn)用這些鑒定方法對(duì)3 400余份常規(guī)小麥、硬粒小麥、小黑麥和野生小麥進(jìn)行了莖基腐病的抗性篩選，篩選到2-49、Sunco、CI12633等一批中抗材料，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)免疫和高抗材料[2,7-10]。遺傳分析表明，小麥對(duì)莖基腐病的抗性是一個(gè)數(shù)量性狀[11-19]。Wallwork等[11]首先在Kukri的4B染色體上發(fā)現(xiàn)抗性主效QTL，隨后科研工作者分別對(duì)莖基腐病抗源2-49[12-14]、W21MMT70[13,15]、CSCR6[16]、Sunco[13-14]、Ernie[17]、Maco[18]、Otis[18]、IRN497[14]、CPI133814[14]和EGA Wylie[19]的抗性QTL也進(jìn)行了定位，發(fā)現(xiàn)這些QTL分布在小麥的13條染色體上，其中3BL和4B染色體上存在抗性主效QTL，最高可分別解釋48.8%[16]和48.0%[11]的表型抗性。Erginbas-Orakci等[20]采用自然群體和DArT標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，在3B和2D染色體上也發(fā)現(xiàn)抗莖基腐病QTL。通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇，可以將主效QTL和微效QTL進(jìn)行聚合，從而提高小麥對(duì)莖基腐病的抗性，有效降低小麥莖基腐病的危害，如Bovill等[13]將2-49的1D染色體抗性QTL與W21MMT70的3B染色體抗性QTL 聚合后，發(fā)現(xiàn)聚合植株莖基腐病嚴(yán)重度比不含抗性QTL的植株降低51.2%。

已經(jīng)報(bào)道的小麥莖基腐病QTL定位研究多采用SSR等分子標(biāo)記來(lái)構(gòu)建遺傳連鎖圖，這些標(biāo)記多態(tài)性差且數(shù)量有限，影響遺傳連鎖圖的基因組覆蓋度，從而降低了小麥莖基腐病抗性QTL的檢出效率以及QTL定位的精度。近幾年，隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展以及小麥基因組的拼接完成，開(kāi)發(fā)大量的適合高通量檢測(cè)的SNP標(biāo)記成為可能并得到廣泛使用，也為小麥莖基腐病抗性QTL的精確定位提供了方便。Yang等[21]利用660K SNP芯片，采用GWAS(genome-wide association studies)方法對(duì)234個(gè)黃淮麥區(qū)小麥品種進(jìn)行分析，在6A染色體上發(fā)現(xiàn)小麥莖基腐病抗性QTL。采用同樣方法，Jin等[22]利用55K SNP芯片對(duì)358個(gè)小麥品種(系)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，在5DL 染色體上發(fā)現(xiàn)莖基腐病抗性QTL。

本研究采用中抗莖基腐病品種CI12633與感莖基腐病品種揚(yáng)麥158構(gòu)建重組自交系群體，用二代測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)SNP標(biāo)記，結(jié)合已有的SSR基因型資料以及群體莖基腐病抗性鑒定結(jié)果，以期獲得莖基腐病抗性QTL位點(diǎn)，為今后開(kāi)展抗莖基腐病小麥的分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

CI12633品種是提莫菲維小麥(FriticumtimopheeviiZhuk.)的六倍體衍生系，我國(guó)作為白粉病抗源引進(jìn)，研究發(fā)現(xiàn)該品種不僅含有多個(gè)抗白粉病基因，而且抗小麥黃花葉病，中抗小麥莖基腐病和小麥紋枯病。揚(yáng)麥158為江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所培育的品種，曾在長(zhǎng)江中下游地區(qū)大面積種植，是綜合抗性好的廣適性品種，中抗小麥白粉病和小麥赤霉病，但感小麥莖基腐病。

以揚(yáng)麥158為母本，CI12633為父本，配制雜交，采用單粒傳的方法培育重組自交系群體，該群體含有198個(gè)家系，本研究對(duì)其中94個(gè)家系進(jìn)行了基因型分析和莖基腐病抗性鑒定。

1.2 遺傳連鎖圖的構(gòu)建

通過(guò)二代測(cè)序方法開(kāi)發(fā)該重組自交系群體的SNP標(biāo)記，結(jié)合已有的群體多態(tài)性SSR標(biāo)記，采用JoinMap 4.0軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖。SNP標(biāo)記的開(kāi)發(fā)以及遺傳連鎖圖的構(gòu)建見(jiàn)周淼平等[23]的方法，該遺傳圖譜總遺傳距離為2 510.7 cM，包含31個(gè)連鎖群，含有3 355個(gè)分子標(biāo)記，通過(guò)已有的SSR和小麥基因組信息，可以將所有連鎖群分配至相應(yīng)的染色體。

1.3 重組自交系群體的莖基腐病抗性鑒定

群體莖腐病的抗性鑒定在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，鑒定方法參照Liu等[24]的方法并略作修改，小麥種子經(jīng)70%乙醇消毒2 min后，用無(wú)菌水沖洗3～4次，置于墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中催芽，待芽長(zhǎng)為5 mm左右時(shí)，在禾谷鐮刀菌孢子懸浮液(含1×106個(gè)孢子·mL-1)中接種1～2 min，接種后的種子呈直線(xiàn)均勻排列在滅過(guò)菌的濕潤(rùn)紙巾(24×24 cm)上，芽的生長(zhǎng)方向一致且均指向紙巾邊緣(種子距紙巾邊緣2 cm左右)，將紙巾沿種子排列方向，從一端向另一端卷起，芽的生長(zhǎng)方向向上置于塑料容器中，22 ℃、90%濕度培養(yǎng)14～16 d，調(diào)查莖腐病發(fā)病情況。

根據(jù)病害嚴(yán)重度將莖腐病病級(jí)分為0～5級(jí)：0級(jí)為葉鞘無(wú)病癥；1級(jí)為第一葉鞘病斑長(zhǎng)度小于1.0 cm；2級(jí)為第一葉鞘病斑長(zhǎng)度在1.0～2.0 cm之間；3級(jí)為第一葉鞘病斑長(zhǎng)度大于2.0 cm，幼苗未萎焉；4級(jí)為幼苗出現(xiàn)萎焉病癥；5級(jí)為幼苗死亡。

群體的每個(gè)家系調(diào)查10～15株幼苗，計(jì)算平均病級(jí)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2次，2次重復(fù)的平均病級(jí)用于數(shù)據(jù)分析和QTL定位。莖基腐抗性鑒定進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)試驗(yàn)，分別稱(chēng)為E1、E2和E3。

1.4 數(shù)據(jù)分析和QTL定位

采用R軟件計(jì)算重組自交系群體和親本莖基腐病抗性鑒定的數(shù)據(jù)平均值、頻率分布、試驗(yàn)間相關(guān)性和方差。采用MapQTL 5.0軟件進(jìn)行QTL分析，首先進(jìn)行QTL區(qū)間作圖法(interval mapping)進(jìn)行初步定位，然后采用復(fù)合QTL作圖法(MQM mapping)進(jìn)一步詳細(xì)分析，根據(jù)置換檢測(cè)(permutation test)推薦的LOD值判定是否存在QTL。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體莖基腐病抗性的鑒定結(jié)果

從表1可以看出，3次試驗(yàn)抗病親本CI12633和感病親本揚(yáng)麥158之間的病級(jí)差異極顯著，群體家系存在超親分離現(xiàn)象，群體病級(jí)分布基本呈正態(tài)分布，表明小麥對(duì)莖基腐病的抗性是由多基因控制的數(shù)量性狀(表1，圖1)。

圖1 群體莖基腐病病級(jí)分布

表1 供試小麥群體及其親本的莖基腐病抗性鑒定結(jié)果(病級(jí))Table 1 Identification result(disease grade) of WCR resistance in the population and their parents

群體的3次抗性鑒定試驗(yàn)結(jié)果相關(guān)性很高，E1與E2、E2與E3、E1與E3的相關(guān)系數(shù)分別為0.8、0.8和0.6，表明在控溫控濕的人工條件下，群體各家系的莖基腐病的抗性在不同試驗(yàn)基本表現(xiàn)一致。方差分析結(jié)果(表2)顯示，各家系間的莖基腐病抗性差異均達(dá)極顯著水平，進(jìn)一步驗(yàn)證群體各家系對(duì)莖基腐病的抗性有很大差異。

表2 試驗(yàn)的方差分析Table 2 ANOVA of the experiments

2.2 群體莖基腐病抗性QTL的定位結(jié)果

結(jié)合群體基因型資料和莖基腐病抗性鑒定資料，采用MapQTL 5.0分析軟件，分別在1D、2B、3B(2)、7A和7D染色體上定位到6個(gè)莖基腐病抗性QTL(圖2和表3)，其中1D和3B染色體上的抗性QTL來(lái)自抗病親本CI12633，2B、7A和7D染色體上的抗性QTL來(lái)自感病親本揚(yáng)麥158，單個(gè)QTL的表型解釋率在9.2%～14.6%之間。1D、2B和3B(與Chr3B_479785994緊密連鎖)染色體上的抗性QTL在3次試驗(yàn)中均能檢測(cè)到，表明這些抗性QTL比較穩(wěn)定，受環(huán)境影響較小，是小麥抗莖基腐病的主效QTL。3B染色體上位于Xgwm181.1-Xgwm340間的QTL和7A染色體上位于Xwmc388-Xgwm635間的QTL只在E1試驗(yàn)中檢測(cè)到；7D染色體上位于Xgwm37-Xcfa2040間的QTL只在E3試驗(yàn)中檢測(cè)到，表明這些抗性QTL可能受環(huán)境影響較大，只在特定條件下發(fā)揮作用。

表3 小麥莖基腐病抗性QTLsTable 3 QTLs for WCR resistance

下劃線(xiàn)表示分子標(biāo)記所在位置。

3 討 論

3.1 小麥莖基腐病抗性QTL位置比較

澳大利亞莖基腐病的危害較重，因而對(duì)小麥莖基腐病的研究較為重視，先后篩選獲得了Kukri[11]、2-49[12-14]、Sunco[13-14]、W21MMT70[13，15]、Ernie[17]、CSCR6[16]、EGA Wylie[19]等中抗莖基腐病材料，對(duì)這些材料的莖基腐病抗性QTL進(jìn)行了定位，在3B染色體長(zhǎng)臂發(fā)現(xiàn)了抗性主效QTL，該QTL最高可解釋48.8%的表型變異[16]。本研究在3B染色體上檢測(cè)到2個(gè)莖基腐病抗性QTL，通過(guò)小麥物理圖譜比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與Chr3B_479785994緊密連鎖的QTL與上述文獻(xiàn)報(bào)道的QTL位置接近，可能為同一QTL；另一QTL位于3B染色體長(zhǎng)臂的末端，Poole等[18]也曾在3B染色體長(zhǎng)臂Xgwm299-Xgwm181區(qū)間檢測(cè)到抗病QTL，與本研究發(fā)現(xiàn)的QTL位置接近，但兩者有沒(méi)有關(guān)聯(lián)，目前尚不清楚。本研究在1D染色體上檢測(cè)到的莖基腐病抗性QTL與Chr1D_416032418緊密連鎖，通過(guò)小麥物理圖譜比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與2-49[12-14]1D染色體上檢測(cè)到的QTL位置較為接近，可能為同一QTL。本研究在2B染色體上檢測(cè)到與Chr2B-518870327緊密連鎖的QTL，通過(guò)小麥物理圖譜比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與Mendos[15]、Sunco[13-14]和Janz[14]中檢測(cè)到的QTL位置接近，可能為相同抗莖基腐病抗性QTL。本研究在7A和7D染色體上檢測(cè)到的抗性QTL，與已報(bào)道相應(yīng)染色體的QTL位置不一致，可能為新發(fā)現(xiàn)的莖基腐病抗性QTL。

3.2 影響小麥莖基腐病抗性QTL定位的主要因素

小麥莖基腐病抗性的鑒定受環(huán)境因素影響較大，在田間，氣候條件、小麥生長(zhǎng)狀況以及小麥紋枯病、小麥根腐病、小麥全蝕病等根部和莖基部病害都會(huì)干擾小麥莖基腐病的發(fā)生和發(fā)展，進(jìn)而影響抗病QTL的檢出效率。從已經(jīng)報(bào)道的莖基腐病抗性QTL表型解釋率也進(jìn)一步驗(yàn)證了這一點(diǎn)。Collard等[12]報(bào)道，全部QTL只能解釋 40.6%的表型變異；Bovill等[15]報(bào)道，檢測(cè)到的3個(gè)QTL也只能解釋44.4%的表型變異，這些研究結(jié)果說(shuō)明，由于環(huán)境因素和遺傳連鎖圖基因組覆蓋度不足的影響，仍有不少Q(mào)TL未能檢出。本研究在室內(nèi)控溫控濕的條件下進(jìn)行了莖基腐病抗性鑒定，有效減少了由于溫度、濕度等環(huán)境條件以及其他根部和莖基部病害的影響。另外，采用二代測(cè)序方法開(kāi)發(fā)SNP標(biāo)記，構(gòu)建高密度群體遺傳連鎖圖，加大對(duì)小麥基因組的覆蓋度，使得檢出的莖基腐病抗性QTL數(shù)目較以往研究有所改善，定位精度大幅提高，并且小麥基因組已經(jīng)測(cè)序組裝并發(fā)布，SNP標(biāo)記的使用更利于已檢出莖基腐病抗性QTL間的比較分析以及候選抗病基因的克隆。

本研究雖然通過(guò)控制環(huán)境因素以及提高遺傳連鎖圖質(zhì)量來(lái)提高抗病QTL的檢出效率，但每次試驗(yàn)檢出的QTL只能解釋表型變異的40%左右，仍然有不少抗病QTL未能檢出，主要原因是進(jìn)行群體分析的家系數(shù)偏少，只有94個(gè)，所以，今后的研究需加大群體的家系數(shù)目，改良小麥莖基腐病的鑒定方法，進(jìn)一步提高抗病QTL的檢出效率。

4 結(jié) 論

采用高密度SNP遺傳連鎖圖結(jié)合群體小麥莖基腐病抗性鑒定資料，在1D、2B、3B(2)、7A和7D染色體上檢測(cè)到6個(gè)莖基腐病抗性QTL，單個(gè)QTL可解釋9.2%～14.6%的表型變異；其中1D和3B染色體的抗性QTL來(lái)自CI12633，2B、7A和7D染色體的抗性QTL來(lái)自揚(yáng)麥158；1D、2B和3B(與Chr3B_479785994緊密連鎖)染色體上的抗性QTL為穩(wěn)定的莖基腐病抗性QTL。